Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

La microscopie de force de traction est utilisée pour mesurer les forces générées par les cellules. Ce protocole simplifie l’analyse de collecte des données de force de traction, afin de les rendre plus accessibles aux utilisateurs inexpérimentés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux plates-formes de microscopie de force de traction sans référence existantes, est que la lithographie multiphoton permet une refonte rapide et facile du réglage de modelage en fonction des besoins expérimentaux individuels.

Il existe de nombreuses étapes clés dans la fabrication et la mise en œuvre de cette nouvelle plate-forme de traction sans référence qui sont plus faciles à comprendre par la représentation visuelle plutôt que par le texte seul. Pour la photopolymérisation de l’hydrogel de base, ajoutez d’abord trois microlitres de la solution pré-polymère sur une mince feuille plate d’alcanes perfluoroalkoxy, et placez à plat 150 bandes PDMS épaisses de micromètres entourant, mais pas en contact avec, la goutte de solution pré-polymère. Placez un coverslip silanized acrylate sur le PDMS, avec la gouttelette pré-polymère centrée sous le coverslip pour aplatir la gouttelette pré-polymère à l’épaisseur des espaceurs PDMS.

Exposez la solution pré-polymère en sandwich à la lumière UV pendant environ une minute. Lorsqu’un hydrogel est entièrement formé, séparez soigneusement le coverslip des espaceurs PDMS. Utilisez un adhésif acrylique à double face haute performance pour fixer une boîte de Pétri à fond ouvert au coverslip.

Faites un soin particulier lorsque vous adhérant à la couverture chargée d’hydrogel à la boîte de Pétri. Un plat humide ou trop peu de pression pendant l’application permettra aux fuites de se former, ruinant l’échantillon. Appliquez une pression sur la surface de contact adhésive pour créer un joint complet entre le couvercle, l’adhésif et la boîte de Pétri, en prenant soin de ne pas casser le verre.

Utilisez du PBS filtré stérile pour rincer l’hydrogel. Ajoutez ensuite huit microlitres de NVP à 800 microlitres de la solution de laboratoire préparés pour la synthèse de l’hydrogel. Pour convertir une image binaire en masque numérique, ouvrez MATLAB et ouvrez et exécutez le runscript.

m Script MATLAB. Sélectionnez le fichier TIF binaire pour la conversion et sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers de la région. Entrez la taille finale désirée dans les microns de l’image sélectionnée.

L’image d’entrée sera mise à l’échelle et dimensionnée pour correspondre à ces paramètres. Pour créer un tableau de pixels unique, dans la région des options de générateur d’intérêt, décochez la case Supprimer tic sous petites régions/pixels simples, cochez la case tic squares et décochez l’utilisation sous lignes de rupture horizontales. Ensuite, cliquez sur OK. Le fichier OVL se trouve dans le dossier précédemment spécifié.

Ouvrez le fichier dans le logiciel microscope et chargez les régions désirées qui contrôlaient l’obturateur laser au cours de deux lithographies photons à balayage laser. Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions avec un minimum de lumière. Pour la fabrication de tableaux de marqueurs fiducials dans des conditions de faible lumière, mélangez soigneusement 200 microlitres de la solution de laboratoire NVP précédemment préparée avec 20 milligrammes d’Alexa Fluor 633 et retirez tout le PBS du plat contenant l’hydrogel.

Ajouter le mélange PEG-633 à l’hydrogel comme gouttelette qui englobe complètement l’hydrogel de base et charger la boîte de Pétri sur le porte-échantillon de l’étape du microscope. Couvrez ensuite le plat et laissez tremper la solution de modelage dans l’hydrogel pendant au moins 30 minutes, à l’abri de la lumière. Pour configurer le microscope pour l’imagerie, sélectionnez les lasers et filtres appropriés pour visualiser Alexa Fluor 488.

Localisez l’hydrogel à l’aide du signal PEG-488 et bloquez la collecte des longueurs d’onde à émissions plus longues du détecteur. Utilisez des balayages verticaux et horizontaux de tuiles pour localiser le centre de l’hydrogel dans le plan XY et zéro la scène dans cette position. Utilisez des balayages de ligne dans la fonction Z-stack pour localiser la surface de l’hydrogel et zéro la mise au point dans cette position.

Niveler l’hydrogel en répétant les balayages de ligne loin du centre XY pour identifier la position de surface, en ajustant les vis réglées pour l’étape du microscope, au besoin. Dans l’espace de travail logiciel microscope, créer un fichier d’expérience distinct pour le photopatterning et définir la puissance multi-photons à 1,8% et la vitesse de numérisation à six. Ajustez la taille du cadre de l’image et des pixels pour atteindre une taille de pixel de 0,1 micromètre par pixel et un rapport d’aspect de 100 pour un et chargez le fichier régions dans l’onglet de la région.

Utilisez une macro pour définir toutes les régions pour acquérir et activer la fonction Z-stack. Réglez l’espacement à 3,5 micromètres pour une profondeur totale de 28 micromètres et un nombre total de tranches Z de neuf. Utilisez ensuite la fonction Positions pour définir des emplacements spécifiques sur l’hydrogel où les tableaux de marqueurs fiducials seront photopatterned.

À mesure que le temps de trempage approche de la marque de 30 minutes, obtenez des balayages successifs de la ligne Z-stack de la surface de l’hydrogel toutes les cinq minutes pour vérifier l’enflure en fonction des changements dans l’emplacement de la surface par rapport à la position de mise au point à zéro. Si aucun changement de position de surface ne s’est produit au cours de l’intervalle de cinq minutes, exécutez les paramètres de modelage et utilisez le laser de 488 nanomètres pour vérifier que la surface de l’hydrogel ne s’est pas déplace pendant le modelage. Retirez ensuite l’hydrogel du microscope, aspirez la solution PEG-633 de la boîte de Pétri et rincez le plat avec du PBS filtré stérile.

Pour acquérir une cellule et des images de marqueur fiducial, retournez la boîte de Pétri au porte-échantillon pour localiser les zones modelées. Localiser une cellule d’intérêt et acquérir une image transmise ou fluorescente de la cellule. Puis acquérir une pile Z du tableau à motifs sous la cellule comme démontré, et d’acquérir un deuxième ensemble d’images transmises ou fluorescentes de la cellule.

Lors de la collecte d’une pile d’images, les images résultantes doivent afficher un tableau régulier de fonctionnalités à motifs qui oscillent en intensité en fonction de la position Z dans la pile d’images. Le suivi. m script fournit plusieurs images diagnostiques, y compris une projection Z des marqueurs fiduciaux fluorescents pour évaluer la qualité de pré-traitement, une parcelle des centroïdes détectés, la couleur codée en fonction de la position Z pour évaluer la qualité de détection des objets, et une parcelle des pistes représentant les centroïdes marqueurs détectés qui ont été reliés en colonnes dans la direction Z pour évaluer la qualité de suivi des objets.

Le script DISP 3D.m fournit une parcelle d’intensité en fonction de la position Z pour chaque colonne de fonctionnalités détectées dans une pile d’images donnée afin d’évaluer la qualité des profils d’intensité du marqueur fiducial. Les deux DISP 3D.

cisaillement m et DISP. m ensemble fournissent des histogrammes du bruit de déplacement mesuré dans chacune des dimensions de coordonnées cartésiennes ainsi que des cartes thermiques interpolées du déplacement. En outre, l’interp final3D_2.

m fournit des cartes thermiques des tractions de surface calculées à l’aide du code externalisé. La chose la plus importante à retenir au cours de cette procédure est que les solutions contenant lap sont sensibles à la lumière et doivent être protégés autant que possible contre les sources de lumière ambiante. Rappelez-vous que NVP est un composé organique volatil et doit toujours être manipulé dans un capot d’écoulement chimique.