Name: Génération dorganoïdes endométrials primaires humains multicellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez comment générer des organoïdes endométriaux primaires humains multicellulaires pour étudier la physiologie hormonale et les mécanismes de maladies. Cette méthode permet de tester des médicaments dans un modèle 3D fidèle au tissu natif.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été financée par la subvention UG3 du NIEHS/NIH/NCATS (ES029073) et le fonds Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Nous tenons à remercier l'installation de base de pathologie du Nord-Ouest pour le traitement des organoïdes fixes pour l'incorporation de paraffine. Nous tenons à remercier toute l'équipe de l'UG3, y compris les laboratoires Woodruff, Burdette et Urbanek pour les discussions et les collaborations perspicaces.

Des échantillons d'endomètre ont été prélevés sur des femmes préménopausées subissant une hystérectomie de routine pour des affections utérines bénignes à l'hôpital pour femmes Prentice de l'Université Northwestern, selon un protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel. Le consentement écrit a été obtenu de toutes les femmes incluses dans l'étude.
1. Préparation des moules d'Agarose
<ol><li>Avant de commencer l'isolement cellulaire, la fonte et l'équilibre de 1,5% agarose micro moules (Table des Matériaux) pour abriter les organoïdes selon les instructions du fabricant.</li>
</ol>2. Génération d'organoïdes endométrials
<ol><li>Récolte des cellules stromales primaires et épithéliales
	<ol>
<li>Dans un cabinet de biosécurité utilisant une technique aseptique, préparer une solution enzymatique (2,5 mg/mL de collagène de type I - 0,1 mg/mL DNase I dans 10 ml de dispase [500 unités]) à 37 oC, et filtrer stérilement la solution à l'aide d'un filtre à seringues de 0,2 mm dans un tube conique de 15 ml.</li>
		<li>Dans une armoire de biosécurité utilisant la technique aseptique, gratter l'endomètre des biopsies utérines et hacher le tissu sous le capot en très petits morceaux avec un scalpel. REMARQUE: Le tissu endométrial d'au moins 20 mm x 10 mm x 1 mm est nécessaire pour générer un nombre suffisant d'organoïdes.</li>
		<li>Mettre le tissu fraîchement haché dans la solution enzymatique dans un tube conique de 15 ml. Fermer le bouchon et envelopper le dessus avec un film de cire (Table des matériaux) pour prévenir la contamination.</li>
		<li>Mettre le tube avec du tissu dans un bain d'eau ou un incubateur à 37 oC pendant 30 min avec des secousses douces (80 à 100 tr/min).</li>
		<li>Empilez une passoire cellulaire de 100 m sur une passoire cellulaire de 20 m sur un tube conique de 50 ml. Filtrer la solution à travers les deux passoires, puis rincer le tube conique de 15 ml avec 10 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS; Tableau des matériaux) et mettre le lavage à travers la passoire pour s'assurer que toutes les cellules sont recueillies. REMARQUE: Le liquide adalé contient des cellules stromales et des globules rouges (20 ml au total). Les cellules épithéliales sont collectées sur la passoire de 20 m. Des morceaux de tissu non digéré restent au-dessus de la passoire de 100 m. Jeter les tissus non digérés dans un contenant de déchets biorisques.</li>
		<li>Inverser la passoire à cellules de 20 m de l'étape 2.1.5 sur un nouveau tube conique de 50 ml et laver les cellules épithéliales de la passoire avec 20 mL de médias organoïdes (Table of Materials) complétés par un stylo/streptocoque de 1%.</li>
		<li>Centrifuger les tubes coniques des marches 2.1.5 et 2.1.6 à 500 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Avec les cellules stromales collectées, retirez le supernatant et suspendez de nouveau la pastille avec 10 ml de tampon de lyse de globule rouge.  Incuber à 37 oC pendant 10 à 15 min. Centrifuger le tube conique à 500 x g pendant 5 min, retirer le supernatant et resuspendre la pastille avec 200 à 300 l de supports organoïdes (voir l'étape 2.2.2 pour d'autres instructions).</li>
		<li>Avec les cellules épithéliales collectées, retirez le supernatant et suspendez à nouveau avec 100 L de médias organoïdes (voir l'étape 2.2.2 pour d'autres instructions).</li>
	</ol></li>
	<li>Cellules d'ensemencement
	<ol>
<li>Après avoir réquilibté les moules d'agarose de 1,5 % dans les puits (1 moule par puits) d'une assiette de 24 puits, retirez les milieuis organoïdes à l'extérieur des moules agarose et inclinez la plaque de culture tissulaire de sorte que le milieu de la chambre d'ensemencement cellulaire des plats d'agarose puisse également être soigneusement enlevés.</li>
		<li>Afficher les suspensions épithéliales (à partir de l'étape 2.1.9) et les suspensions cellulaires stromal (à partir de l'étape 2.1.8) sous le microscope.  Ajoutez plus de support organoïde aux suspensions épithéliales ou stromales de cellules 100 l à la fois, de sorte que les suspensions soient à peu près égales en densité. REMARQUE: Les cellules épithéliales s'agglutinent ensemble, et il n'est pas conseillé de digérer/trypsiniser les cellules épithéliales en suspensions à cellule unique.</li>
		<li>Mélanger 1 partie des cellules stromales avec 3 parties de cellules épithéliales par volume.</li>
		<li>Pipette 50 L (60 000 cellules) de la suspension cellulaire combinée dans la chambre d'ensemencement cellulaire du moule à agarose.</li>
		<li>Une fois que les moules d'agarose sont remplis de cellules, ajoutez soigneusement 400 l de support organoïde frais dans le puits de la plaque de 24 puits. REMARQUE: Le milieu atteint juste en dessous de la surface de la vaisselle agarose et ne fera pas flotter les cellules hors des moules. Après 2 à 3 jours, les cellules se déposent et commencent à former des organoïdes.</li>
		<li>Changer de moyen tous les deux jours avec 500 l de milieux organoïdes.</li>
		<li>Après 2-3 jours, changer moyen à un qui est complété avec 0.1 nM estradiol (E) et 0.8 nM testostérone (T) pour favoriser l'organisation des cellules épithéliales et stromales. REMARQUE: Bien que l'organisation des cellules épithéliales et stromales puisse se produire avec ou sans hormones, plus d'organoïdes s'organiseront en présence d'hormones.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Récolte d'organoïdes endométrials pour les expériences
REMARQUE: Une fois l'expérience terminée, les organoïdes endométrials peuvent être traités pour l'histologie ou l'analyse de l'ARN. Les étapes suivantes décrivent comment traiter les organoïdes.
<ol><li>
Histologie
	<ol>
<li>Dissoudre 1,5 % d'agarose dans la saline tamponnée de phosphate (PBS) par ébullition. Laisser refroidir l'agarose liquide jusqu'à environ 50 oC.</li>
		<li>Sous un microscope disséquant, inclinez la plaque de 24 puits et sortez soigneusement le milieu de l'extérieur du moule à agarose. Soigneusement pipette sur le milieu de l'intérieur du moule agarose pour éviter de perturber les organoïdes.</li>
		<li>Sous un microscope à disséquer, pipette soigneusement 70-75 l de chaud (50 oC) 1,5% agarose dans la chambre du plat agarose. Veillez à ne pas déranger les organoïdes.</li>
		<li>Laisser refroidir à 4 oC pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans chaque puits de la plaque de puits 24 et fixer l'ensemble du moule scellé agarose contenant des organoïdes pendant la nuit à 4 oC. Conservez ensuite 70 % d'éthanol à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à être assidu pour l'incorporation de paraffine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolement de l'ARN
	<ol>
<li>Sous un microscope disséquant, inclinez la plaque de 24 puits et sortez soigneusement le milieu de la chambre du moule agarose.</li>
		<li>Pipette 1 mL de milieu organoïde frais directement dans le moule d'agarose ainsi les organoïdes sont évacués des microwells. Veillez à ne pas créer trop de bulles.</li>
		<li>Répétez la pipetilage à nouveau avec le même support à partir de l'étape 3.2.2.</li>
		<li>Recueillir tout le milieu contenant les organoïdes. Centrifugeuse à vitesse maximale pour recueillir les organoïdes et procéder à l'extraction de l'ARN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Nous avons produit des organoïdes endométrials humains composés de cellules épithéliales et stromales de l'endomètre sans l'utilisation de matériaux exogènes d'échafaudage. Bien qu'il ait déjà été démontré que les cellules épithéliales endométriales primaires peuvent former des organoïdes6,7, ces cellules ont été incorporées dans une matrice gélatineuse de protéines sécrétées par les cellules de sarcome de souris (voir tableau des matériaux) pour...

L'endomètre humain religne la cavité utérine et sert de premier contact pour l'embryon lors de l'implantation. L'endomètre est composé de cellules épithéliales luminestiques et glandulaires, de fibroblastes stromaux de soutien, de cellules endothéliales et de cellules immunitaires. Ensemble, ces types de cellules composent le tissu endométrial qui est l'un des tissus les plus sensibles aux hormones stéroïdes sexuelles1. Les changements qui se produisent au cours de chaque cycle menstruel sont frappants. La croissance et le remodelage appropriés de l'endomètre sont nécessaires pour permettre l'implantation d'embryons. La réponse aberrante à l'oestrogène et à la progestérone peut avoir comme conséquence un endomètre réfractaire qui ne permet pas l'établissement réussi de la grossesse et peut même avoir comme conséquence des maladies comprenant la néoplasie endométriale.
Afin d'étudier les réponses hormonales et les changements essentiels qui se produisent dans l'endomètre, les cellules des tissus endométrial excisés des patients pendant la chirurgie ou la biopsie endométriale ont été propagées dans la culture cellulaire. Les cellules stromales endométriales prolifèrent et se propagent facilement de préférence, et le processus de différenciation induit e par la progestérone peut être récapitulé in vitro. En conséquence, beaucoup a été appris au cours de ce processus de différenciation, appelé décidualisation2,3. L'autre type de cellule majeure dans l'endomètre, les cellules épithéliales luminal et glandulaire, cependant, ne se développent pas bien comme les monocouches traditionnels, perdant la polarité, devenant sénescent, et ayant le potentiel proliférant limité. En conséquence, on en sait moins de leur biologie et de leur rôle dans l'endomètre humain. Comme beaucoup de néoplasie proviennent des cellules épithéliales, les mécanismes associés à l'hyperplasie ou à la transformation aux cellules cancéreuses restent à être entièrement définis. En outre, des études ont établi que la réponse hormonale implique les actions paracrines intimes entre les cellules épithéliales et stromales de l'endomètre4,5.
Récemment, une culture organoïde tridimensionnelle (3D) des cellules épithéliales endométriales a été établie par deux groupes indépendants6,7, qui sont les premiers rapports des organoïdes formés à partir du tissu endométrial. Ces organoïdes étaient composés des cellules épithéliales endométriales incorporées dans une matrice de protéine (tableau des matériaux) et n'ont pas inclus un compartiment hormonalement sensible important de l'endomètre endométrial, les fibroblastes stromal. Comme les protéines matricielles peuvent varier d'un lot à l'autre et peuvent déclencher des voies de signalisation qui ne se produisent pas nécessairement dans le tissu, il serait idéal de remplacer les protéines matricielles par des composants de l'endomètre. Dans la présente étude, un protocole pour générer des organoïdes endométrialhumains humains sans échafaudage des cellules épithéliales et stromales de l'endomètre humain est présenté. La présence de cellules stromales fournit non seulement le soutien pour les cellules épithéliales mais fournit également les actions paracrines nécessaires qui ont été établies pour être importantes pour la réponse d'hormone endométriale4,8,9 .
Le nouvel organoïde endométrial multicellulaire offre un système modèle de l'endomètre qui est simple à générer et qui intègre à la fois des cellules épithéliales et stromales. Ces organoïdes peuvent être utilisés pour étudier les changements hormonaux à long terme et les premiers événements de la maladie comme la tumorigénèse due à un déséquilibre hormonal ou des insultes exogènes. La complexité de ces organoïdes pourrait éventuellement être élargie pour inclure d'autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales et immunitaires avec éventuellement des cellules myométriales pour imiter vraiment la physiologie des tissus humains.

<table><tbody><tr><td>Agarose HS, grade biologie moléculaire</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Moules d’agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium (NH4Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Colgénase, type II, poudre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Coloration éosine</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td>Récepteur d’œstrogène</tr><tr><td>(SP1), anticorps monoclonal de lapin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield avec DAPI, milieu de montage histologique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x sans solution</td></tr> de <tr><td>coloration d’hématoxyline</td> rouge de calcium, de magnésium et de phénol <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>Formulation Harris modifiée,</td></tr><tr><td>solution d’héparine</td> sans mercure <td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>ajouté au milieu MammoCult</td></tr> Solution <tr><td>mère d’hydrocortisone</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>ajouté au milieu MammoCult</td></tr><tr><td>Milieux organoïdes - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>complété par 2 &micro ; L/mL d’héparine et 5 & micro ; L/mL d’hydrocortisone</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, solution à 16 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td>Récepteur de</tr> la <tr><td>progestérone, PgR 1294, non conjugué, surnageant de culture</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>matrice protéique - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-E-cadhérine de souris purifié</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>Anticorps anti-vimentine recombinant [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>Kit de lyse et d’isolement de l’ARN</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testostérone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Teinture trichrome</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Film de cire - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

L'endomètre humain est l'un des tissus les plus sensibles aux hormones dans le corps et est essentiel pour l'établissement de la grossesse. Ce tissu peut également devenir malade et causer la morbidité et même la mort. Les systèmes modèles pour étudier la biologie de l'endomètre humain ont été limités aux systèmes de culture in vitro de types de cellules uniques. En outre, les cellules épithéliales, l'un des principaux types cellulaires de l'endomètre, ne se propagent pas bien ou ne conservent pas leurs traits physiologiques en culture, et donc notre compréhension de la biologie de l'endomètre reste limitée. Nous avons généré, pour la première fois, des organoïdes endométrials qui se composent à la fois de cellules épithéliales et stromales de l'endomètre humain. Ces organoïdes ne nécessitent pas de matériaux exogènes d'échafaudage et s'organisent spécifiquement de sorte que les cellules épithéliales englobent la structure sphéroïde et deviennent polarisées avec des cellules stromales au centre qui produisent et sécrètent du collagène. Les récepteurs d'oestrogène, de progestérone et d'androgène sont exprimés dans les cellules épithéliales et stromal et le traitement avec des niveaux physiologiques d'oestrogène et de testostérone favorisent l'organisation des organoïdes. Ce nouveau système modèle peut être utilisé pour étudier la biologie de l'endomètre normal et la maladie d'une manière qui n'était pas possible auparavant.

Un schéma du protocole est représenté dans la figure 1. Le tissu utérin a été obtenu de la chirurgie après qu'il ait été examiné par des pathologistes. La doublure endométriale a été séparée du myometrium par le raclage et le tissu endométrial a été enzymatiquement digéré aux cellules comme décrit dans le protocole. Des cellules épithéliales et stromales ont été ajoutées dans des micropuits dans les moules d'agarose. Après 7 jours dans la culture, les organoïdes ont été traités avec E et T p...

Un protocole pour produire des organoïdes endométrials primaires humains qui se composent des cellules épithéliales et stromales et pour retenir des caractéristiques du tissu endométrial indigène est présenté. Ce protocole décrit des méthodes de l'acquisition utérine de tissu au traitement histologique des organoïdes endométrials.

Génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

L’endomètre est un tissu qui change chaque mois en réponse aux hormones. Le déséquilibre hormonal peut empêcher l’attachement d’embryon et également causer des maladies comme le cancer. Notre protocole reconstruit l’endomètre afin qu’il puisse être étudié en dehors du corps de la femme d’une manière physiologique.Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une structure 3D de cellules composées de deux types de cellules hormonalement sensibles, les cellules épithéliales et stroma qui organisent et se comportent spécifiquement comme elles le font dans le corps. Puisque les organoïdes peuvent mieux imiter le comportement des tissus, ils peuvent éventuellement être utilisés pour tester différents médicaments. Les organoïdes endométrials peuvent être utilisés pour étudier les effets directs des facteurs de risque actuellement connus pour le cancer, y compris l’obésité et le syndrome ovarien polykystique.Nos organoïdes soulignent l’importance des actions paracrines entre deux types de cellules. Il est important de commencer avec une quantité suffisante de tissu. Obtenir la bonne densité de cellules épithéliales et stromales peut être délicat.En outre, les organoïdes sont assez petits et peuvent être difficiles à visualiser avec la coloration de l’IHC. La visualisation de cette procédure est importante parce qu’il ya quelques étapes qui seront beaucoup plus faciles à comprendre après les avoir vus. Il s’agit notamment d’obtenir la bonne couche tissulaire de l’utérus, obtenir la bonne densité de cellules à combiner, et l’ensemencement des moisissures agarose.Avant de commencer l’isolement cellulaire, moulage et équilibrage 1,5% agarose micro-moules selon les instructions du fabricant pour abriter les organoïdes. Dans une armoire de biosécurité, utilisez des techniques aseptiques pour préparer une solution enzymatique à 37 degrés Celsius et filtre stérile la solution à l’aide d’un filtre à seringues de 0,2 micromètre dans un tube conique de 15 millilitres. À l’aide d’un scalpel, gratter l’endomètre des biopsies utérine et émincer le tissu en très petits morceaux.Placez le tissu fraîchement haché dans le tube conique de 15 millilitres contenant la solution enzymatique. Fermez le bouchon et enveloppez le dessus du tube avec un film de cire pour éviter la contamination. Placez le tube dans un bain d’eau ou un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant doucement.Après cela, empilez une passoire cellulaire de 100 microns sur une passoire cellulaire de 20 microns sur un tube conique de 50 millilitres. Filtrer la solution à travers les deux passoires. Rincez le tube conique de 15 millilitres avec le HBSS et placez ce lavage à travers la passoire pour vous assurer que toutes les cellules sont collectées.Ensuite, inverser la passoire cellulaire de 20 microns sur un nouveau tube conique de 50 millilitres et laver les cellules épithéliales de la passoire avec 20 millilitres de médias organoïdes complétés par 1% de pénicilline et de streptomicine. Centrifuger les tubes coniques à 500 G pendant cinq minutes. Pour les cellules stromales collectées, enlever le supernatant et résuspendre la pastille en 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Centrifuger ces cellules à 500 G pendant cinq minutes. Retirer le supernatant et réutiliser la pastille avec 200 à 300 microlitres de médias organoïdes.Pour les cellules épithéliales collectées, enlever le supernatant et résuspendre la pastille dans 100 microlitres de médias organoïdes. Après que les moules d’agarose de 1,5% soient équilibrés, enlevez le milieu organoïde à l’extérieur des moules d’agarose et inclinez la plaque de culture de tissu de sorte que le milieu de la chambre d’ensemencement cellulaire des plats d’agarose puisse également être soigneusement enlevé. Visualisez les suspensions cellulaires épithéliales et stromales au microscope et ajoutez plus de supports organoïdes aux suspensions, en vous assurant d’ajouter seulement 100 microlitres à la fois de sorte que la suspension soit à peu près égale en densité.Combinez ensuite une partie des cellules stromales avec trois parties des cellules épithéliales par volume. Pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire combinée dans la chambre d’ensemencement cellulaire du moule agarose. Une fois que les moules agarose sont remplis de cellules, ajouter soigneusement 400 microlitres de médias organoïdes frais dans les puits de la plaque de 24 puits.Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant de changer le milieu tous les deux jours avec 500 microlitres de médias organoïdes. Après sept jours, changer le milieu à celui qui est complété par 0,1 nanomolaire estradiol et 0,8 nanomolaire testostérone pour promouvoir l’organisation des cellules épithéliales et stromales. Tout d’abord, dissoudre 1,5% agarose dans PBS par ébullition.Placez le liquide agarose dans un bécher d’eau chaude et laissez-le refroidir à environ 50 degrés Celsius. Sous un microscope disséquant, inclinez la plaque de 24 puits et pipette soigneusement le milieu de l’extérieur du moule agarose. Puis pipette soigneusement le milieu de l’intérieur du moule agarose pour éviter de perturber les organoïdes.Ajouter soigneusement entre 70 et 75 microlitres de chaud, 1,5% agarose dans la chambre du plat agarose, en prenant soin de ne pas déranger les organoïdes. Laisser refroidir la plaque à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, ajouter 4% paraformaldéhyde dans chaque puits de la plaque de 24 puits et fixer l’ensemble scellé moule agarose nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, conservez la plaque à 70 % d’éthanol à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à être mélangée à la paraffine. Pour commencer l’isolement de l’ARN, visualisez la plaque sous un microscope disséquant. Inclinez la plaque et pipette soigneusement sur le milieu de la chambre du moule agarose.Pipette avec force un millilitre de milieu organoïde frais directement dans le moule agarose de sorte que les organoïdes sont rincés hors des microwells, en prenant soin de ne pas créer trop de bulles. Répétez ce processus de pipetage énergique une fois à l’aide du même support. Après cela, recueillir tout le milieu contenant les organoïdes.Centrifugeuse à 500 G pour recueillir les organoïdes, et procéder à l’extraction de l’ARN. Dans cette étude, des organoïdes endométrials humains composés des cellules épithéliales et stromal de l’endomètre sont générés sans l’utilisation des matériaux exogènes d’échafaudage. Pour le traitement histologique, les moules d’agarose contenant les organoïdes endométrials sont scellés avec l’agarose, suivis de la fixation avec 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit.Ces moules sont traités pour l’intégration standard de paraffine sectionnée et souillée pour l’histologie, l’immunofluorescence, ou l’immunohistochimie. L’hématoxyline dans la coloration de l’éosine révèle une structure sphéroïde avec une seule couche de cellules tapissant l’extérieur et les cellules au centre. Les marqueurs spécifiques aux cellules pour les cellules endométriales, épithéliales et stromal révèlent des cellules épithéliales entourant l’organoïde avec des cellules stromales au centre.Les marqueurs de la physiologie endométriale confirment que les organoïdes endométrials ont conservé certaines caractéristiques du tissu indigène. La coloration trichrome, qui tache le bleu collagène et les cellules rouges, montre la présence de collagène dans le centre où résidaient les cellules stromales, démontrant la production active et la sécrétion de collagène par des cellules stromales similaires au tissu indigène. En outre, la coloration immunohistochimique révèle la présence des récepteurs d’oestrogène, des récepteurs d’androgène, et des récepteurs de progestérone dans les cellules épithéliales et stromal.Il est important de plaquer les cellules densément afin que nous avons assez d’organoïdes pour les expériences en aval. Cela prendra un peu de pratique. Les organoïdes endométrials peuvent être cultivés dans différentes conditions, puis récoltés pour des expériences comme l’immunohistochimie ou la coloration immunofluorescence pour étudier l’expression des protéines ou récoltés pour l’ARN pour étudier l’expression des gènes.Notre laboratoire étudie comment l’endomètre réagit aux niveaux modifiés d’hormone, qui peuvent mener à l’hyperplasie endométriale et au cancer. Nous pouvons employer ces organoïdes pour des traitements à long terme des hormones et ajouter des conditions pathologiques telles que la testostérone excédentaire trouvée dans le syndrome ovarien polycystic, ou des signaux des adipocytes pour étudier des changements endométrials obésité-induits. Les tissus humains sont considérés comme biodangereux, et il sera important de prendre les précautions appropriées.

generation-of-multicellular-human-primary-endometrial-organoids

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Ici, quatre méthodes pour générer des organoïdes testiculaires à partir des cellules testiculaires murines néonatales primaires sont décrites, c’est-à-dire la matrice extracellulaire (ECM) et les environnements de culture 2D et 3D exempts d’ECM. Ces techniques ont de multiples applications de recherche et sont particulièrement utiles pour étudier le développement testiculaire et la physiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Nous présentons un protocole pour développer des cultures organoïdes épithéliales à partir de dents humaines. Les organoïdes sont solidement extensibles et récapitulent les cellules souches épithéliales de la dent, y compris leur capacité de différenciation des améloblastes. Le modèle organoïde unique fournit un outil prometteur pour étudier la biologie dentaire humaine (cellules souches) avec des perspectives pour les approches régénératrices des dents.

Établir les organoïdes de la dent humaine comme un outil puissant pour la recherche mécaniste et la thérapie régénérative

Ce protocole décrit des méthodologies pour établir des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris pour l’expression génique et les analyses histologiques.

Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes hépatiques endodermiques rapides et reproductibles (eHEPO). Avec ce protocole, les eHEPO peuvent être produits en 2 semaines et se développer à long terme (plus d’un an) sans perdre leur différenciation et leur fonctionnalité.

Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Ce protocole décrit l’établissement d’organoïdes tissulaires tridimensionnels (3D) à partir de cellules primaires d’épithélium de surface ovarienne humaine (hOSE). Le protocole comprend l’isolement de l’hOSE à partir d’ovaires fraîchement collectés, l’expansion cellulaire de l’hOSE, les procédures de cryoconservation-décongélation et la dérivation d’organoïdes. L’immunofluorescence, l’analyse quantitative et la démonstration de l’utilité en tant que plate-forme de dépistage sont incluses.

Les organoïdes de l’épithélium de surface de l’ovaire humain comme plate-forme pour étudier la régénération des tissus

Ici, nous présentons un protocole pour isoler et cultiver des cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre de rat (reESC), générant des organoïdes de l’endomètre du rat. Cette méthode facilite les études in vitro des maladies de l’endomètre, permettant l’édition de gènes et d’autres manipulations cellulaires.

Génération et caractérisation d’organoïdes utérins de rat à partir de cellules souches épithéliales de l’endomètre de rat

Nous présentons un protocole détaillé pour établir et manipuler génétiquement les organoïdes cervicales humains.

Génération et manipulation génétique des organoïdes cervicales humains

Ce protocole décrit une méthode définie à base d’hydrogel pour générer des organoïdes mammaires humains qui récapitulent des caractéristiques clés de la morphogenèse mammaire dans un système de culture tridimensionnel contrôlé.

Une méthode définie à base d’hydrogel pour générer des organoïdes mammaires humains tridimensionnels qui récapitulent la morphogenèse mammaire

La modélisation du développement du cerveau humain a été entravée en raison de la complexité sans précédent du tissu épithélial neural. Ici, une méthode de génération robuste d’organoïdes cérébraux pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et modéliser la microcéphalie in vitro est décrite.

Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

Découvrez comment générer des organoïdes endométriaux primaires humains multicellulaires pour étudier la physiologie hormonale et les mécanismes de maladies. Cette méthode permet de tester des médicaments dans un modèle 3D fidèle au tissu natif.

Génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

Explorer plus de vidéos