Name: Transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Découvrez la greffe de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon adipeux blanc interscapulaire. Cette méthode éprouvée depuis plus de 40 ans permet d'étudier les effets autonomes des cellules mammaires versus l'hôte en recherche sur le cancer du sein.

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Ce travail a été financé par le Hollings Cancer Center’s Cancer Center’s Cancer Center Support Grant P30 CA138313 financement de la recherche pilote des National Institutes of Health (<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">https://www.nih.gov/</a>), et des fonds du Département de pathologie et de médecine de laboratoire à l’Université médicale de Caroline du Sud. Nous tenons à remercier Marijne Smiths d’avoir enregistré les déclarations d’entrevue.

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Ce protocole décrit une technique de transplantation épithéliale mammaire optimisée pour travailler avec des rats. Les organoïdes épithéliales mammaires isolés des rats donneurs (3-5 semaines) sont greffés dans le coussinet de graisse blanc interscapulaire des rats receveurs (également 3-5 semaines d’âge). Les résultats peuvent être interprétés aussi peu que 4-6 semaines plus tard, en utilisant la microscopie légère pour examiner le tissu greffé; cependant, la quantité optimale de temps entre la transplantation et le sac...

Le développement des glandes mammaires postnatales et la morphogénèse canalaire sont des processus largement influencés par la signalisation hormonale au début de la puberté. Chez les souris et les rats, organismes modèles couramment utilisés de la biologie des glandes mammaires, ce processus commence vers l’âge de 3 semaines, où la prolifération et la différenciation rapides entraînent la formation du parenchyme mature. La glande mammaire mature peut subir de nombreuses séries d’expansion et d’involution, une propriété qui a été à l’étude depuis le début du20e siècle. Dans le contexte de l’hyperprolifération et du développement du cancer, des techniques de transplantation de glandes mammaires ont été développées dans les années 19501, et renforcées par la méthodologie quantitative fournie par Gould et coll. en 19772,3,4. Le raffinement de la technique de transplantation chez les rongeurs a contribué à des progrès majeurs dans la compréhension de la biologie normale des glandes mammaires qui sont encore largement utilisés pour étudier l’effet de divers traitements et la manipulation génétique sur le développement normal des glandes mammaires et les états de la maladie.
De nombreuses hypothèses ont été générées et ensuite testées à l’aide de la transplantation de glandes mammaires, décrites pour la première fois par DeOme et coll. en 19591. Des expériences menées sur plusieurs décennies ont montré la propension du tissu canalaire excisé des glandes mammaires des donneurs pour repeupler l’ensemble du coussinet de graisse5,6,7 et ont indiqué qu’un composant critique du développement des glandes mammaires réside dans ces structures épithéliales. Des études ultérieures chez la souris ont montré qu’une seule cellule souche mammaire peut repeupler un coussinet de graisse défriché et a contribué à la découverte d’un ancêtre unique et commun des cellules épithéliales mammaires basales et lumineuses8,9,10. Conformément à ces conclusions, il a été suggéré que la transplantation augmente le bassin de cellules avec un potentiel multilinéaire-repopulation en raison de la plasticité, permettant aux cellules greffées de se développer une glande mammaire fonctionnelle7,10,11,12,13. Fait important, l’utilisation de techniques de transplantation chez les rongeurs surmonte les limites des anomalies induites par la culture cellulaire14 et fournit souvent des résultats en seulement quelques semaines.
Tandis que la procédure a été décrite à l’origine dans le contexte des lésions prénéoplastiques chez les souris, elle a été bientôt étendue aux rats et employée en conjonction avec le traitement cancérogène pour établir la multiplicité comme mesure de la susceptibilité de cancer15,mais la popularité des techniques de transplantation a suivi le développement des outils génétiques pour chaque espèce. Bien que les études de souris incorporant la transplantation aient contribué à de nombreux résultats translationnels, le parenchyme de la glande mammaire de rat ressemble à l’humain plus étroitement16,17 et offre des avantages distincts pour étudier le cancer du sein récepteur-positif d’oestrogène (ERMD). Les tumeurs mammaires sont inducibles chez les deux espèces, mais elles diffèrent en termes de sensibilité hormonale et de profils d’expression génique. Une différence primaire est que les tumeurs mammaires de rat expriment et dépendent de la fonction des récepteurs ovariens et pituitaires d’hormone, à savoir, l’oestrogène et la progestérone (PR), semblables au sous-type luminal-A du cancer du sein humain. En effet, la transplantation épithéliale mammaire, telle que décrite dans ce protocole, a été utilisée pour étudier les variantes génétiques impliquées dans le cancer du sein et déterminer l’autonomie cellulaire des effets sur les cellules épithéliales mammaires18.
En plus de la biologie tumorale, l’épithélium canalaire de la glande mammaire normale de rat montre un niveau plus élevé de ramification et est flanqué d’une couche plus épaisse de stroma que la souris. L’importance du stroma est bien documentée dans les études de transplantation épithéliale mammaire. L’épithélium mammaire doit interagir avec le stroma gras, et idéalement son propre mésenchyme, pour subir sa morphogénèse caractéristique19,20. La greffe de tissu dans une glande mammaire receveure fournit un environnement optimal; cependant, la présence d’épithélium endogène peut interférer avec les résultats. Le préeffacement de la glande mammaire de l’épithélium endogène est généralement exécuté dans les essais de transplantation de souris et exige l’excision chirurgicale du tissu mammaire endogène et/ou l’enlèvement du mamelon1,21,22. Bien que possible, le pré-effacement de l’épithélium mammaire chez les rats après le serrage n’est pas aussi largement exécuté, principalement en raison de l’inefficacité de la compensation de l’arbre mammaire en croissance chez les rats post-serleurs. Puisqu’il a été démontré que les régions du tissu adipeux ailleurs dans le corps pourraient soutenir la croissance de l’épithélium mammaire transplanté21,23,24, le processus de précompensation peut être facilement évité chez les rats en greffant le tissu dans le tampon de graisse blanche interscapulaire.
La méthode de transplantation décrite dans cet article implique l’injection d’organoïdes de glande mammaire enzymatiquement dissociés (fragments d’épithélium canalaire mammaire et d’autres types de cellules capables de morphogénèse) ou de cellules monodispersées dans le coussinet adipeux interscapulaire dans les souches consanguines, isogéniques ou congéniques des rats de laboratoire2. Puisque le tampon interscapulaire de graisse est normalement dépourvu du tissu mammaire, il fournit un environnement approprié pour les emplacements multiples de transplantation sans avoir besoin de pré-défricher l’épithélium endogène. En conséquence, les glandes mammaires abdominales-inguinales de l’animal hôte ne sont pas soumises à une manipulation chirurgicale, se développent normalement et ne peuvent pas interférer avec l’interprétation des résultats. En outre, les glandes mammaires intactes peuvent être utilisées pour la comparaison pour évaluer les effets de l’hôte par rapport aux donneurs sur le développement de l’épithélium mammaire et la tumorigénèse18,25. Bien que le repeuplement de la glande mammaire à partir d’une seule cellule souche est disponible pour les souris, il n’a pas encore été développé pour les rats, principalement en raison du manque de disponibilité d’anticorps à sélectionner pour les cellules souches mammaires rat25,26,27. Malgré cela, la transplantation de cellules épithéliales mammaires monodispersées pour quantifier le potentiel de repeuplement peut être réalisée avec succès, et ces cellules se développeront normalement lorsqu’elles sont greffées dans le cadre approprié2,3,4. Bien que les organoïdes soient bons à de nombreuses fins, les cellules monodispersées sont nécessaires pour des applications quantitatives, par exemple, pour déterminer le nombre de cellules épithéliales mammaires requises pour l’initiation au cancer après le traitement de rayonnement ionisant28 ou pour comparer les caractéristiques des populations épithéliales mammaires sélectionnées par le flux29.
À ce jour, la procédure décrite ici est la méthode la plus robuste d’effectuer la transplantation de glande mammaire chez le rat avec un objectif global d’étudier le développement de glande mammaire et les mécanismes sous-jacents au développement du cancer du sein. Souvent, le donneur et/ou les animaux receveurs sont exposés à différentes variables avant, pendant ou après la transplantation épithéliale. Les exemples incluent des études de gène unique impliquant la carcinogenèse chimique30, rayonnement28,31,32, manipulation génétique du génome hôte/donateur18, et la manipulation hormonale12. Un avantage majeur de la dissociation enzymatique décrite dans ce protocole est la possibilité d’isoler les organoïdes épithélials ou les cellules monodispersées pour des expériences complémentaires impliquant la cytométrie de flux, la culture 3-D, l’édition de gènes, et plus encore. Les applications futures de cette technique comprendront la manipulation supplémentaire du donneur et/ou du tissu hôte avec le génie génétique. Par exemple, les cellules donneuses peuvent être génétiquement modifiées ex vivo à n’importe quel locus génomique choisi à l’aide du système d’édition de gènes CRISPR-Cas9. De même, les rats receveurs peuvent également être génétiquement modifiés pour étudier l’interaction entre les facteurs génétiques du donneur et du receveur.

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; Filtres pour seringues</td><td>M Fisher Scientific</td><td>09-715G</td><td>milieux de digestion de collagénase filtrants stériles</td></tr><tr><td>1,5 - 2,0 mL tubes à microcentrifuger (stériles)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>contenant des cellules remises en suspension et/ou un mélange d’homogénat de cerveau</td></tr><tr><td>100 & micro ; Filtres à cellules M</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>Filtrer l’homogénat du cerveau</td></tr><tr><td>100 uL Seringues étanches au gaz avec aiguilles de calibre 25</td><td>Hamilton</td><td>81001 & 90525</td><td>Pour injecter un mélange de greffon dans des animaux receveurs (1 par génotype/condition de donneur)</td></tr><tr><td>1000 uL pointes de pipette + pipette</td><td></td> <td>--</td><td>transfert de cellules/mélanges/tissus</td></tr><tr><td>15 mL Tube en polypropylène</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>stockage du mélange d’homogénat cérébral, ou cellule : mélange d’homogénat pour la transplantation</td></tr><tr><td>40 & micro ; Filtres à cellules</td><td>M Corning</td><td>431750</td><td>organoïdes filtrants après lavage de la pastille cellulaire</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td>pour la digestion de la collagénase du tissu de la glande mammaire donneuse</td></tr><tr><td>Boîtes de 60 mm Thermo</td><td>Scientific</td><td>130181</td><td>pour hacher les tissus</td></tr><tr><td>Sulfate d’alun de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>coloration de la glande mammaire monture entière lames</td></tr><tr><td>Vaporisateur d’anesthésie à usage vétérinaire</td> <td>-</td><td></td> <td>suivre le protocole institutionnel</td></tr><tr><td>Bêta-dine ou iode</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tube de culture en verre borosilicaté pour l’homogénéisation</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>pour l’homogénéisation du cerveau (utiliser un tube approprié pour l’homogénéisateur)</td></tr> <tr><td>Carmin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>coloration de la glande mammaire Lames de montage entier</td></tr><tr><td>Appareil de comptage</td> <td>cellulaire</td> <td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Nettoyer les cages d’animaux pour la récupération</td> <td>-</td><td>-</td> <td>suivre le protocole institutionnel</td></tr><tr><td>Collagénase Type 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004183</td><td>digestion enzymatique de tissus de glandes mammaires hachés de rats donneurs</td></tr><tr><td>d’eau désionisée</td> <td>-</td><td></td> <td>pour solutions chimiques</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>pour hacher les tissus, milieux de digestion de la collagénase et remettre en suspension les mélanges de cellules épithéliales</td></tr><tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>mélange de monodispersion</td></tr><tr><td>Éthanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>fixateur de lames mammaires entières, lavages de lames mammaires entières, nettoyage des sites d’incision chirurgicale (dilué)</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Solution d’inactivation</td><td></td> <td>d’hyclone</td></tr> <tr><td>Gaze</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>utilisation pour fixateur de lames mammaires entières (acide acétique glaciaire 1:4 dans 100 % d’éthanol)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>mélange monodispersion</td></tr><tr><td>Coussins chauffants</td><td>-</td><td>-</td><td>suivre le protocole institutionnel</td></tr><tr><td>Seaux à glace (x2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur avec rotation orbitale</td><td>-</td><td>-</td><td>doit être capable de maintenir 37&deg ; C, agitation à 220-225 tr/min (pour la digestion de la collagénase du tissu mammaire)</td></tr><tr><td>Anesthésie à l’isoflurane</td><td>-</td><td>-</td><td>suivre le protocole institutionnel</td></tr><tr><td>Microscope optique ou appareil photo numérique</td><td>-</td><td>-</td><td>visualisation de l’épithélium mammaire monté entier et/ou acquisition d’images</td></tr><tr><td>Homogénéisateur mécanique</td><td>Fisher</td><td></td> <td>Scientific-TissueMiser ou modèles alternatifs</td></tr><tr><td>Huile minérale, pure</td><td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>stockage à long terme de la glande mammaire nettoyée montages entiers</td></tr><tr><td>Réservoirs d’oxygène pour vaporisateur d’anesthésie</td><td></td> <td>-</td> <td>suivre le protocole institutionnel</td></tr><tr><td>Serviettes en papier ou lingettes délicates</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope chargées positivement</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>supports entiers de tissu de la glande mammaire</td></tr><tr><td>Postopératoire analgésique</td> <td>-</td><td></td> <td>Protocole institutionnel</td></tr><tr><td>Balance</td><td></td><td></td><td>Mesures du poids corporel des animaux, dosage approprié des analgésiques</td></tr><tr><td>Rasoir</td> <td>-</td><td></td> <td>tondeuses électriques ou autres</td></tr><tr><td>Bocaux de coloration</td><td></td> <td>-</td> <td>minimum de 1 par lavage chimique, taille appropriée pour le nombre de lames, verre préféré</td></tr><tr><td>Champs stériles</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>utilisés lors de la transplantation</td></tr><tr><td>Ciseaux stériles et pinces x3 (autoclavés)</td><td>-</td><td>-</td><td>outils chirurgicaux autoclaves utilisés pour les donneurs et les receveurs</td></tr><tr><td>Seringues : 5 mL (ou plus)</td><td>-</td><td>-</td><td>pour la filtration stérile des milieux de digestion de la collagénase</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Mélange monodispersique Worthington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réceptacle de collecte des déchets pour liquides (coulés ou aspirés)</td><td>- </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur de clip de plaie, clips et outil de retrait</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>Fermeture de l’incision cutanée sur le tampon interscapulaire blanc</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>nettoyage de la glande mammaire lames de montage entier après coloration</td></tr></tbody></table>

transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Dès les années 1970, les chercheurs ont réussi à transplanter des cellules épithéliales mammaires dans la coussinet de graisse blanche interscapulaire des rats. La greffe de l’épithélium mammaire à l’aide de techniques de transplantation tire parti de l’environnement hormonal fourni par l’hôte rongeur adolescent. Ces études sont idéalement adaptées pour explorer l’impact de diverses manipulations biologiques sur le développement des glandes mammaires et disséquer de nombreux aspects de la biologie des glandes mammaires. Une caractéristique commune, mais limitante, est que les cellules épithéliales transplantées sont fortement influencées par le stroma environnant et surpassées en concurrence par l’épithélium endogène ; pour employer le tissu mammaire indigène, le tampon blanc abdominal-inguinal de graisse doit être dégagé pour enlever l’épithélium mammaire d’hôte avant la transplantation. Un obstacle majeur lors de l’utilisation de l’organisme modèle de rat est que le dégagement de l’arbre mammaire en développement chez les rats post-soudés n’est pas efficace. Une fois transplantées dans des garnitures sans glande, les cellules épithéliales de distributeur peuvent repeupler le tampon de graisse d’hôte dégagé et former une glande mammaire fonctionnelle. Le tampon de graisse interscapulaire est un endroit alternatif pour ces greffes. Un avantage majeur est qu’il manque de structures canalaires mais fournit le stroma normal qui est nécessaire pour favoriser la croissance épithéliale et est facilement accessible chez le rat. Un autre avantage majeur de cette technique est qu’elle est peu invasive, car elle élimine la nécessité de cautériser et d’enlever l’arbre mammaire endogène en croissance. En outre, le tampon de graisse interscapulaire contient un vaisseau sanguin médial qui peut être utilisé pour séparer les sites pour la greffe. Puisque les glandes endogènes restent intactes, cette technique peut également être employée pour des études comparant la glande mammaire endogène à la glande transplantée. Cet article décrit la méthode de la transplantation épithéliale de cellules mammaires dans le tampon blanc interscapulaire de graisse des rats.

Glandes mammaires de donneur et de receveur Les étapes pour isoler et préparer les cellules épithéliales mammaires de rat pour la transplantation sont montrées dans la figure 1A. À l’âge de 4 semaines, la glande mammaire endogène du rat donneur a commencé la maturation et l’épithélium peut être visualisé sur des lames montées entières tachées de carmin d’alun (Figure 1</str...

Cet article décrit une méthode de transplantation pour greffer les cellules épithéliales mammaires de rat de distributeur dans le tampon blanc interscapular de graisse des animaux destinataires. Cette méthode peut être utilisée pour examiner les effets de l’hôte et/ou du donneur sur le développement de l’épithélium mammaire et élimine le besoin de pré-compensation, étendant ainsi l’utilité de cette technique.

Transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Ce protocole a été utilisé pendant plus de 40 ans et reste la seule méthode fiable pour les analyses de transplantation de cellules mammaires chez le rat. Cette méthode est largement utilisée pour interroger les effets autonomes des cellules mammaires par rapport à l’hôte dans la recherche sur la susceptibilité au cancer du sein. En greffant dans la graisse interscapulaire, cette méthode contourne l’épithélium de la membrane endogène qui n’est pas efficace chez les rats.La méthode est donc moins invasive et les glandes mammaires endogènes peuvent être utilisées comme contrôle interne. Pour commencer cette procédure, placez un rat femelle euthanasié sur son dos et fixez-le avec des broches. Pulvériser toute la surface ventrale avec 70% d’éthanol.Faire une incision sagittale en forme de Y permettant l’accès aux glandes mammaires thoraciques, abdominales et inguinales. Utilisez des ciseaux pour disséquer tout le tissu mammaire de la glande du rat donneur et enlever tous les ganglions lymphatiques visibles. Ensuite, utilisez des forceps pour extraire le tissu mammaire.Placez-le dans un plat étiqueté de 60 millimètres contenant 500 microlitres de dmem F12 sans sérum et gardez-le sur la glace. Ensuite, utilisez des ciseaux pour hacher finement le tissu mammaire. Tout d’abord, retournez soigneusement le corps de l’animal donneur pour le placer dans une position couchée et fixez-le avec des broches.Vaporiser la tête et le haut du dos avec 70% d’éthanol. Localiser la base du crâne et faire une incision sous les condyles occipital, insérer des ciseaux pointus sous la peau et couper la peau loin du crâne, y compris les côtés de la tête. Ensuite, utilisez des coupeurs d’os ou des ciseaux solides pour couper le crâne le long de la ligne médiane de l’occipital aux os frontaux tout en s’assurant de garder la lame aussi superficielle que possible et inclinée vers le haut pour empêcher la destruction du tissu cérébral sous-jacent.Utilisez rongeurs ou des forceps forts pour éplucher l’os. Insérez l’outil latéral au cervelet pour briser l’os de chaque côté. Couper les connexions aux méninges en exposant pleinement le canal auditif.Utilisez des forceps incurvés à pointe fine pour soulever le cerveau hors du crâne et enregistrer son poids. Utilisez un nouveau départ de fournitures pour d’autres cerveaux donneurs. Transférez-le immédiatement dans un tube de 15 millilitres contenant une quantité égale de supports stockés sur la glace.Homogénéiser le cerveau pendant 10 à 15 secondes à basse vitesse. Filtrez ensuite l’homogénéité pour enlever les gros morceaux. Conserver le liquide sur la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.D’abord, coupez un centi mètre de l’extrémité d’une pointe de pipette de 1000 microlitres et placez-la manuellement sur le pipettor. Utilisez une pointe de pipette coupée pour transférer le tissu donneur haché de chaque plat de 60 millimètres au tube de digestion de collagène. Mélanger délicatement le tissu haché en le pipetting de haut en bas une à deux fois.Ensuite, fixez les échantillons en position horizontale dans l’incubateur qui tremble. Laissez les échantillons digérer pendant 1,5 à 2 heures à 37 degrés Celsius tout en secouant à une vitesse comprise entre 200 et 220 RPM. Lorsque le tissu mammaire de la glande donneuse est entièrement digéré, centrifuger la suspension à 1 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Après s’être assuré qu’une pastille s’est formée, utilisez une pipette pour enlever la couche de graisse ou versez soigneusement le supernatant. Resuspendez doucement la pastille en 10 millilitres de dmem F12 frais. Répétez ce processus pour bien laver les cellules.Préparer un tube de 50 millilitres à l’aide d’une passoire de 40 micromètres pour chaque animal donneur. Pré-mouiller la passoire avec au moins un millilitre de DMEM F12 médias. Ensuite, utilisez une pipette pour passer la suspension cellulaire à travers le filtre pour recueillir des fragments ductal ou organoïdes.Pour les organoïdes, ne gardez que les cellules qui restent dans le filtre. Inverser la passoire cellulaire sur un nouveau tube de 50 millilitres et rincer avec n’importe quel volume de médias stériles nécessaires pour recueillir toutes les cellules. Après cela, pelleter les cellules une fois de plus et resuspendre dans un petit volume de médias pour le comptage.Préparez des lots simples de matériel de donneur pour tous les receveurs de greffe en combinant des volumes égaux de la suspension cellulaire avec 50% d’homogénéité cérébrale pour chaque site de transplantation. Tout d’abord, identifier la base du crâne et le début de la colonne vertébrale sur un animal receveur. Environ un tiers du chemin vers le bas de la colonne vertébrale, raser une zone de trois centimètres par deux centimètres sur la partie thoracique supérieure du dos.Ensuite, préparez le champ stérile qui sera utilisé pour la chirurgie et organiser toutes les fournitures nécessaires. Rincer les seringues Hamilton avec des supports DMEM F12 stériles pour éviter la perte de cellules. Chargez l’ensemble du volume de matériel de donneur dans une seringue séparée pour chaque condition.Une fois la seringue complètement chargée, inversez-la et appuyez légèrement sur le piston pour enlever les bulles d’air à l’extrémité de l’aiguille. Gardez la seringue sur la glace tout au long de l’intervention. Assurez-vous que l’animal ne réagit toujours pas aux stimuli profonds avec un pincement ferme des pieds.Ensuite, utilisez une lame chirurgicale tranchante pour faire une petite incision interscapulaire. Localisez le vaisseau sanguin médial pour l’orientation et utilisez des forceps pour soulever la peau d’un côté de l’incision. Tenez la peau à l’écart de la graisse et évitez la graisse brune sous-jacente pendant que la greffe est effectuée.Ensuite, insérez l’aiguille dans le site de la greffe. Injectez soigneusement 40 microlitres du mélange cellulaire dans le tissu interscapulaire de la adipeuse blanche. Retirez l’aiguille lentement.Maintenez le tissu en place et laissez les cellules transplantées se contenter de trois à cinq secondes. Répétez l’ensemble de la procédure d’injection telle qu’elle a été décrite précédemment au deuxième site de transplantation. Après cela, fermez la plaie chirurgicale à l’aide de pinces à plaies ou de sutures, puis interrompez l’anesthésie.Après avoir sacrifié l’animal, préparez-le à la dissection. Identifiez le vaisseau sanguin médial qui sépare les emplacements de greffe dans le tampon interscapulaire de graisse. Exciser l’ensemble de la garniture comme un seul morceau de tissu.Placez le tissu sur une lame de microscope chargée positivement pour la monture entière. Placez les glissières dans 70% d’éthanol pendant sept à dix jours pour dé grossir le tissu. Ensuite, préparez la tache d’alun carmin et traiter les diapositives lorsque le tissu est suffisamment opaque.Lorsque le traitement est terminé et que le tissu de la diapositive a été effacé, utilisez une microscopie légère de faible puissance ou une photographie numérique haute résolution pour acquérir des images des diapositives aux fins d’analyse. Dans cette étude, les cellules épithéliales mammaires sont transplantées à l’aide d’une technique optimisée pour travailler avec les rats où les organoïdes épithéliales mammaires isolés des rats donneurs sont greffés dans la graisse blanche interscapulaire des rats receveurs. La présence, l’absence ou l’abondance de l’épithélium peuvent être évaluées pour déterminer le succès de l’expérience ainsi que l’autonomie des effets liés aux variables expérimentales.Une expérience de transplantation réciproque où chaque facteur a deux niveaux tels que le type sauvage contre KO créera quatre groupes de transplantation pour l’essai d’hypothèse. L’ensemble représentatif monté coussin de graisse interscapulaire montré ici contient l’excroissance épithéliale positive aux deux emplacements de la transplantation. Lors de l’analyse des diapositives, le manque d’épithélium dans le tampon de graisse interscapulaire sur de nombreux échantillons peut indiquer un problème technique avec la procédure et doit être traité comme un résultat négatif.L’excroissance épithéliale du donneur peut également être comparée à la glande mammaire endogène et peut faciliter des conclusions supplémentaires. Dans l’exemple montré ici, les résultats de la transplantation réciproque utilisant le type sauvage et les rats de KO de CDKN1B ont suggéré des effets autonomes non mammaires de cellules sur le développement mammaire de glande. N’oubliez pas que les cellules épithéliales et organoïdes des donneurs doivent être préparés avec soin et maintenus en vie jusqu’à ce qu’ils soient injectés dans l’animal receveur.Il est impératif de planifier à l’avance et d’effectuer la procédure avec soin et sans interruption. Des analyses primaires de carcinogenèse peuvent être exécutées après transplantation pour interroger l’autonomie mammaire de cellules dans l’étiologie ou le traitement du cancer du sein. L’édition génétique peut également être incorporée pour concevoir génétiquement les cellules donneuses ou le rat receveur.Comme seule méthode d’exécution de la transplantation mammaire de cellules épithéliales chez les rats, cette procédure facilite le développement de glande mammaire aussi bien que des études de carcinogenèse. Cette technique est particulièrement importante pour la recherche sur les interactions entre les cellules cancéreuses du sein et/ou les cellules épithéliales mammaires avec le microenvironnement hôte. Il permet des études dans le développement des glandes mammaires ainsi que la recherche sur le cancer du sein.Ceux qui tentent cette technique pour la première fois devraient optimiser les préparations cellulaires des donneurs afin d’assurer un rendement et une viabilité cellulaires maximaux, puis effectuer de petites expériences pilotes pour pratiquer des interventions chirurgicales et déterminer le nombre de cellules à injecter et déterminer les temps d’incubation post-chirurgicaux requis pour les expériences.

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Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d'une préparation tissulaire complète pour l'observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.

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Ici, nous présentons un protocole visant à implanter des cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de manière simple, façon invasive et facile à manipuler, moins et ce modèle murin orthotopique breast cancer avec un environnement approprié coussinets adipeux mammaire peut être utilisé pour étudier divers aspects de la cancer.

Orthotopique l’Injection de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de souris

Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les modèles murins génétiquement modifiés transplantables récapitulent fidèlement les maladies humaines et sont des modèles préférés pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer du sein. Ici, une méthode est décrite pour transplanter orthotopiquement des fragments de tumeur mammaire dans le coussinet adipeux mammaire afin d’étudier la biologie tumorale et d’évaluer la réponse médicamenteuse.

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

Les modèles précliniques évaluant la thérapie adjuvante ciblant les métastases du cancer du sein sont insuffisants. Pour remédier à cela, nous avons développé un modèle murin de métastases de l'adénocarcinome mammaire pulmonaire de novo , dans lequel les thérapies administrées dans le milieu adjuvant (résection post-chirurgicale des tumeurs primaires) peuvent être évaluées en fonction de l'impact sur les métastases pulmonaires préalablement ensemencées.

Procédures chirurgicales et méthodologie pour un modèle murin préclinique de De Novo Métastase du cancer mammaire

Découvrez la greffe de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon adipeux blanc interscapulaire. Cette méthode éprouvée depuis plus de 40 ans permet d'étudier les effets autonomes des cellules mammaires versus l'hôte en recherche sur le cancer du sein.

Transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse

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