Name: Analyse du SSHHP Viral du Groupe IV utilisant des méthodes in vitro et in Silico (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez l'analyse des SSHHPS viraux du Groupe IV par des méthodes in vitro et in silico. Ce protocole permet d'identifier les séquences ciblées par les protéases virales pour étudier les interactions hôte-pathogène.

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Ce travail a été soutenu par les numéros de projet CB-SEED-SEED09-2-0061 et CBCall4-CBM-05-2-0019, et en partie par le programme de recherche intra-muros/extra-muros des fonds de base du NCATS, des NIH (XH) et du Naval Research Laboratory.

Les opinions exprimées ici sont celles des auteurs et ne représentent pas celles de la marine américaine, de l'armée américaine, du ministère de la Défense des États-Unis ou du gouvernement américain.

La destruction spécifique à la séquence d'une protéine ou d'un acide nucléique guidée par une séquence étrangère n'est observée que dans quelques cas en biologie. Les mécanismes indiqués à la figure 1 sont des mécanismes défensifs qui protègent un hôte contre un virus ou un virus d'un hôte.
En utilisant des méthodes bioinformatiques, nous pouvons identifier les cibles qui sont détruites par ces systèmes. Dans nos analyses des séquences de SSHHP, nous avons découvert que beaucoup d'entre eux pourraient être trouvés dans les protéines nécessaires pour générer des réponses immunitaires innées. Certains avaient des rôles évidents tels que MAVS et TRIF (adapton adaptateur-contenant le domaine TIR-induisant l'interféron-MD), tandis que d'autres étaient liés à l'immunité bien que des mécanismes plus complexes (par exemple, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. L'information cible stockée dans la séquence SSHHP a le potentiel d'identifier les voies qui ont des effets antiviraux contre ces virus. Les réponses antivirales in vivo sont souvent spécifiques au virus26,43. Par exemple, les sous-ensembles de protéines TRIM ont des effets antiviraux sur différents virus43,44,45, certains sont des facteurs de restriction virale (par exemple, le VIH et TRIM5). La spécificité des protéines TRIM (70 ont été identifiées) est encore à l'étude44,45. L'information contenue dans le SSHHPS peut contribuer à notre compréhension de la façon dont ces virus échappent aux réponses immunitaires innées. D'autres modèles et corrélations peuvent être découverts au fur et à mesure que l'on examine davantage le SSHHPS.
Des différences propres aux espèces étaient évidentes dans nos analyses (Figure 2, Figure 10). Ces virus sont connus pour affecter certaines espèces plus que d'autres. Des informations sur la portée de l'hôte, la susceptibilité de l'hôte et les défenses d'hôte peuvent être présentes au sein du SSHHPS. Par exemple, l'équidé, l'espèce la plus sensible aux virus de l'encéphalite équine, n'avait pas la région de TRIM14 humain qui a été coupée transitoirement par la protéase VEEV nsP2. Les humains meurent rarement des infections de VEEV mais peuvent être infectés24. La protéine humaine TRIM14 portait une séquence de clivage de protéase nsP26. La présence du site de clivage suggère que les humains ont un mécanisme de défense contre ces virus. On a pensé que les oiseaux étaient des réservoirs potentiels de ces virus46. La séquence SSHHP correspondante dans la protéine TRIM14 des poulets différait des séquences trouvées chez l'homme et d'autres espèces. Des différences subtiles comme celles-ci peuvent rendre une protéine hôte cible oncleavable ou plus facilement clivée. Aguirre et coll.16 ont montré qu'une protéine STRING mutée oncleavable induit des niveaux plus élevés d'IFN après l'infection par le virus de la dengue et que les souris portent naturellement une version de STING qui n'est pas coupée par la protéase dengue ns2B3. La protéine murine STING n'a pas été coupée par la protéase ZIKV47. Dans notre analyse SSHHPS, nous avons également observé des différences dans les séquences du site de clivage de protéase ZIKV lorsque nous avons comparé les protéines humaines avec celles des rongeurs6 (Figure 10D). La reproduction des clivages protéolytiques spécifiques aux espèces des protéines hôtes peut être importante dans les modèles animaux utilisés pour les virus du groupe IV. L'inhibition du clivage protéique hôte a également des implications en ce qui concerne le développement des inhibiteurs de la protéase du groupe IV. Dans notre publication précédente, nous avons montré que nous pouvions inhiber trim14 clivage par la protéase VEEV nsP2 en utilisant CA074 ester méthyle6. Ce résultat suggère que les inhibiteurs de petite molécule de ces protéases puissent moduler les réponses immunitaires innées qui sont capables de supprimer l'infection6,31.
La variation génétique au sein d'une espèce a également le potentiel de produire des différences dans le clivage protéolytique. Les différences subtiles dans l'utilisation de codon pourraient affecter la pause ribosome48. Étant donné que certaines protéases virales du groupe IV sont intégrées dans la membrane des urgences, les différences dans ces pauses pourraient affecter le clivage d'une cible si le clivage se produit de façon co-traduite. Certains des sites de clivage que nous avons identifiés se trouvaient dans des séquences de peptides de signal prévues (p. ex., SFRP1) tandis que d'autres étaient internes.
L'analyse SSHHPS peut produire des informations qui diffèrent des autres méthodes d'analyse des protéines hôtes. L'analyse Du SSHHPS était peu coûteuse et facile à employer. L'utilisation d'un système d'expression bactérienne a permis de tester des segments courts (25 acides aminés) de séquences de mammifères sans l'utilisation de la culture cellulaire des mammifères. Nous avons constaté que les substrats CFP-YFP étaient capables de tolérer toutes les séquences de protéines humaines testées; cependant, les rendements variaient. Dans des essais semblables, des substrats contenant des séquences de protéine humaine aussi longtemps que 63 acides aminés ont été avec succès exprimés, purifiés, et utilisés pour des analyses cinétiques et le criblage d'inhibiteur49,50,51. Étant donné que seules de petites quantités du substrat sont nécessaires pour l'analyse discontinue, un grand nombre de cibles peuvent être explorées. L'un des avantages du système est que les substrats CFP/YFP peuvent être utilisés pour des analyses SDS-PAGE et pour des analyses cinétiques plus élaborées (c.-à-d., IC50, Ki, Km, Vmax). Pour la découverte de médicaments, les composés inhibiteurs peuvent produire des artefacts dans des analyses fluorescentes. Ainsi, l'essai discontinu en combinaison avec un essai continu permet de confirmer le clivage ou l'inhibition du clivage. Les échantillons pour l'analyse discontinu SDS-PAGE peuvent être prélevés directement sur les plaques de 96 puits. Les substrats CFP/FpJ ont été utilisés pour le dépistage des bibliothèques composées52. Cependant, des analyses supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si un substrat convient au dépistage à haut débit, comme le calcul d'un facteur Z53.
L'un des défis de la conception d'un substrat est d'identifier la région autour du lien scissile qui est lié et reconnu par la protéase. Dans les exemples présentés ici, nous avons commencé avec 12 séquences de résidus qui ont été centrées autour du lien scissile. Après avoir analysé les alignements de séquence des sites de clivage homologie aux résidus N-terminal du lien scissile a été trouvé pour la protéase VEEV, tandis que pour l'homologie de protéase ZIKV à plusieurs des résidus C-terminal a été trouvé. Un modèle in silico du substrat amarré peut être utilisé pour concevoir des expériences de mutagénèse dirigées par le site qui sondent les sites de liaison du substrat. Puisque le substrat et les séquences d'enzymes sont sur des plasmides, l'un ou l'autre peut être muté pour tester les modèles en silico ou les tolérances de sous-site. Cela peut être avantageux si une structure cristalline du substrat lié n'est pas disponible.
L'analyse du SSHHPS peut également fournir de nouvelles informations sur les mécanismes par lesquels les phénotypes induits par le virus sont produits par des enzymes virales. Une des cibles ZIKV, SFRP1, fait partie de la voie de signalisation Wnt et a des rôles dans le développement du cerveau et des yeux et dans les réponses immunitaires36,37,54,55,56,57. Nous avons constaté que les autres séquences protéiques qui pourraient être coupées par la protéase ZIKV ns2B/ns3 étaient également dans les protéines impliquées dans le développement du cerveau et des yeux; des anomalies dans les deux ont été observées dans le syndrome congénital de Zika et sont vraisemblablement pour faire partie du phénotype58virus-induit.
La prévisibilité des interactions hôte-pathogène pourrait être exploitée pour une variété d'applications : thérapies virales oncolytiques spécifiques à la cible; la réduction du risque des vaccins contre les virus vivants; le raffinement, la prédiction ou la sélection des modèles animaux; prédiction de la portée ou de la susceptibilité de l'hôte; prévision des événements zoonotiques; et la prédiction des défenses d'hôte. Étant donné que les méthodes décrites sont basées sur des séquences, elles peuvent être d'une valeur à intégrer dans le logiciel à l'avenir.

Les preuves de transfert horizontal de gènes d'un virus à l'hôte, ou d'un hôte à un virus, peuvent être trouvées dans une variété de génomes1,2,3,4. Des exemples d'endogène virale sont les séquences de l'espaceur CRISPR trouvées dans les génomes de l'hôte bactérien4. Récemment, nous avons trouvé des preuves de séquences de protéines hôtes incorporées dans les polyprotéines non structurelles des virus du groupe IV de l'ARNd. Ces séquences dans les régions codantes du génome viral peuvent être propagées de génération en génération. Les courtes étendues de séquences de protéines homologues hôte-pathogène (SSHHPS) se trouvent dans le virus et l'hôte5,6. SSHHPS sont les séquences de motif de site de clivage conservés reconnues par les protéases virales qui ont l'homologie aux protéines hôtes spécifiques. Ces séquences dirigent la destruction de protéines hôtes spécifiques.
Dans notre publication précédente6, nous avons compilé une liste de toutes les protéines hôtes qui ont été ciblées par les protéases virales et a constaté que la liste des cibles n'était pas aléatoire (tableau 1). Deux tendances étaient évidentes. Tout d'abord, la majorité des protéases virales qui ont coupé les protéines de l'hôte appartenaient à des virus du groupe IV (24 des 25 cas concernaient des protéases virales du groupe IV), et une protéase appartenait aux rétrovirus du groupe VI (VIH, virus de l'immunodéficience humaine)7. Deuxièmement, les cibles de protéine d'hôte étant coupées par les protéases virales ont été généralement impliquées en générant les réponses immunitaires innées suggérant que les clivages étaient destinés à contrarier les réponses immunitaires de l'hôte. La moitié des protéines hôtes visées par les protéases virales étaient des composants connus des cascades de signalisation qui génèrent de l'interféron (IFN) et des cytokines proinflammatoires(tableau 1). D'autres ont été impliqués dans la transcription de cellule hôte8,9,10 ou la traduction11. Fait intéressant, Shmakov et coll.4 ont montré que de nombreuses séquences protospacer CRISPR correspondent à des gènes impliqués dans la conjugaison ou la réplication du plasmide4.
Le groupe IV comprend, entre autres, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae et Togaviridae. Plusieurs pathogènes nouveaux et émergents appartiennent au groupe IV, comme le virus Zika (ZIKV), le Nil occidental (VNO), le chikungunya (CHIKV), le virus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et le virus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS). Le génome de l'ARNm est essentiellement un morceau d'ARNm. Pour produire les enzymes nécessaires à la réplication du génome, le génome de l'ARNmdoit doit d'abord être traduit. Dans les alphavirus et autres virus du groupe IV, les enzymes nécessaires à la réplication sont produites en une seule polyprotéine (c.-à-d., nsP1234 pour VEEV). La polyprotéine non structurelle (nsP) est traitée protéolytiquement (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) par la protéase nsP2 pour produire des enzymes actives12 (figure 1). Le clivage de la polyprotéine par la protéase nsP2 est essentiel pour la réplication virale; ceci a été démontré par la suppression et la mutagénèse site-dirigée de la cystéine active de site de la protéase nsP213,14. Notamment, la traduction des protéines virales précède les événements de réplication du génome. Par exemple, nsP4 contient la polymérase d'ARN dépendante de l'ARN nécessaire pour reproduire le génome de l'ARNsde. La réplication du génome peut produire des intermédiaires dsRNA; ces intermédiaires peuvent déclencher les réponses immunitaires innées de l'hôte. Ainsi, ces virus peuvent couper l'hôte des protéines de réponse immunitaire innées au début de l'infection afin de supprimer leurs effets15,16,17.
Le silençage peut se produire au niveau de l'ADN, de l'ARN et des protéines. Ce qui est commun à chacun des mécanismes de silençage montrés dans la figure 1, c'est que de courts séquences d'ADN, d'ARN ou de protéines étrangères sont utilisées pour guider la destruction de cibles spécifiques afin de contrarier leur fonction. Les mécanismes de silence sont analogues aux programmes de « recherche et suppression » qui ont été écrits en trois langues différentes. La courte séquence du site de clivage est analogue à un « mot clé ». Chaque programme a une enzyme qui reconnaît la correspondance entre la séquence courte (le «mot clé») et un mot dans le «fichier» qui doit être supprimé. Une fois qu'une correspondance est trouvée, l'enzyme coupe (« supprime ») la séquence cible plus grande. Les trois mécanismes présentés à la figure 1 sont utilisés pour défendre l'hôte contre les virus ou pour défendre un virus contre le système immunitaire d'un hôte.
Les protéases virales reconnaissent les courtes séquences de motifs de site de clivage entre les acides aminés de 2-11 ; dans les nucléotides, cela correspondrait à 6-33 bases. À titre de comparaison, les séquences d'espaceurs CRISPR sont des nucléotides de 26 à 72 et les ARNi sont des nucléotides de 20-2218,19. Bien que ces séquences soient relativement courtes, elles peuvent être reconnues spécifiquement. Compte tenu de la plus grande diversité d'acides aminés, la probabilité d'un événement de clivage aléatoire est relativement faible pour une protéase virale reconnaissant des séquences protéiques de 6-8 acides aminés ou plus. La prédiction du SSHHPS dans les protéines hôtes dépendra en grande partie de la spécificité de la protéase virale examinée. Si la protéase a des exigences strictes de spécificité de séquence la chance de trouver une séquence de site de clivage est 1/206 - 1 dans 64 millions ou 1/208 - 1 dans 25.6 milliards ; cependant, la plupart des protéases ont des tolérances sous-sites variables (p. ex., R ou K peuvent être tolérés sur le site S1). Par conséquent, il n'y a aucune exigence d'identité de séquence entre les séquences trouvées dans l'hôte par rapport au virus. Pour les protéases virales qui ont des exigences de séquence plus lâches (comme celles appartenant à Picornaviridae), la probabilité de trouver un site de clivage dans une protéine hôte peut être plus élevée. Bon nombre des inscriptions au tableau 1 proviennent de la famille Picornaviridae.
Schechter et Berger notation20 est couramment utilisé pour décrire les résidus dans un substrat de protéase et les sous-sites auxquels ils se lient, nous utilisons cette notation tout au long. Les résidus dans le substrat qui sont N-terminal de la liaison scissile sont désignés comme P3-P2-P1 tandis que ceux qui sont C-terminal sont désignés comme P1'-P2'-P3'. Les sous-sites correspondants dans la protéase qui lient ces résidus d'acides aminés sont S3-S2-S1 et S1'-S2'-S3', respectivement.
Pour déterminer quelles protéines hôtes sont ciblées, nous pouvons identifier Le SSHHPS dans les sites de clivage polyprotéine virale et rechercher les protéines hôtes qui les contiennent. Ici, nous dénoncons des procédures pour identifier SSHHPS utilisant les séquences connues de site de clivage de protéase virale. Les méthodes bioinformatiques, les essais de protéase, et dans les méthodes de silico décrites sont destinées à être utilisées en conjonction avec des essais cellulaires.
Les alignements séquences des protéines hôtes ciblées par les protéases virales ont révélé des différences spécifiques aux espèces au sein de ces courtes séquences de sites de clivage. Par exemple, la protéase nsP2 du virus de l'encéphalite équine vénézuélienne (VEEV) a été trouvée pour couper trim14 humain, un motif tripartite (TRIM) protéine6. Certaines protéines TRIM sont des facteurs de restriction virale (par exemple, TRIM521), la plupart sont considérés comme des ligases e3 d'ubiquitine. TRIM14 n'a pas de ring (vraiment intéressant nouveau gène) domaine et n'est pas considéré comme un E3 ligase22. TRIM14 a été proposé pour être un adaptateur dans le signalosome antiviral mitochondrial (MAVS)22, mais peut avoir d'autres fonctions antivirales23. L'alignement des séquences TRIM14 de diverses espèces montre que les équidés n'ont pas le site de clivage et abritent une version tronquée de TRIM14 qui manque le domaine C-terminal PRY/SPRY. Ce domaine contient un site de polyubiquitination (Figure 2). Chez les équines, ces virus sont très mortels (mortalité de 20 à 80 %) alors que chez l'homme, seulement 1 % meurent des infections à VEEV24. Le clivage du domaine PRY/SPRY peut court-circuiter transitoirement la cascade de signalisation MAVS. Cette cascade peut être déclenchée par dsRNA et conduit à la production d'interféron et de cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, la présence du SSHHPS peut être utile pour prédire quelles espèces ont des systèmes de défense contre des virus spécifiques du groupe IV.
Dans les virus du groupe IV, on pense que les mécanismes d'antagonisme de l'IFN se multiplient redondants25. Le clivage protéique hôte peut être transitoire pendant l'infection et les concentrations peuvent se rétablir avec le temps. Nous avons constaté dans les cellules que les produits de clivage TRIM14 pouvaient être détectés très tôt après la transfection (6 h) avec un plasmide codant la protéase (promotrice de cytomégalovirus). Cependant, à de plus longues périodes, les produits de clivage n'ont pas été détectés. Dans les cellules infectées par le virus, la cinétique était différente et les produits de clivage pouvaient être détectés entre 6-48 h6. D'autres ont rapporté l'apparition de produits de clivage de protéine d'hôte dès 3-6 h après l'infection9,11.
L'activité protéolytique dans les cellules est souvent difficile à attraper; les produits de clivage peuvent varier dans leur solubilité, concentration, stabilité, et durée de vie. Dans les analyses cellulaires, on ne peut pas supposer que les produits de clivage s'accumuleront dans une cellule ou que les intensités de la bande de protéines coupées et non coupées montreront des augmentations et des diminutions compensatoires, car la protéine coupée peut être dégradée très rapidement et ne peut pas être détectable dans une tache occidentale à un poids moléculaire prévu (MW) (p. ex., la région contenant l'épitope pourrait être coupée par d'autres protéases hôtes). Si le substrat de la protéase virale est une protéine de réponse immunitaire innée, sa concentration peut varier pendant l'infection. Par exemple, certaines protéines de réponse immunitaire innées sont présentes avant l'infection virale et sont induites davantage par l'interféron26. La concentration de la protéine cible peut donc fluctuer pendant l'infection et la comparaison des lysates cellulaires non infectés par rapport aux cellules infectées peut être difficile à interpréter. En outre, toutes les cellules peuvent ne pas être uniformément transfectées ou infectées. Les essais de protéase in vitro utilisant des protéines purifiées de E. coli d'autre part ont moins de variables pour lesquelles contrôler et de telles analyses peuvent être faites en utilisant SDS-PAGE plutôt que des immunoblots. Les protéases contaminantes peuvent être inhibées dans les premières étapes de la purification des protéines du substrat CFP/YFP, et les protéases virales mutées peuvent être purifiées et testées comme témoins pour déterminer si le clivage est dû à la protéase virale ou à une protéase bactérienne contaminante.
Une limitation des essais de protéase in vitro est qu'ils n'ont pas la complexité d'une cellule de mammifères. Pour qu'une enzyme coupe son substrat, les deux doivent être co-localisés. Les protéases virales du groupe IV diffèrent dans la structure et la localisation. Par exemple, la protéase ZIKV est incorporée dans la membrane du réticulum endoplasmique (ER) et fait face au cytosol, tandis que la protéase VEEV nsP2 est une protéine soluble dans le cytoplasme et le noyau27. Certaines des séquences de site de clivage trouvées dans l'analyse de ZIKV SSHHPS étaient dans des peptides de signal suggérant que le clivage pourrait se produire co-traductionnellement pour quelques cibles. Ainsi, l'emplacement de la protéase et le substrat dans la cellule doivent également être pris en compte dans ces analyses.
Les tests cellulaires peuvent être utiles pour établir un rôle pour la protéine hôte identifiée dans l'infection. Les méthodes qui visent à arrêter le clivage de protéase virale des protéines hôtes telles que l'ajout d'un inhibiteur de la protéase6 ou une mutation dans la cible hôte16 peuvent être utilisés pour examiner leurs effets sur la réplication virale. La surexpression de la protéine ciblée peut également affecter la réplication virale28. Les essais de plaque ou d'autres méthodes peuvent être utilisés pour quantifier la réplication virale.

<table><tbody><tr><td>Fiole Erlenmeyer de 250 mL</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>125472500</td><td>Danger : Toxicité aiguë. Ouvrez la bouteille dans la hotte pour éviter d’inhaler les fumées.</td></tr><tr><td>Fiole Erlenmeyer graduée à large col en Pyrex de 4 L avec bouchon à vis</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS49954L-1EA</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Prime Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0729-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTA XK 16/20 Colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>28988937</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-0.5 Unité de filtration</td><td></td><td></td> centrifuge Millipore Sigma UFC501096 <td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Unité de filtre centrifuge Millipore Sigma</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Danger : Réactions allergiques (cutanées ou respiratoires).</td></tr><tr><td>Sépharose chélatante à débit rapide</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0575-02</td><td>Une fois que la résine est équilibrée avec du sulfate de nickel 0,2 M, elle est désignée comme une colonne de nickel dans le texte. La colonne aura une couleur verte après le lavage à l’eau. La colonne aura une couleur bleue après l’équilibrage avec le tampon.</td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>RPI</td><td>C61000</td><td>Danger : Peut causer le cancer.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger Corning 50 mL</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Suggestion : Les tubes en polypropylène sont moins susceptibles de se fissurer lors de la sonication que les tubes en polyéthylène</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td><td>Corning</td><td>3993</td><td></td></tr><tr><td>Pinces de tube de dialyse</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de dessalage-10 jetable</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>RPI</td><td>D11000-50.0</td><td>Avertissement : Toxicité orale aiguë ; irritation de la peau et des yeux</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Boîtes de Pétri avec couvercle transparent</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>15892-0010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Acros Organics</td><td>301870010</td><td>Danger : Toxique, Irritant</td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &beta ;-D-thiogalactopyranoside</td><td>)Calbiochem (Millipore Sigma)</td><td>420291</td><td>Ne pas respirer la poussière. Évitez tout contact avec les yeux et la peau.</td></tr><tr><td>Laemmli Tampon d’échantillon</td><td>BIO-RAD</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Agar</td><td>Fluka (Millipore Sigma)</td><td>L3027-1KG</td><td>Suggestion : Autoclave avec agitateur magnétique dans le liquide, et remuer pendant le refroidissement. Attendez avant d’ajouter l’antibiotique jusqu’à ce que vous puissiez tenir vos mains sur la bouteille sans douleur pendant 30 secondes.</td></tr><tr><td>Luria Bertani Media</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L4919-5g</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorèse CellGel Box</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td><td>Nalgene (Thermo Scientific)</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick Innova 42R Shaker Incubateur</td><td>Eppendorf</td><td>M1335</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de nickel hexahydraté (cristallin/certifié ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>N73-500</td><td>Danger : Nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation, irritation de la peau et des yeux</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Chimiquement compétent E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C600003</td><td>Peut être nocif en cas d’inhalation ou d’ingestion. Peut provoquer une irritation de la peau et des yeux chez les personnes sensibles.</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chimiquement compétent E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C606003</td><td>Peut être nocif en cas d’inhalation ou d’ingestion. Peut provoquer une irritation de la peau et des yeux chez les personnes sensibles.</td></tr><tr><td>L’ADN plasmidique pet15b</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69661</td><td>GenScript Inc. a été utilisé pour la synthèse de l’ADN commercial. Le plasmide pet15b a été utilisé pour les substrats CFP/YFP.</td></tr><tr><td>pet32b</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69016-3</td><td>Le plasmide pet32b a été utilisé pour la construction de la cystéine protéase.</td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, sans EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32955</td><td>Avertissement : Corrosion/irrigation cutanée ; lésions oculaires</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Modèle M5</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Réactif d’extraction de protéines</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>70584-4</td><td>BugBuster ou Bper (Catalogue # 78248, ThermoFisher)</td></tr><tr><td>Q-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Résine échangeuse d’anions</td></tr><tr><td>RunBlue (12 %) 17 puits PAGE gels</td><td>Expedeon</td><td>BCG01227</td><td>Tout gel de polyacrylamide prémoulé à 12 % peut être utilisé</td></tr><tr><td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td><td>Expedeon</td><td>NXB50500</td><td>Diluez 50 mL avec 950 mL d’eau désionisée pour obtenir 1x</td></tr><tr><td>RunBlue Instant Blue Gel </td><td>Stain Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Ne pas diluer, utiliser comme indiqué</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td><td>Branson Ultrasonics (VWR)</td><td>N° de modèle 101-063-346R</td><td>Le sonicateur a été utilisé sur le niveau 5</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td><td>Spectrum Labs</td><td>132645T</td><td>Dialysis Tubing</td></tr><tr><td>SP-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Soins de santé</td><td>17-0729-01</td><td>Résine échangeuse de cations</td></tr><tr><td>Thrombine du plasma bovin</td><td>Sigma</td><td>T6634-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Attention : Irritant pour les yeux/la peau</td></tr></tbody></table>

analyse du sshhp viral du groupe iv utilisant des méthodes in vitro et in silico

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Les enzymes alphavirales sont synthétisées en un seul polypeptide. La polyprotéine non structurelle (nsP) est traitée par sa protéase de cystéine nsP2 pour produire des enzymes actives essentielles à la réplication virale. Les protéases virales sont très spécifiques et reconnaissent les séquences de motifs de site de clivage conservés (6-8 acides aminés). Dans plusieurs virus du groupe IV, les séquences de motifs du site de clivage nsP peuvent être trouvées dans des protéines hôtes spécifiques impliquées dans la génération des réponses immunitaires innées et, dans certains cas, les protéines ciblées semblent être liées au phénotype induit par le virus. Ces virus utilisent de courtes étendues de séquences de protéines homologues hôte-pathogène (SSHHPS) pour la destruction ciblée des protéines hôtes. Pour identifier SSHHPS les séquences virales de motif de clivage de clivage de protéase peuvent être entrées dans BLAST et les génomes d'hôte peuvent être recherchés. Le clivage peut d'abord être testé à l'aide des substrats purifiés de protéase virale nsP et de transfert d'énergie par résonance fluorescence (FRET) fabriqués dans E. coli. Les substrats FRET contiennent des protéines fluorescentes cyan et jaune et la séquence du site de clivage (CFP-séquence-YFP). Cet analyse de protéase peut être utilisé en continu dans un lecteur de plaque ou discontinu dans les gels SDS-PAGE. Des modèles des substrats de peptide liés peuvent être générés en silico pour guider la sélection des substrats et les études de mutagénèse. Des substrats CFP/YFP ont également été utilisés pour identifier les inhibiteurs de la protéase. Ces méthodes in vitro et in silico peuvent être utilisées en combinaison avec des tests cellulaires pour déterminer si la protéine hôte ciblée affecte la réplication virale.

L'analyse SSHHPS de la protéase ZIKV ns2B/3 a identifié 4 cibles protéiques hôtes : FOXG1, SFRP1, une sous-unitéalpha G d'une bibliothèque d'ADNc rétinienne, et la nt5M mitochondriale 5',3'-nucleotidase (Figure 10)6. Notamment, aucune autre méthode n'a prédit ces protéines comme cibles potentielles de la protéase ZIKV. Des mutations dans le gène FOXG1 ont été liées à un syndrome congénital caractérisé par le développement altéré et les anomalies structurales de cerveau telles que la microcéphalie. SFRP1 est une protéine sécrétée liée à la frisottis (SFRP); ces récepteurs solubles peuvent lier les ligands Wnt de façon compétitive pour contrarier et inhiber la signalisation Wnt. La voie de signalisation Wnt est impliquée dans la régulation de la réponse IFN pendant l'infection par flavivirus36. On s'attendrait à ce que le clivage de SFRP1 améliore la réplication de flavivirus. SFRP1 est également impliqué dans la différenciation Th17-cellule37. Les alignements de séquences du SSHHPS ont montré des différences spécifiques aux espèces dans les séquences des sites de clivage(figure 10D). La séquence de site de clivage dans SFRP1 était identique chez l'homme et les poulets ; ZIKV peut induire la mortalité et la microcéphalie dans les embryons de poulet38. Chez les rongeurs, les résidus de P1 hautement conservés (K/R)R-G sont remplacés par une glycine (RGG). Les souches immunocompétentes de souris sont généralement résistantes à l'infection et à la maladie de ZIKV39.
Les paramètres cinétiques à l'état stable et les constantes d'inhibition peuvent être mesurés pour les séquences virales de polyprotéines et pour les séquences de protéines hôtes en utilisant l'analyse continue dans un lecteur de plaque31,40,41 ( Figure11A). Pour les informations qualitatives de clivage, telles que le clivage d'une séquence particulière ou l'inhibition de la protéase par divers composés, l'analyse discontinue peut être utilisée (Figure 11B).
L'optimisation du nombre de résidus entre la PCP et le PFJ peut être nécessaire. Un modèle lié au substrat peut être fabriqué en utilisant les méthodes in silico. Un modèle à quai représentatif de la jonction nsP1/nsP2 est indiqué à la figure 9. Pour la protéase VEEV nsP2, le clivage d'une séquence de 12 acides séminés Semliki Forest Virus (SFV) avait été signalé (Km - 0,58 mM)33. L'allongement de la séquence du substrat à 19, 22 et 25 résidus et la réduction de la résistance ionique du tampon ont conduit à une réduction significative de Km. L'examen de la structure en cristal VEEV nsP2 et de l'emballage en cristal a également montré qu'une partie de l'une des jonctions était emballée contre le domaine de la protéase et était hélicoïdale. Ainsi, plus les substrats VEEV plus longs peuvent se lier mieux en raison de la reconnaissance d'un motif structurel secondaire.
Pour TRIM14, nous avons obtenu un Km '21 'M6,33. Le Km pour le substrat porteur de la séquence protéique hôte était comparable aux valeurs De Km des substrats contenant les séquences virales du site de clivage polyprotéine (Km(V12) - 12 M et Km(V34) - 21 M). Les séquences du site de clivage aux jonctions nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 et nsP3 ont été coupées avec des gains d'efficacité différents. Dans la cellule, on pense que cela permet le clivage séquentiel de la polyprotéine42.
Il faut faire preuve de prudence dans l'interprétation des résultats négatifs. Si aucun clivage ne se produit, le site de clivage peut être trop court ou la protéase purifiée peut être inactive. Pour les substrats qui sont coupés, des expériences supplémentaires sont nécessaires pour confirmer le clivage de la protéine pleine longueur ou le clivage dans les cellules infectées par le virus. Des expériences de suivi appropriées doivent être choisies. Les effets de la surexpression ou du silence de la protéine cible sur la réplication virale peuvent également être testés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figure 1 : Trois mécanismes de silence. Le silençage peut se produire au niveau de l'ADN, de l'ARN ou des protéines. Ces algorithmes de « recherche et suppression » utilisent chacun un « mot clé » pour diriger le clivage d'un fichier contenant le mot. Ce chiffre a été modifié à partir de Morazzani et coll.32 et des références qui s'y contonta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figure 2 : Différences spécifiques aux espèces dans les séquences de sites de clivage. Les domaines C-terminal PRY/SPRY des homologues TRIM14 sont indiqués dans l'alignement. Le domaine PRY/SPRY peut être identifié par les motifs conservés mis en évidence en gris. L'humain TRIM14 est coupé à QEAGA-G par la protéase de cystéine VEEV nsP2. La séquence SSHHP est affichée en couleur. Le résidu en vert est le résidu P1'; en bleu est le résidu P4, et en rouge sont d'autres résidus conservés dans la séquence de motif du site de clivage. L'équine abrite une version tronquée de TRIM14 dépourvue du domaine PRY/SPRY. La lysine mise en évidence dans le cyan est poly-ubiquitinated et est importante pour l'assemblage du signalosome de MAVS. Le domaine C-terminal PRY/SPRY peut être coupé transitoirement par la protéase nsP2 pour altérer la réponse antivirale de l'hôte intracellulaire ment pendant une infection virale aigue. En équine, ce domaine est toujours absent. Ceci suggère que le domaine PRY/SPRY de TRIM14 puisse avoir une fonction protectrice contre des infections de VEEV. Ce chiffre a été reproduit à partir de Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figure 3 : Identification SSHHPS à l'aide de BLAST. La séquence de motif du site de clivage à la jonction VEEV nsP1/nsP2 est alignée avec la séquence SSHHP dans la protéine hôte TRIM14. Le résidu coloré en vert est le résidu P1'; en bleu est le résidu P4 et en rouge sont d'autres résidus conservés de la séquence de motif du site de clivage. La plupart des alignements contenaient de l'homologie à des régions à l'extérieur du motif du site de clivage conservé ou n'incluaient pas les résidus de liaison scissile P1/P1. TRIM14 a montré une correspondance à 6 résidus dans l'ordre séquentiel qui comprenait P1 et P1 '. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figure 4 : Séquences protéiques et d'ADN du substrat CFP-V12-YFP pour la protéase de cystéine VEEV nsP2. Les sites de restriction NdeI (CATATG) et XhoI (CTCGAG) sont indiqués en majuscules. En rouge est la séquence du site de clivage de la polyprotéine virale qui se trouve entre nsP1 et nsP2. Le résidu en vert est le résidu P1' et en bleu est le résidu P4 du site de clivage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figure 5 : Séquence protéique de la construction de la protéase de cystéine Detrx-VEEV-nsP2. La thioredoxine (Trx) est représentée en jaune. Le site de clivage de thrombin e et son-tag sont montrés en cyan. Les Cys-His dyade sont étiquetés en rouge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figure 6 : Structures peptidiques dans le MEO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Figure 7 : Docking of substrat peptide using PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figure 8 : Emplois en cours d'exécution sur le cluster Biowulf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figure 9 : Modèle du substrat VEEV P12 contenant la séquence du site de clivage à la jonction nsP1/nsP2. La dyade catalytique Cys-477/His-546 est représentée en bleu. La figure a été faite à l'aide de Pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figure 10 : Analyse du SSHHPS de la protéase du virus Zika ns2B/ns3. (A) Cibles protéiques hôtes prévues de la protéase ZIKV ns2B/ns3. Les résidus en rouge correspondent à une séquence de site de clivage unique. Les résidus en vert sont tolérés au sous-site et correspondent aux résidus d'autres sites de clivage. SFRP1 a eu le plus grand nombre de résidus identiques dans l'ordre consécutif. (B) Les protéines CFP-substrate-YFP (50-60 kDa) ont été exprimées et purifiées contenant la séquence SSHHP prévue de chaque protéine hôte (humaine). La protéase ZIKV a coupé l'humain FOXG1, SFRP1, NT5M et une sous-unité alphadeG isolée d'une bibliothèque de cDNA rétinien. Les produits de clivage sont environ 28-30 kDa. Les séquences de substrats sont disponibles dans Morazzani et al.6 (C) Bien que la protéase ns2B/ns3 coupe SFRP1, elle n'a pas coupé ses homologues (SFRP2 et SFRP4). (D) L'alignement des sites de clivage de différentes espèces animales peut être utile dans le choix d'un modèle animal pour un virus du groupe IV. Notez que la séquence de R-G conservée diffère entre les humains et les rongeurs dans SFRP1. Figure reproduite à partir de Morazzani et coll.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figure 11 : Analyse cinétique à l'état régulier à l'aide des essais continus et discontinus. (A) Les données cinétiques présentées dans le tableau 5 ont été tracées dans GraFit. L'enset montre l'intrigue Lineweaver-Burk. (B) Gel SDS-PAGE montrant les produits de clivage du substrat CFP-V12-YFP. Dans la voie 1 se trouve le substrat "UNCUT" (48 kDa). Dans la voie 2 se trouve le substrat "CUT" (31 kDa et 27 kDa). Dans les voies 3-9 différents composés ont été inclus pour tester leur activité inhibitrice. La voie 4 contient l'inhibiteur covalent E64d. Ces réactions ont été courues pendant la nuit pendant 17 h à température ambiante. L'ébullition des échantillons était nécessaire pour atteindre le modèle de baguage pointu. La protéase nsP2 est visible (56 kDa) dans les réactions contenant de l'enzyme, mais pas dans la voie 1. La voie 1 est le contrôle " sans enzymes ". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Nous présentons un protocole général pour identifier de courtes étendues des séquences homologues de protéine d'hôte-pathogène (SSHHPS) incorporées dans la polyprotéine virale. Le SSHHPS est reconnu par les protéases virales et dirige la destruction ciblée de protéines hôtes spécifiques par plusieurs virus du groupe IV.

Analyse du SSHHP Viral du Groupe IV utilisant des méthodes in vitro et in Silico

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Nous avons montré que les génomes viraux du groupe IV codent de courtes étendues de séquences de protéines hôtes. Ces séquences peuvent être trouvées dans les sites viraux de clivage de protéase. Ils sont utilisés pour la destruction ciblée des protéines hôtes, généralement des protéines impliquées dans la génération des réponses immunitaires.Un avantage majeur de l’utilisation d’analyses de protéase est qu’il élimine la complexité d’une cellule et montre si oui ou non une protéase virale peut fendre une séquence particulière. Ainsi, lorsque nous avons analysé les séquences de Zika SSHHPS, nous avons constaté que la protéase pouvait réduire les séquences dans les protéines impliquées dans la génération de réponses immunitaires et que certaines de ces protéines avaient également un rôle dans le développement du cerveau et des yeux. Lors de l’exécution de cette technique pour la première fois, il faut se rappeler que si le clivage n’est pas observé, il peut être dû à une variété de facteurs tels que l’activité de la protéase.Jaimee Compton, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par ouvrir Protein BLAST et mettez les 20 acides aminés entourant la liaison scissile et la polyprotéine virale et sélectionnez les séquences protéiques non redondantes puis tapez dans le génome hôte à rechercher. Si nécessaire, sélectionnez PHI-BLAST et tapez dans une séquence de motifs où les supports carrés indiquent que l’un ou l’autre acide aminé dans les parenthèses peut être à la position de remplacement, puis frapper BLAST.Classer l’ordre des frappes BLAST en fonction du nombre de résidus identiques ou tolérés consécutifs qui correspondent à une séquence de site de clivage. Dans la liste, sélectionnez les protéines contenant six résidus identiques ou similaires ou similaires à analyser dans les analyses de protéase. Construire un plasmide codant pour la protéine fluorescente cyan, jusqu’à 25 acides aminés de la séquence de clivage, et la protéine fluorescente jaune.Ensuite, préparez les substrats CFP et YFP en inoculant quatre flacons de quatre litres avec 25 millilitres d’une culture nocturne. Secouez les cultures à 37 degrés Celsius et surveillez la croissance toutes les heures par spectroscopie UV-Vis à 600 nanomètres. Lorsque les bactéries atteignent une absorption d’environ un, induire l’expression des protéines en ajoutant 0,5 millilitres d’un IPTG molaire à chaque flacon, puis abaisser la température de l’incubateur secouant à 17 degrés Celsius et permettre à l’expression de continuer toute la nuit pendant 17 à 20 heures.Le lendemain, pelleter les bactéries par centrifugation à 7000 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez et jetez le liquide, puis stockez les granulés à moins 80 degrés Celsius ou procédez à la lyse cellulaire. Pour lyse les cellules, préparer 100 millilitres de tampon de lyse selon les instructions manuscrites, résuspendre les granulés dans le tampon, et transférer 25 à 25 millilitres de la suspension à 50 millilitres tubes coniques jetables.Placez les tubes dans un bécher en plastique avec de l’eau glacée, puis insérez la pointe du sonicateur dans le tube de sorte que la pointe est d’environ un centimètre du fond du tube et sonicate le lysate 10 à 20 fois jusqu’à ce qu’il devienne fluide et liquéfié. Après la sonication, transférer le lysate dans des tubes de centrifugeuse à grande vitesse et le centrifuger à 20 500 x g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer le supernatant dans une bouteille propre et jeter les granulés.Chargez le lysate sur la colonne de nickel puis lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon A suivis de cinq volumes de colonne de B.Absorbance tampon de 20% à 280 nanomètres augmentera pendant le lavage pendant que les contaminants s’élit de la colonne. Continuer le lavage jusqu’à ce que l’A280 revienne aux valeurs de base. Ensuite, élitez la protéine avec deux à trois volumes de colonne de 100% tampon B et de recueillir des fractions de 10 millilitres, en s’assurant de mesurer l’A280 de chaque fraction.Préparez huit mélanges de réactions selon les directions manuscrites et pipette 45 microlitres de chaque mélange dans les trois premiers puits de chaque rangée d’une plaque noire de 96 puits de demi-surface. Configurez le lecteur de plaque pour la détection simultanée de la florescence à deux longueurs d’onde avec un réglage fixe du tube photomultiplier. Programmez le temps de lecture à 20 à 30 minutes avec une lecture par minute et sélectionnez les puits à lire.Insérez la plaque dans la machine et démarrez la lecture, en surveillant les rapports d’émission au fil du temps. Exécuter une lecture de point de terminaison de la plaque contenant le substrat non coupé. Retirer la plaque et pipette cinq microlitres d’enzyme dans chaque puits.On peut enregistrer la première colonne comme un contrôle non coupé. Ensuite, relisez la plaque pendant 20 à 30 minutes, en vous assurant de régler le lecteur de plaque à des valeurs absolues de sortie. Une fois la lecture terminée, sceller la plaque avec du film pour éviter l’évaporation et la laisser toute la nuit à température ambiante pour permettre à l’enzyme de couper complètement le substrat.Après 24 heures, retirez le film et effectuez une lecture de fin de la plaque. Faire la moyenne des ratios d’émissions et les enregistrer comme étant réduits. Confirmez le clivage du substrat à l’aide de SDS-PAGE.Chargez un marqueur de poids moléculaire dans la première ou la dernière voie et chargez cinq microlitres de chaque mélange de réaction dans une voie du gel, en commençant par la réaction non coupée. Fixez les électrodes du réservoir de gel à l’alimentation électrique et exécutez les produits à 110 volts pendant 60 minutes. Retirez le gel de la cassette à l’aide d’un outil de fissuration et submergez-le en cinq à 10 millilitres de solution de coloration.Après une à 24 heures, retirer l’excès de taches et plonger le gel dans l’eau. Ensuite, prenez une photo du gel à l’aide d’un imageur de gel. Pour préparer la structure protéique, chargez le fichier PDB protéique dans le MEO.Cliquez sur Sélectionnez et Solvant, puis supprimez le solvant. Ouvrez le panneau de préparation de structure à partir de la barre de menu supérieure Compute et corrigez automatiquement tous les éléments structurels en cliquant sur Correct. Protonate la structure en cliquant sur Protonate 3D.Ajoutez des charges partielles à la protéine en ouvrant le panneau Charges partielles et en sélectionnant AMBER 99 et ajustez les hydrogènes et les paires solitaires au besoin. Ensuite, enregistrez le fichier de structure. Pour construire la structure des peptides de substrat et trim14, ouvrez le panneau Protein Builder, entrez dans la séquence du substrat et sélectionnez Auto Repack.Ensuite, définissez la géométrie comme étendue et cliquez sur Build. Enfin minimiser la structure et l’enregistrer comme un fichier PDB. Amarrer les peptides de substrat à VEEV-nsP2 à l’aide du logiciel PyRx AudoDock 4.2.Chargez la protéine, cliquez à droite sur le nom et sélectionnez Make Macromolecule pour préparer le fichier d’amarrage PDBQT. Chargez ensuite la molécule de substrat et sélectionnez Make Ligand pour préparer le fichier d’amarrage ligand. Démarrez l’assistant AutoDock sur le panneau d’amarrage en bas et sélectionnez les fichiers ligand et protéines préparés.Définissez la poche de liaison protéique en ajustant manuellement la dimension de la grille, puis exécutez AuotGrid. Ensuite, exécutez AutoDock et sélectionnez la méthode de l’algorithme génétique lamarckien. Cliquez sur Paramètres d’amarrage et définissez le nombre de courses GA à 50, puis cliquez sur Forward pour démarrer la course à l’amarrage.Lorsque AutoDock est terminé, ouvrez le panneau Analyser les résultats et inspectez toutes les poses de liaison prévues. Sélectionnez le meilleur modèle avec l’énergie de liaison la plus basse prévue et des interactions de liaison raisonnables entre le cis-477 et le substrat sur le site de clivage, puis enregistrez-le comme fichier PDB pour d’autres simulations MD. Après avoir lu les poses de liaison avec AutoDock, il est important d’effectuer une analyse post-amarrage pour identifier le modèle de liaison plausible pour le raffinement avec des simulations MD.Ce protocole a été utilisé pour trouver de courtes étendues de séquences homologues de protéines pathogènes de l’hôte ou de SSHHPS dans la protéase du virus Zika ns2B/3. Quatre cibles protéiques hôtes ont été identifiées. FOXGS, SFRP1, un sous-unité Gsalpha d’une bibliothèque rétinienne cDNA, et le NT5M mitochondrial 5'3'nucléotidase.Les alignements de séquences du SSHHPS ont permis des différences spécifiques aux espèces dans les séquences du site de clivage. La séquence SFRP1 était identique chez l’homme et les poulets, ce qui est remarquable parce que le virus Zika peut induire la mortalité et la microcéphalie chez les embryons de poulet. L’essai continu a été employé pour mesurer les paramètres cinétiques stables d’état et les constantes d’inhibition pour les séquences virales de polyprotéine et l’essai discontinu a été employé pour obtenir l’information qualitative de clivage, telle que le clivage d’une séquence particulière ou l’inhibition de la protéase par divers composés.Un modèle de la jonction vénézuélienne d’encéphalite équine nsP1-nsP2 a été fait utilisant dans les méthodes de silico. Pour la protéase nsP2, l’allongement de la séquence du substrat et la réduction de la force ionique du tampon ont conduit à une réduction significative de la constante michaelis du clivage d’une séquence de virus de la forêt de Semliki. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’exécuter les contrôles.Les substrats contenant les séquences virales du site de clivage protéase doivent être testés avant de procéder à l’analyse de la séquence SSHHPS. Si le clivage d’une protéine hôte est observé, des expériences de suivi devraient être menées pour confirmer que cette protéine hôte affecte la réplication virale. Cela peut être fait en surexprimant ou en faisant taire la protéine, puis en examinant les effets sur la réplication virale.Le groupe IV contient un grand nombre d’agents pathogènes nouveaux et émergents. Les séquences SSHHPS relient des protéines et des voies hôtes spécifiques aux protéases virales d’une manière très prévisible.

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