Name: Production densembles moteurs dadn et de kinésine sur des nanostructures dorigami dADN pour lobservation dune seule molécule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez la formation d'ensembles moteurs de dyneine et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation de molécules uniques. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de transport cellulaire.

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Nous remercions K. Chau, J. Morgan et A. Driller-Colangelo d'avoir contribué aux techniques du châssis d'origami d'ADN segmenté. Nous remercions également les anciens membres des laboratoires Reck-Peterson et Shih pour les discussions utiles et les contributions au développement original de ces techniques. Nous remercions J. Wopereis et le Smith College Center for Microscopy and Imaging et L. Bierwert et le Smith College Center for Molecular Biology. Nous remercions le programme d'IRM NSF pour l'acquisition d'un microscope TIRF.

<ol><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li>
<li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li>
<li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle%3A+Stepping+Toward+a+Consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li>
<li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li>
<li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+cargo+transport%3A+moving+beyond+tug+of+war%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li>
<li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li>
<li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li>
<li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li>
<li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li>
<li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li>
<li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li>
<li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li>
<li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li>
<li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641(2014).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
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<li>Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRao%2C+L+%22Single+Molecule+Analysis.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology</a>. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).</li>
<li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li>
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<li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li>
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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les techniques de construction moléculaire de l'origami d'ADN fournissent une manière unique de construire des ensembles de moteur avec des architectures définies, des nombres de moteur, et des types, permettant des études de la façon dont le comportement émergent provient des configurations spécifiques de moteur31. Alors que les études structurelles et cellulaires continuent d'élucider des exemples de moteurs cytosquelettiques travaillant en équipe, les techniques d'isoler et d'étudier les mécani...

La dyneine et la kinésie sont des protéines motrices cytosquelettiques responsables d'une myriade de fonctions dans les cellules eucaryotes1. En convertissant l'énergie chimique de l'hydrolyse ATP en travail productif, ces moteurs se translocalisent sur des microtubules pour transporter et distribuer diverses cargaisons intracellulaires. Ils coordonnent également dans les réarrangements intracellulaires massifs liés à la mitose, où ils montrent des forces orchestrées qui contribuent au positionnement et à la séparation des chromosomes. Les essais structurels, biochimiques et biophysiques, y compris les observations d'une seule molécule, ont révélé les mécanismes de ces moteurs au niveau individuel (bien examinés dans les travaux précédents2,3,4). Cependant, beaucoup de tâches des moteurs exigent qu'ils travaillent dans de petits ensembles de types de moteurs similaires et mixtes. Comparativement moins est compris sur les mécanismes qui coordonnent l'activité et la motilité émergente ultime de ces ensembles5,6. Cette lacune de connaissances est due, en partie, à la difficulté de créer des ensembles avec des caractéristiques contrôlables, telles que le type de moteur et le numéro de copie. Au cours de la dernière décennie, les techniques de construction moléculaire de l'origami d'ADN ont été employées pour résoudre ce problème. Pour les moteurs à base de microtubules, quelques exemples de ces études incluent des observations de molécules uniques d'ensembles de dyneine cytoplasmique-17,8,9, dynein intraflagellar11, divers moteurs kinesin12,13, et des mélanges de dyneins et kinesins7,14,15. Ici, nous fournissons des détails de la purification et l'étiquetage oligonucléotide des moteurs de levure7,16,17,18,19,20, le le pliage et la purification de l'origami d'ADN segmenté avec la conformité réglable8,et l'imagerie des moteurs de levure propulsant les structures de châssis7,18.
La construction d'ensembles moteurs pour l'observation in vitro d'une seule molécule nécessite trois efforts primaires. La première est l'expression, la purification et l'étiquetage des constructions motrices adaptées à l'attachement à l'origami d'ADN. La seconde est la production et la purification de structures d'origami d'ADN définies (souvent appelées « châssis »). Et le troisième est la conjugaison des moteurs à la structure du châssis suivie d'une observation à l'aide d'une microscopie interne totale par fluorescence de réflexion (TIRF). Ici, nous fournissons des protocoles établis pour ce processus pour les moteurs recombinants à base de microtubule purifiés à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. Des ensembles moteurs à base d'origami d'ADN ont été étudiés à l'aide de la kinésie recombinante15 et de la dyneine7,8,18 constructions produites dans ce système d'expression de levure16 ,17,18,19. Ce protocole est valable pour ces constructions, étant donné qu'elles sont contrôlées par le promoteur induit par le galactose, et fusionnées aux mêmes étiquettes protéiques pour la purification (lien de protéase ZZ et TEV) et pour la conjugaison d'oligo d'ADN (SNAPtag).
Des souches de levure spécifiques produisent des constructions motrices spécifiques. Par exemple, la dyneine utilisée pour étudier le rôle de la conformité au fret a été purifiée à partir de la souche RPY10847,8. En général, les souches contenant des constructions motrices avec les modifications génétiques appropriées pour l'expression et la purification peuvent être demandées aux laboratoires ayant publié l'utilisation de ces moteurs. Les constructions avec de nouveaux attributs tels que des mutations ou des étiquettes peuvent être faites en utilisant des techniques génétiques recombinantes, telles que la transformation de l'acétate de lithium21 et des kits commerciaux. Des protocoles détaillés pour la création de protéines motrices modifiées dans la levure pour des études sur une seule molécule ont été publiés19. En plus des moteurs fusionnés au SNAPtag, les oligos utilisés pour étiqueter les moteurs doivent être conjugués au substrat SNAP, benzylguanine (BG); protocoles précédemment publiés décrivent la formation et la purification des conjugués BG-oligo18. La stratégie globale décrite ici a également été utilisée pour les moteurs à base d'actine (voir les travaux précédents pour des exemples22,23,24), et les moteurs purifiés à partir d'autres organismes et systèmes d'expression (voir les précédents travaux pour des exemples7,9,10,11,12,13,14).
Les microtubules polymérisés (MT) sont utilisés dans ces expériences dans deux procédures différentes. La purification d'affinité de MT des moteurs fonctionnels exige des MT qui ne sont pas étiquetés avec d'autres groupes fonctionnels, alors que l'analyse de motilité de motilité de moteur DEF exige des MTs étiquetés avec la biotine et les fluorophores. Dans tous les cas, les TM sont stabilisés avec le taxol pour prévenir la dénaturation. L'étape de purification d'affinité MT est utilisée pour enlever tous les moteurs non-motiles avec une forte affinité MT, car ces moteurs peuvent modifier la motilité d'ensemble si conjugué à un châssis. Pendant ce processus, les moteurs actifs délient les MT et restent en solution, tandis que les moteurs serrés se déversent dans le granule MT. Cela permet de s'assurer que tous les moteurs sur le châssis sont d'une population active.
Une variété de structures d'origami d'ADN ont été employées pour étudier des ensembles cytosquelettiques de moteur. Au fur et à mesure que la compréhension mécaniste du transport d'ensemble s'est accrue, les structures d'origami d'ADN utilisées dans les expériences se sont développées en complexité. En principe, toute structure pourrait être adaptée à cette fin à condition qu'elle soit modifiée pour inclure des sites d'attachement à l'ADN à brin unique pour les moteurs et les fluorophores. Des conceptions et des attributs spécifiques de châssis peuvent être utiles pour sonder des questions particulières sur le comportement émergent des ensembles de moteurs. Par exemple, des tiges rigides ont été utilisées pour développer des connaissances de base sur la façon dont le numéro de copie affecte le transport par des équipes de dyneins et de kinésies7,15,18, et des plates-formes 2D ont été utilisées pour étudier l'ensemble de myosine navigation des réseaux d'actine22. Des structures à la flexibilité variable ou réglable ont été utilisées pour comprendre les rôles du couplage élastique entre les moteurs et pour sonder comment la synchronisation des pas affecte la motilité8,24. Plus récemment, des structures sphériques sont utilisées pour mieux comprendre comment les contraintes géométriques de la liaison de la voie motrice affectent la dynamique de la motilité25.
Dans ce protocole, nous proposons des étapes spécifiques pour des expériences d'ensemble sur châssis segmenté avec rigidité variable. Les sites de liaison sur le châssis sont parfois appelés « poignées », tandis que les séquences d'ADN complémentaires qui lient ces poignées sont appelées « antihandles ». Le nombre de moteurs sur ces châssis est déterminé par les segments qui contiennent des agrafes de poignée étendues avec complémentarité à l'oligo antihandle sur les moteurs liquéfonnés oligo. L'utilisation de différentes séquences de poignée sur différents segments permet de lier différents types de moteurs à des endroits spécifiques sur le châssis. Le châssis détaillé ici est composé de 7 segments rigides séquentiels, chacun composé de 12 hélices d'ADN à double brin disposées en 2 anneaux concentriques8. Les segments rigides contiennent les poignées motrices et sont reliés à travers des régions qui peuvent être soit flexibles à l'ADN à brin unique, soit de l'ADN rigide à double brin, selon l'absence ou la présence, respectivement, d'agrafes de « liaison ». La conformité de la structure du châssis est donc déterminée par la présence ou l'absence de ces agrafes "linker". Voir les rapports précédents pour plus de détails et des séquences d'ADN spécifiques8. En outre, plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour purifier châssis26. La méthode de centrifugation de gradient de gradient de glycérol de taux-zonal27 est décrite ici.

<table><tbody><tr><td>Tube à fond rond de 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Protéine de tubuline marquée à la biotine : cerveau porcin, pur à >99 %</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>T333P-A</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-BSA</td><td>Sigma</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de bouteille, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td> Bouteille <td>de 356013</td><td></td><td>Beckman Coulter</td></tr><tr><td>, avec bouchon, Polycarbonate, 10,4 mL, 16 x 76 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355603</td><td></td></tr><tr><td>unité de filtration centrifuge</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 à débit rapide, 10 mL</td> Colonnes de chromatographie <td>GE Healthcare</td><td>17096901</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin, vides</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204EDU</td><td></td></tr><tr><td>P8064 Échafaudage</td><td>Tilibit</td><td>2 mL à 400nM</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Colonnes de chromatographie</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>ProTev Protéase</td><td>Promega</td><td>V6101</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Double Sided Tape avec distributeur</td><td>amazon.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-500 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17061310</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>434302</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA stain</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protéine de tubuline (pure à >99 %) : cerveau porcin</td><td>Cytoskeleton.com</td> tubuline <td>T240-B</td><td></td></tr><tr><td>, HiLyte 647</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>TL670M-A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger ultra-clairs</td><td>Beckman Coulter</td><td>344090</td><td></td></tr></tbody></table>

production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'adn pour l'observation d'une seule molécule

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Les moteurs cytosquelettiques sont responsables d'une grande variété de fonctions dans les cellules eucaryotes, y compris la mitose, le transport de marchandises, la motilité cellulaire, et d'autres. Bon nombre de ces fonctions exigent que les moteurs fonctionnent en ensembles. Malgré une riche connaissance des mécanismes des moteurs cytosquelettiques individuels, on en sait relativement moins sur les mécanismes et les comportements émergents des ensembles moteurs, dont des exemples incluent des changements dans la processivité et la vitesse d'ensemble avec changement de numéro, d'emplacement et de configuration du moteur. La nanotechnologie de l'ADN structurel, et la technique spécifique de l'origami d'ADN, permet la construction moléculaire d'architectures bien définies d'ensembles moteurs. La forme des structures de chargement ainsi que le type, le nombre et le placement des moteurs sur la structure peuvent tous être contrôlés. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour produire ces ensembles et les observer à l'aide de la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion. Bien que ces techniques aient été spécifiquement appliquées pour les moteurs cytosquelettiques, les méthodes sont généralisables à d'autres protéines qui s'assemblent dans des complexes pour accomplir leurs tâches. Dans l'ensemble, la méthode de l'origami d'ADN pour créer des ensembles bien définis de protéines motrices fournit un outil puissant pour disséquer les mécanismes qui mènent à un comportement motile émergent.

Les purifications réussies des moteurs et des structures de châssis ont été astoyfées par l'électrophorèse de gel. L'analyse SDS-PAGE a confirmé le succès de l'extraction de la dyneine à partir de levure (Figure 2), car le filtrate final recueilli à l'étape 2.3.7 montrait une bande claire et nette à la position de 350 kDa. Comme prévu, cette bande de dynein eétait absente du débit et du lavage qui enlevaient les protéines indésirables, et les perles à partir ...

L'objectif de ce protocole est de former des ensembles de moteurs moléculaires sur les nanostructures d'origami d'ADN et d'observer la motilité d'ensemble en utilisant la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion.

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Notre protocole est conçu pour sonder les mécanismes biophysiques régissant le transport de marchandises par des équipes de protéines motrices cytosquelettiques identiques ou dirigées de manière opposée. En utilisant l’origami d’ADN pour la construction moléculaire, cette méthode peut choisir pour le type, le nombre, et l’emplacement des moteurs sur les formes précises définies de cargaison. Bien que ce protocole se concentre sur les moteurs à base de microtubules dynein et kinésine, il est adaptable à la myosine moteur à base d’actine, ainsi qu’à d’autres systèmes protéiques qui fonctionnent en coopération.Un aspect difficile de ce protocole est de maintenir l’intégrité et l’activité des protéines motrices tout au long du processus de purification, car elles sont sensibles à la chaleur et à la force mécanique. Pour induire la croissance et l’expression des protéines motrices par l’intermédiaire du promoteur de galactose, utilisez une baguette d’inoculation stérile pour stries de la souche de levure congelée d’intérêt sur une plaque de culture levure-peptone-dextrose pour une incubation de trois à quatre jours à 30 degrés Celsius. Le quatrième jour de la culture, lorsque la densité

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Cette vidéo décrit une méthode permettant de visualiser l’assemblage de condensats de protéines de fusion sur des molécules d’ADN à des loci spécifiques à l’aide de l’imagerie à molécule unique. Ces condensats sont formés en raison d’interactions LCD-LCD et LCD-DBD, qui permettent le recrutement de l’ARN polymérase II et l’amélioration de la transcription des gènes.

Imagerie d’une seule molécule pour visualiser l’assemblage de condensats de protéines de fusion sur des rideaux d’ADN

ADN origami est une puissante méthode pour fabriquer des objets nanométriques précis en programmant l'auto-assemblage de molécules d'ADN. Ici, nous décrivons comment l'ADN origami peut être utilisé pour concevoir un robot robotique capable de détecter des signaux biologiques et répondre par changement de forme, puis relayés à un effet désiré.

Conception d&#39;un robot Bio-sensible de l&#39;ADN origami

L’origami d’ADN est une méthode puissante pour fabriquer des objets précis à l’échelle nanométrique en programmant l’auto-assemblage de molécules d’ADN. Nous décrivons ici un protocole pour le pliage d’un robot bio-réactif à partir d’origami d’ADN, sa purification et sa coloration négative pour l’imagerie au microscope électronique à transmission (MET).

Pliant et caractérisation d&#39;un Robot Bio-sensible de l&#39;ADN Origami

Nous décrivons ici l'instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d'ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

Les auteurs décrivent le protocole détaillé de conception, simulation, expériences de wet-lab et l’analyse pour un carré d’accordéon d’ADN reconfigurable de 6 par 6 mailles.

Conception et synthèse d’un support accordéon ADN reconfigurables

Cet article présente un protocole détaillé pour ligature de T4 et de la dénaturation PAGE purification de petites molécules d’ADN circulaires, recuit et gel natif analyse de pages de tuiles circulaires, le montage et l’imagerie AFM de nanostructures ADN 1D et 2D, ainsi que d’agarose électrophorèse et centrifugation purification des nanostructures d’ADN finie.

Motifs d’ADN stable, 1D et 2D Nanostructures construit à partir de molécules d’ADN circulaire petit

Nous présentons un protocole pour construire des navettes moléculaires, où les protéines motrices kinésine adhère à la surface de propulsent marqué au colorant de microtubules. Les interactions faibles des kinésines avec la surface permet leur fixation réversible pour elle. Cela crée un système d’échelle nanométrique qui présente l’assembly dynamique et le démontage de ses composants tout en conservant sa fonctionnalité.

Assemblage des navettes moléculaires propulsés par réversiblement attaché kinésines

Ici, nous décrivons un protocole pour créer des nanostructures inorganiques discrètes et précises sur des substrats utilisant des formes d'origami d'ADN comme modèles de guidage. La méthode est démontrée par la création d'antennes en forme de noeud papillon en or plasmonique sur un substrat transparent (saphir).

ADN Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

La kinésine mitotique bidirectionnelle-5 Cin8 s’accumule en grappes qui se divisent et fusionnent au cours de leur motilité. L’accumulation en amas modifie également la vitesse et la directionnalité de Cin8. Ici, un protocole pour les tests de motilité avec Cin8-GFP purifié et l’analyse des propriétés mobiles de molécules uniques et de grappes de Cin8 est décrit.

Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.

Mesure directe des forces dans les faisceaux de microtubules actifs reconstitués

Cette étude détaille la purification de KIF1A (1-393LZ), un membre de la famille des kinésines-3, à l’aide du système d’expression du baculovirus Sf9. L’analyse in vitro de glissement monomoléculaire et multimoteur de ces moteurs purifiés a montré des propriétés de motilité robustes comparables à celles des moteurs du lysat de cellules de mammifères. Ainsi, le système Sf9-baculovirus est susceptible d’exprimer et de purifier la protéine motrice d’intérêt.

Analyse à molécule unique de moteurs de la famille Sf9 superprocessive kinésine-3 purifiée

Découvrez la formation d'ensembles moteurs de dyneine et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation de molécules uniques. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de transport cellulaire.

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

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