Name: Fabrication et mise en œuvre dune plate-forme de microscopie de traction sans référence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez la fabrication d'une plateforme de microscopie de traction sans référence par lithographie multiphoton. Cette méthode simplifie la mesure des forces cellulaires dans des hydrogels à base de poly(éthylène glycol).

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

O. A. Banda a reçu le soutien d'une bourse NSF IGERT SBE2 (1144726), de fonds de démarrage fournis par l'Université du Delaware et du National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). Le JHS bénéficie d'un financement du Programme IMAT des National Institutes of Health/National Cancer Institute (R21CA214299) et du Programme de prix CAREER de la National Science Foundation (1751797). L'accès à la microscopie a été soutenu par des subventions du NIH-NIGMS (P20 GM103446), de la NSF (IIA-1301765) et de l'État du Delaware. Le microscope à éclairage structuré a été acquis avec des fonds du Programme fédéral de subventions à la recherche et au développement de l'État du Delaware (16A00471). Le microscope confocal LSM880 utilisé pour la lithographie à balayage laser à deux photons a été acquis grâce à une subvention d'instrumentation partagée (S10 OD016361).

<ol><li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li>
<li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Cyclin+D1%2C+p27Kip1%2C+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li>
<li>Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li>
<li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li>
<li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103(2015).</li>
<li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li>
<li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li>
<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li>
<li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+reference+free+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li>
<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Post-Array-Detectors+%28mPADs%29%3A+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).</li>
<li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li>
<li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+flow+in+augmented+networks+%28AFAN%29%3A+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li>
<li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li>
<li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li>
<li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li>
<li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived%2C+Biomimetic+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li>
<li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li>
<li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon+Nanomaterials+for+Biomedical+Applications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li>
<li>Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019).</li>
<li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li>
<li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution%2C+large+deformation+3D+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li>
<li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Lithography%22%5BJournal%5D)">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail qui atténue une grande partie de la difficulté associée à la génération et à l'analyse des données TFM. Une fois préparés, les hydrogels photopatterned sont simples à utiliser, exigeant seulement la connaissance des pratiques standard de culture de tissu et de la microscopie de fluorescence. L'aspect sans référence permet une navigation insouciante sur les hydrogels chargés de cellules et élimine les étapes encombrantes de traitement d'image telles que l'enregi...

La microscopie de force de traction (TFM) est le processus d'approximation des tractions cellulaires à l'aide de champs de déplacement interpolés de marqueurs fiducial générés par une cellule adhérente et contractile. En utilisant TFM, l'influence des indices mécaniques dans l'environnement extracellulaire sur les processus cellulaires importants tels que la prolifération, la différenciation et la migration peut être étudiée1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Malheureusement, de nombreuses approches existantes peuvent être difficiles à mettre en œuvre ou exiger une connaissance des outils d'analyse et de calcul hautement spécialisés qui rendent l'ondes de POINTE difficile à utiliser pour les chercheurs inexpérimentés. Nous décrivons une méthodologie pour générer une plate-forme TFM qui élimine une partie de la difficulté d'analyse tout en fournissant également l'acquisition de données à haut débit.
Parmi les approches TFM existantes, la plus couramment utilisée pour quantifier la souche matérielle consiste à incorporation de petits marqueurs fluorescents (généralement des perles fluorescentes de la taille d'un nanomètre ou d'un micromètre) dans un hydrogel déformable, comme le polyacrylamide (PAA) ou le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA)13,14,15. Ces approches à base de perles permettent de regrouper densément les marqueurs fiduciaux autour d'une cellule d'intérêt afin de maximiser l'échantillonnage par déplacement. Malheureusement, la distribution des perles dans l'hydrogel ne peut pas être directement contrôlée de sorte que l'organisation spatiale est aléatoire. Ce placement aléatoire conduit à des problèmes tels que les perles qui sont trop proches les uns des autres pour résoudre avec précision, ou si la propagation que les taches du substrat donnent des données de faible qualité. L'incapacité de prédire où se trouvent les marqueurs fiducial en l'absence de cellules crée également une contrainte que, pour chaque ensemble collecté de données de traction cellulaire, une image de référence supplémentaire des marqueurs sous-jacents dans un état détendu doit également être capturée. L'image de référence est nécessaire pour que le déplacement dans l'image stressée puisse être approximatif comme la différence entre les images stressées et non stressées. Pour atteindre un état détendu, les cellules mesurées sont soit chimiquement détendues, soit complètement enlevées. Ce processus empêche souvent l'acquisition d'autres mesures expérimentales, inhibe les études cellulaires à long terme et limite le débit. Une image de référence nécessite également des techniques d'enregistrement d'images pour tenir compte de la dérive qui peut avoir eu lieu pendant l'expérimentation, conduisant souvent à l'appariement manuel encombrant des images d'état de stress aux images de référence.
D'autres méthodes TFM jugées sans référence, mettent en œuvre une certaine forme de contrôle sur la distribution des marqueurs fiducial, soit par lithographie haute résolution, impression par microcontact, ou micromolding16,17,18 ,19,20. Le TFM sans référence est réalisé en supposant que l'état détendu de chaque marqueur fiducial peut être prédit en fonction de la façon dont les positions de marqueur ont été prescrites pendant le processus de fabrication. Ces méthodes permettent de saisir complètement l'état de tension d'une cellule au sein d'une seule capture d'image dans laquelle les déplacements de marqueurs fiducial sont mesurés par rapport à une référence implicite que l'on peut déduire de la géométrie du marqueur fiducial. Bien que l'uniformité dans le placement des marqueurs soit généralement atteinte à l'aide de ces plates-formes, elles souffrent généralement de leurs propres lacunes par rapport aux approches largement utilisées basées sur les perles, y compris : 1) une diminution de la résolution de traction; 2) diminution de l'exactitude des déplacements hors avion (dans certains cas, une incapacité totale de mesurer); et 3) diminution de la personnalisation des substrats et des matériaux de plate-forme (p. ex., présentation de ligands, propriétés mécaniques).
Pour remédier à ces lacunes, nous avons conçu une nouvelle plate-forme TFM sans référence. La plate-forme utilise la chimie activée par multiphoton pour relier un petit volume d'un fluorophore dans des emplacements 3D spécifiques dans l'hydrogel qui servent de marqueurs fiducial pour mesurer la souche matérielle. De cette façon, nous avons conçu une plate-forme qui fonctionne de la même façon que les approches basées sur les perles, mais avec l'avantage significatif que les marqueurs fiducial sont organisés en tableaux quadrillés permettant le suivi sans référence des souches matérielles. Cette propriété sans référence offre de nombreux avantages. D'abord et avant tout, il permet une surveillance non intrusive des états de traction cellulaire (c.-à-d., contourne la nécessité de détendre ou d'enlever les cellules pour acquérir des positions de référence des marqueurs fiduciaux déplacés). C'était notre objectif principal dans la conception de ce système, car nous avions l'intention d'intégrer d'autres méthodes d'analyse en aval en tandem avec TFM, ce qui peut être difficile avec des approches destructrices de point final TFM. Deuxièmement, l'utilisation d'une référence implicite basée sur des tableaux quadrillés permet une automatisation quasi complète de l'analyse des déplacements. La régularité des tableaux crée un flux de travail prévisible où l'occurrence de cas exceptionnels (c.-à-d. des données de cellules d'échantillon contenant des artefacts imprévus tels que l'espacement sous-optimal des marqueurs ou les décalages d'enregistrement) peut être maintenue au minimum. Troisièmement, l'oubli de la nécessité d'acquérir une image de référence offre la liberté de surveiller de nombreuses cellules sur un seul échantillon sur de longues périodes de temps. Cela contraste avec les approches traditionnelles à base de perles, où, selon la fidélité des mouvements automatisés de stade du microscope, les erreurs de positionnement peuvent s'accumuler et augmenter la difficulté d'enregistrer correctement les images de référence à la tension cellulaire Images. Dans l'ensemble, cette plate-forme facilite un débit plus élevé dans la collecte de données sur les tensions cellulaires.
Avec ce protocole, nous espérons familiariser les lecteurs avec la technique de lithographie à balayage laser à deux photons que nous avons mise en œuvre pour générer cette plate-forme TFM sans référence pour mesurer les composants de traction en avion et hors plane générés par les cellules enseduites en surface. Non couvert dans ce protocole est la synthèse de certains des composants monomériques. En général, ces réactions comprennent des schémas de réaction de synthèse « un pot » presque identiques décrits précédemment21, et des alternatives à ces produits peuvent également être achetées. Nous visons également à familiariser les lecteurs avec les outils logiciels que nous avons générés pour promouvoir l'utilisation de microscopes à balayage laser disponibles dans le commerce comme outils d'impression 3D et pour faciliter l'analyse des déplacements de marqueurs fiducials.

<table><tbody><tr><td>Filtre de seringue Acrodisc, 0.2 &mu ; m Membrane Supor, faible liaison protéique</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td>Permet de filtrer les solutions de macromères avant la synthèse du gel de base et les étapes de lithographie ultérieures.</td></tr><tr><td>Les lamelles fonctionnalisées à l’acrylate-silane #1.5</td><td>in-house</td><td>in-house</td><td>Acrylates permettent de lier l’hydrogel de base à la surface du verre pour immobiliser les hydrogels. Voir la référence : 21-24</td></tr><tr><td>Axio-Observer Z1 avec microscope Apotome</td><td>Zeiss</td><td>Widefield avec module d’éclairage structuré utilisé pour capturer des</td><td></td> images pour TFM.</tr><tr><td>Chameleon Vision ii</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td>Équipé d’un microscope à balayage laser utilisé pour la lithographie multiphotonique.</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face, 9500PC, 6,0 mil</td><td>3M</td><td></td><td>Lient les lamelles fonctionnalisées en acrylate-silane aux boîtes de Pétri.</td></tr><tr><td>Flexmark90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>Permet le doublage du ruban adhésif double face permettant l’alimentation du ruban dans le traceur.</td></tr><tr><td>LSM-880</td> Microscope à balayage laser <td>Zeiss</td> utilisé pour la <td></td><td>lithographie multiphotonique.</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018a</td><td>Exécute des scripts personnalisés pour générer des instructions de lithographie pour le microscope et pour l’analyse de données TFM.</td></tr><tr><td>Modèle SC Plotter</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>Coupe le ruban adhésif double face en anneaux pour lier les lamelles de protection aux boîtes de Pétri.</td></tr><tr><td>Objectif C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Équipé à la fois sur les microscopes à grand champ et les microscopes à balayage laser pour être utilisé à la fois pour la lithographie et la TFM.</td></tr><tr><td>PEG-AF633</td><td>in-house</td><td>in-house</td><td>Variante PEG en acrylate marqué au fluorophore pour la création de marqueurs repères. Voir référence : 21</td></tr><tr><td>PEG-DA</td><<td>em>in-house</td><td>in-house</td><td>Matériau de base pour hydrogels. Voir référence : 21</td></tr><tr><td>PEG-RGDS</td><<td>em>in-house</em</td><td>>in-house</td><td>RGDS mono-acrylate PEG pour favoriser l’adhésion cellulaire. Voir référence : 21</td></tr><tr><td>boîtes de Pétri</td><td>CELLTREAT</td><td>229638</td><td>des trous de 8 mm sont découpés au centre de chaque plat à l’aide d’un mors de carottage pour s’adapter aux hydrogels de base.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Pour la création d’entretoises pour contrôler l’épaisseur de l’hydrogel de base (alias PDMS).</td></tr><tr><td>Seringue, Leur-Lok, 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Permet de filtrer les solutions de macromères avant la synthèse du gel de base et les étapes de lithographie ultérieures.</td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>UVP</td><td>Blak-Ray&reg ; B-100AP</td><td>Polymérise l’hydrogel de base.</td></tr><tr><td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>Accélérateur radical et co-monomère. Améliore l’incorporation de fluorophores pégylés pendant la lithographie.</td></tr></tbody></table>

fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

La quantification de la déformation des matériaux induits par les cellules fournit des informations utiles sur la façon dont les cellules détectent et réagissent aux propriétés physiques de leur microenvironnement. Bien qu'il existe de nombreuses approches pour mesurer la souche matérielle induite par les cellules, nous fournissons ici une méthodologie pour la surveillance de la souche avec une résolution sous-micron d'une manière sans référence. À l'aide d'un processus de modelage photolithographique à deux photons, nous démontrons comment générer des substrats synthétiques réglables mécaniquement et bioactivement contenant des rangées intégrées de marqueurs fiducial fluorescents pour mesurer facilement les trois dimensions ( 3D) profils de déformation des matériaux en réponse aux tractions de surface. À l'aide de ces substrats, les profils de tension cellulaire peuvent être cartographiés à l'aide d'une seule pile d'images 3D d'une cellule d'intérêt. Notre objectif avec cette méthodologie est de faire de la microscopie de force de traction un outil plus accessible et plus facile à mettre en œuvre pour les chercheurs qui étudient les processus de mécanotransduction cellulaire, en particulier les nouveaux arrivants sur le terrain.

Tout au long du protocole, il y a un certain nombre de points de contrôle qui fournissent des commentaires pour évaluer la qualité de la procédure de modelage. Afin de fournir un aperçu de la façon d'évaluer les progrès réalisés à chacun de ces points de contrôle, nous fournissons les résultats représentatifs d'une expérience réelle. Les résultats mettent en évidence l'application de ce protocole effectué sur un hydrogel photopatterned préparé pour l'analyse de TFM des cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVECs)...

Ce protocole fournit des instructions pour la mise en œuvre de la lithographie multiphoton pour fabriquer des tableaux tridimensionnels de marqueurs fiducial fluorescents intégrés dans des hydrogels à base de poly(éthylène glycol) pour une utilisation comme microscopie sans force de traction sans référence. Plates-formes. À l'aide de ces instructions, la mesure de la souche de matériau 3D et le calcul des tractions cellulaires sont simplifiés afin de promouvoir des mesures de la force de traction à haut débit.

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

La microscopie de force de traction est utilisée pour mesurer les forces générées par les cellules. Ce protocole simplifie l’analyse de collecte des données de force de traction, afin de les rendre plus accessibles aux utilisateurs inexpérimentés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux plates-formes de microscopie de force de traction sans référence existantes, est que la lithographie multiphoton permet une refonte rapide et facile du réglage de modelage en fonction des besoins expérimentaux individuels.Il existe de nombreuses étapes clés dans la fabrication et la mise en œuvre de cette nouvelle plate-forme de traction sans référence qui sont plus faciles à comprendre par la représentation visuelle plutôt que par le texte seul. Pour la photopolymérisation de l’hydrogel de base, ajoutez d’abord trois microlitres de la solution pré-polymère sur une mince feuille plate d’alcanes perfluoroalkoxy, et placez à plat 150 bandes PDMS épaisses de micromètres entourant, mais pas en contact avec, la goutte de solution pré-polymère. Placez un coverslip silanized acrylate sur le PDMS, avec la gouttelette pré-polymère centrée sous le coverslip pour aplatir la gouttelette pré-pol

fabrication-implementation-reference-free-traction-force-microscopy

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Dans cette vidéo, nous démontrons comment fabriquer et utiliser des détecteurs matriciels microfabriqué poste (mPADs) pour évaluer les modulations de la contractilité cellulaire.

Microfabriqués post-Array-détecteurs (mPADs): une approche pour isoler les forces mécaniques

Cette vidéo décrit le test de microscopie à force de traction. Le test détermine la traction cellulaire des cellules cancéreuses du côlon humain sur la matrice extracellulaire présente sur un hydrogel élastique mou ayant des billes fluorescentes intégrées. Le déplacement résultant des billes fluorescentes est mesuré à l’aide d’un logiciel approprié.

Dosage de la cytométrie de traction : une méthode pour quantifier la force de traction exercée par les cellules cancéreuses sur l’ECM

Les techniques traditionnelles de fabrication de polyacrylamide (PA) des gels contenant des sondes fluorescentes consistent en sandwich un gel entre une surface adhérente et une lame de verre. Ici, nous montrons que le revêtement de cette lame avec la poly-D-lysine (PDL) et des sondes fluorescentes localise les sondes à l'intérieur de 1,6 um à partir de la surface du gel.

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

sont décrits des protocoles pour quantifier les interactions mécaniques entre les cellules adhérentes et les substrats microstructurés. Ces interactions sont étroitement liées aux comportements cellulaires essentiels, notamment la migration, la prolifération, la différenciation et l’apoptose. Les protocoles présentent un logiciel d’analyse d’images open source appelé MechProfiler, qui permet de déterminer les forces impliquées pour chaque micro-post.

Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays

Ici, nous présentons un protocole mécanique pour perturber la connexine de jonction d'écart 43 et mesurer l'impact ultérieur ceci a sur la biomécanique endothéliale par l'observation des tractions et des contraintes intercellulaires.

Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption

La migration collective des cellules dans le développement, la cicatrisation des plaies et la métastes du cancer est souvent guidée par les gradients des facteurs de croissance ou des molécules de signalisation. Décrit ici est un système expérimental combinant la microscopie de traction avec un système microfluidique et une démonstration de la façon de quantifier la mécanique de la migration collective sous gradient biochimique.

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Ici, nous présentons un protocole utilisé pour effectuer des expériences de microscopie de force de traction sur les cellules B. Nous décrivons la préparation de gels polyacrylamides mous et leur fonctionnalisation, ainsi que l’acquisition de données au microscope et un résumé de l’analyse des données.

Microscopie de force de traction pour étudier l’activation de lymphocyte de B

La lithographie quasi UV et la microscopie à force de traction sont combinées pour mesurer les forces cellulaires sur des hydrogels à micromotifs. La libération ciblée de cellules individuelles induite par la lumière permet un grand nombre de mesures sur le même échantillon.

Contrôle de l’adhérence des cellules à l’aide de techniques de modelage d’hydrogel pour des applications en microscopie à force de traction

Pour avancer, les cônes de croissance doivent exercer des forces de traction contre l’environnement extérieur. La génération de forces de traction dépend de la dynamique de l’actine et de l’accouplement de l’embrayage. La présente étude décrit des méthodes d’analyse de la dynamique de l’actine, du couplage d’embrayage et des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Ici, nous présentons un dispositif novateur qui applique des formes d’onde de déformation isotropes et uniaxiales aux cellules tout en soutenant la culture sur des substrats à rigidité accordable et matrices protéiques personnalisables. Cette plateforme simple et économique permet aux chercheurs d’étudier comment les indices mécaniques régulent la fonction cellulaire, tant dans les études fondamentales que dans des contextes liés aux maladies.

Une plateforme novatrice pour l’étirement et l’imagerie cellulaire in vitro

Découvrez la fabrication d'une plateforme de microscopie de traction sans référence par lithographie multiphoton. Cette méthode simplifie la mesure des forces cellulaires dans des hydrogels à base de poly(éthylène glycol).

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Explorer plus de vidéos