Name: Système centrifuge automatisé de contre-flux pour le traitement cellulaire à petite échelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Découvrez l'automatisation de l'échange de tampon et de la concentration cellulaire à petite échelle. Cette méthode par centrifugation à contre-flux offre un rendement élevé et un volume concentré réduit pour la fabrication cellulaire.

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Ce travail est appuyé par le Programme de soutien à l'infrastructure opérationnelle du gouvernement de l'État de Victoria et le bon de technologie du gouvernement victorien fourni par le ministère du Développement économique, de l'Emploi, des Transports et des Ressources. RL est le récipiendaire d'une bourse de perfectionnement professionnel du Conseil national de la santé et de la recherche médicale. AL est le récipiendaire d'un Australian Postgraduate Award.

1. Préparation des réactifs et des cellules pour l'échange de tampons
<ol><li>Préparer des tampons (voir Tableau des matériaux) dans une hotte à débit laminaire de classe 2. À l'aide d'une seringue et d'un assemblage d'aiguilles, retirer 50 ml de solution saline d'un sac salin de 500 ml. Remplacez cela par 50 ml d'albumine de sérum humain (HSA) pour faire 2% HSA en salin, qui servira de tampon de lavage.</li>
	<li>Retirez les cellules des vaisseaux de culture et effectuez un nombre cellulaire pour déterminer la quantité et la viabilité des cellules de départ par exclusion bleue trypan. Chargez les cellules dans un sac de transfert. REMARQUE : Dans ce protocole, les cellules Jurkat ont été cultivées dans le RPMI et les MSC ont été cultivés dans DMEM:F12. Les deux médias ont été complétés avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) et 1% de solution antibiotique-antimycotique. Les cellules ont été cultivées à 37 oC avec 5 % de CO2. Pour les MSC ou les cellules adhérentes, ajoutez une enzyme de digestion (par exemple, la trypsine) dans les vaisseaux de culture afin de détacher les cellules, et étancher avec le média de culture une fois que les cellules sont détachées. Un sac de transfert a été utilisé dans ce protocole parce que les cellules ont été élargies dans les vaisseaux de culture. Cependant, si les cellules sont cultivées dans un sac de culture cellulaire, il peut être directement connecté au kit à usage unique via le soudage à tube stérile. Dans ce protocole, soit 3 x 107 cellules Jurkat ou 1 x 107 MSC ont été utilisés pour chaque course, où les cellules ont été suspendues dans 40 ml de médias de culture.<ol>
<li>Chargez les cellules dans un sac de transfert (voir Tableau des matériaux) à l'aide d'une seringue et d'un assemblage d'aiguilles si un soudeur à tube stérile est disponible pour connecter le sac de transfert au kit de traitement à usage unique.</li>
		<li>Alternativement, utilisez une paire de ciseaux autoclaved pour couper le tube de raccordement avec environ 10 cm restant attaché au sac de transfert et ajouter un connecteur femelle Luer à l'extrémité de la tuyauterie. Utilisez une seringue pour aspirer les cellules et les médias, puis connectez-la au connecteur Luer et chargez les cellules au sac de transfert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Connectez le sac contenant les cellules, lavez le sac tampon contenant 500 ml de tampon de lavage préparé à l'étape 1.1, le sac à déchets et la seringue de collecte à la trousse à usage unique (figure 1B). REMARQUE : La position de connexion de chaque sac dépend des paramètres du programme. Dans ce protocole, nous avons relié le sac à déchets à la position A, lavons le tampon à la position B, le sac cellulaire aux positions D et F, et la seringue de collecte à la position H (Figure 1C).</li>
</ol>2. Programme pour le protocole automatisé d'échange de mémoires tampons
<ol><li>Ouvrez l'interface utilisateur graphique (INTERFACE) de l'appareil et appuyez sur le bouton «START» sur un ORDINATEUR ou une tablette portable. Puis "Ouvrez" un protocole existant ou appuyez sur "New" pour en créer un nouveau.</li>
	<li>Utilisez le bouton «Forward» et «Backward» pour naviguer à travers chaque étape, sélectionnez les vannes à ouvrir/fermées, la vitesse centrifuge, la vitesse de la pompe, la direction de la pompe et les déclencheurs d'action. Les paramètres de chaque étape sont résumés dans le tableau 1. Alors enregistrez le protocole.</li>
</ol>3. Mise en place de la machine
<ol><li>Placez le kit de traitement à usage unique sur la machine et accrochez les sacs connectés en conséquence. Appuyez sur le bouton rouge "Stop/Reset" pour réinitialer toutes les vannes dans la position fermée par défaut. REMARQUE : La machine effectuera un essai lorsque la porte est fermée pour s'assurer que le kit a été placé correctement et que toutes les vannes fonctionnent correctement.</li>
	<li>Connectez l'interface graphique à l'appareil de traitement et appuyez sur le bouton «Connect». Téléchargez ensuite le programme enregistré. Lorsque le bouton vert "Play" s'allume, il indique que le protocole est prêt à démarrer.</li>
	<li>Ouvrez les pinces manuelles pour le tube du sac de transfert. REMARQUE : Si l'opérateur oublie d'ouvrir les pinces, l'appareil s'arrête et l'avertissement du capteur de pression apparaîtra. Appuyez sur le bouton "Stop" pour réinitialer l'appareil et ouvrez les pinces pour recommencer.</li>
</ol>4. Échange de mémoire tampon automatisé
<ol><li>Appuyez sur "Démarrer" pour lancer le programme d'échange de tampons. REMARQUE : Pour modifier manuellement le processus automatisé, appuyez sur le bouton «Suivant» pour passer à l'étape suivante avant d'atteindre le «Déclencheur» ou appuyez sur «Pause» pour mettre le processus en attente. Cela recirculera les cellules à travers le kit tout en gardant seulement les valves J et K ouvertes (Figure 1C).</li>
	<li>À la fin de l'étape d'automatisation 6 (tableau 1), le processus s'arrêtera lorsque l'air dans le sac maintenant vidé déclenche le capteur de bulles. Appuyez sur "Suivant" pour passer à l'étape suivante si le sac est bien vide, ou appuyez sur "Pause" pour reprendre le traitement si le capteur a été déclenché par une bulle dans la ligne.</li>
</ol>5. Collecte et échantillonnage des cellules
<ol><li>Lorsque le processus automatisé est terminé, fermez toutes les pinces de tubes. Ouvrez la porte et sortez le kit à usage unique de l'appareil. Débranchez la seringue pour recueillir les cellules pour les processus ultérieurs. Prenez un échantillon des cellules recueillies pour une vérification du nombre cellulaire et de la viabilité (voir l'étape 6.2).</li>
</ol>6. Validation du processus
<ol><li>Effectuez des expériences de contrôle à l'aide d'un protocole d'échange de mémoire tampon manuel.<ol>
<li>Suspension des cellules centrifugeuses à 200 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant et suspendez les cellules avec 30 ml de tampon de lavage cellulaire. Centrifuger la suspension cellulaire à nouveau à 200 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 10 ml de tampon de lavage cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer le comptage cellulaire par l'intermédiaire de l'essai d'exclusion bleu trypan pour évaluer la viabilité cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé.</li>
	<li>Effectuer un rétopit MTS pour quantifier la prolifération cellulaire à 2, 24 et 48 h. REMARQUE : L'analyse MTS a été effectuée sur une plaque de culture de tissu de puits 96 selon les instructions du fabricant. Un aliquot de 100 L de supports de culture cellulaire (contenant 10 000 cellules Jurkat ou 1 500) par puits a été plaqué après le processus d'échange de tampons. À chaque fois, 20 réagents MTS ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 2 h à 37 oC. L'absorption a été évaluée à 490 nm à l'aide d'un lecteur de plaque.</li>
	<li>Effectuez des essais fonctionnels pour comparer l'impact du processus automatisé par rapport au processus manuel sur les cellules Jurkat et la fonction MSC.<ol>
<li>Culture Cellules Jurkat dans une plaque de 96 puits à une densité de 1 x 106 cellules/mL stimulée avec 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 1 'g/mL ionomycine (cocktail de stimulation cellulaire) dans dMEM:F12 médias contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 24 h. Incuber les cellules à 37 oC avec 5 % de CO2.</li>
		<li>Mesurer la production d'interleukine-2 à partir d'un supernatant culturel à l'aide d'un test ELISA à base de perles (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>MSCde de culture dans une plaque de 12 puits à la densité de 10.000 cellules/cm2 dans 1 ml de dMEM:F12 médias contenant 10% FBS complété avec l'interféron--50 unités/mL pendant 48 h. Recueillir supernatant pour l'essai de concentration de kynurèrenine pour mesurer l'indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) activité enzymatique des MSCs comme précédemment décrit21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+1%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li>
<li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factories+of+the+future%3A+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li>
<li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li>
<li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translation+of+cell-based+therapies%3A+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li>
<li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li>
<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li>
<li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li>
<li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%3A+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li>
<li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stromal+Cells%3A+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
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<li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li>
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</ol>

SW, IF et DJ sont COO, CTO et CEO de Scinogy Pty. Ltd. L'accès au dispositif CFC a également été fourni par Scinogy.

Le protocole d'échange de mémoire tampon automatisé décrit est simple et convivial. Néanmoins, il y a quelques étapes clés dans ce protocole qui sont critiques et nécessitent une attention particulière. D'après notre expérience, lors du traitement de cellules plus grandes telles que les MSC (diamètre moyen de 10 à 15 m), chaque course devrait inclure au moins 1 x 107 cellules pour atteindre une récupération optimale des cellules (Figure 4B). Le traitement de cellu...

Le paysage de la médecine moderne s'est rapidement transformé grâce aux développements récents des thérapies géniques et cellulaires (TCM). En tant que l'un des domaines de la recherche translationnelle qui connaît la croissance la plus rapide, le secteur de la GCT est également confronté à des défis uniques et sans précédent. En plus des résultats cliniques robustes, des procédés de fabrication efficaces et rentables sont essentiels au succès commercial de GCT, qui est particulièrement difficile à réaliser dans la fabrication à petite échelle1. Le coût du temps, du travail et des assurances de qualité est amplifié lorsque chaque lot de cellules ne produit que quelques doses pour un patient au lieu de centaines ou de milliers. Contrairement aux thérapies cellulaires allogéniques dans lesquelles les processus de fabrication s'apparentent davantage à la production d'anticorps et de protéines recombinantes, les thérapies cellulaires autologues sont généralement produites sous forme d'opérations à petite échelle1. Comme un phénomène relativement nouveau dans la fabrication biopharmaceutique2, les options pour le traitement des cellules à petite échelle sont actuellement assez limitées.
L'échange de tampons est essentiel à la fabrication de cellules. C'est l'un des processus en aval où les cellules sont retirées des cultures et concentrées pour la cryoconservation ou l'infusion. À l'heure actuelle, la fabrication de petites cellules applique souvent des procédés semblables à ceux du milieu de la recherche universitaire et s'appuie sur des salles blanches spécialisées pour maintenir la stérilité3. Les processus manuels en aval utilisent souvent des centrifugeuses de banc pour granuler et resuspendre les cellules pour la réduction du volume et l'échange de tampons. Ces procédés ouverts sont coûteux (c.-à-d., la main-d'œuvre et l'entretien de la pièce propre) et ont une capacité de fabrication limitée, qui ne sont pas idéales pour la production commerciale2,3.
La mise en œuvre de l'automatisation a été proposée comme solution pour améliorer l'efficacité de la fabrication et réaliser des productions à l'échelle commerciale2. La stérilité ne peut pas être atteinte dans les produits à base de cellules par des méthodes traditionnelles utilisées pour les produits biologiques, tels que l'irradiation gamma ou la filtration terminale. Au lieu de cela, un système fermé automatisé est déployé pour réduire les risques de contamination et les opérateurs comptent sur des salles propres pour maintenir la stérilité4. L'automatisation des processus aborde également la question de l'évolutivité en ayant plusieurs systèmes fonctionnant en parallèle (échelle) ou en augmentant la capacité de traitement d'un appareil individuel (mise à l'échelle), ce qui minimise la variabilité entre les opérateurs. En outre, l'analyse de modélisation des coûts des thérapies autologues suggère que l'automatisation peut réduire le coût de fabrication5,6. Cependant, aucun avantage de coût n'a été trouvé dans un essai clinique autologous de cellules souches où une plate-forme automatisée de fabrication a été employée7,suggérant que l'avantage de coût de l'automatisation peut dépendre du processus individuel de fabrication.
Il existe différentes stratégies dans lesquelles l'automatisation peut être introduite dans un processus de fabrication existant. Cela peut être réalisé soit en mettant en œuvre une plate-forme entièrement intégrée, soit en tant que chaîne de traitement modulaire. Il existe plusieurs plates-formes entièrement intégrées disponibles dans le commerce pour la fabrication de cellules autologues, telles que CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) et Quantum (Terumo BCT). Ces plates-formes intégrées, souvent décrites comme « GMP-in-a-box », ont peu de demandes d'infrastructure et sont faciles à utiliser. Toutefois, la capacité de fabrication d'une configuration entièrement intégrée peut être limitée par l'incubateur attaché au système. Par exemple, la capacité de culture de Prodigy est limitée à sa chambre8 de 400 ml et la cartouche Quantum a une surface limitante fixée à 2,1 m2 (équivalent à 120 flacons T175)7, ce qui peut ne pas être suffisant pour les patients nécessitant des doses cellulaires plus élevées9,10. En outre, Prodigy et Quantum ont un attribut commun qui limite leur utilisation: l'unité opérationnelle est occupée par un seul lot de cellules tout au long de la période d'expansion cellulaire, limitant ainsi le nombre de lots qui peuvent être fabriqués par chaque unité11. L'approche modulaire de l'automatisation est de créer une chaîne de fabrication avec plusieurs unités modulaires qui simule le processus de fabrication commerciale12,13. Cette approche, qui sépare le dispositif de culture du dispositif de lavage de cellules, peut ainsi maximiser l'efficacité de fabrication. Un dispositif de traitement idéal serait celui qui est adaptable et évolutif aux besoins de fabrication12.
La technologie de centrifugation de contre-flux (CFC), qui remonte aux années 1970, a eu une longue histoire dans le traitement cellulaire14. Il atteint la concentration cellulaire et la séparation en équilibrant la force centrifuge avec une force de contre-flux. Typiquement, une suspension cellulaire entre de l'extrémité étroite d'une chambre cellulaire sous un débit constant alors qu'elle est soumise à une force centrifuge (figure 1A). Le flux du fluide est exercé dans la direction opposée à la force centrifuge. C'est ce qu'on appelle la force de contre-flux, qui forme un gradient dans la chambre cellulaire. La force de contre-flux diminue alors que la chambre cellulaire s'élargit loin de la pointe de la chambre cellulaire en forme de cône. Les cellules avec une densité plus élevée et un diamètre plus grand ont un taux de sédimentation plus élevé, et ainsi elles atteignent l'équilibre de force vers la pointe de la chambre cellulaire en forme de cône. Les particules plus petites peuvent atteindre l'équilibre vers la base de la chambre ou être trop petites pour être retenues dans la chambre et seront emportées. La technologie CFC est surtout connue pour son application dans le traitement des produits d'apheresis sanguin, tels que l'isolation des monocytes pour les thérapies cellulaires dendritiques15,16. En termes d'échange de tampons, la technologie CFC n'a été appliquée que dans la fabrication à grande échelle17 et n'a pas encore été utilisée pour la fabrication à plus petite échelle de thérapies cellulaires autologues.
Pour répondre au besoin d'un dispositif approprié pour la fabrication de cellules à petite échelle, un dispositif cFC automatisé (Voir tableau des matériaux),a été récemment développé18. Le dispositif automatisé de traitement cellulaire utilise la technologie de centrifugation de contre-flux pour enlever les débris cellulaires et faciliter l'échange de tampons. L'appareil effectue un échange de mémoire tampon avec un kit à usage unique qui peut être relié stérile à un sac de transfert de cellules, ce qui permet aux cellules d'être traitées dans un système stérile et fermé. Ici, nous étudions l'utilisation d'un dispositif centrifuge de contre-flux pour effectuer l'échange de tampons dans les cultures cellulaires de mammifères dans des protocoles automatisés. Dans cette étude, nous avons testé le protocole d'échange de tampons à l'aide de cellules Jurkat et de cellules stromal mésenchymales (MSCs) pour modéliser les types de cellules non adhérentes et adhérentes, respectivement. Les cellules Jurkat sont des lymphocytes T immortalisés souvent utilisés pour l'étude de la leucémie t cellulaire aigue19,20. Les MSC sont des cellules souches adultes qui ont été étudiées dans le domaine des essais cliniques chez l'homme pour un large éventail de maladies9.

<table><tbody><tr><td>Seringues Luer lock de 20 ml</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>20 % d’albumine sérique humaine (HSA)</td><td>CSL Behring</td><td>AUST R 46283</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156477-25g</td><td></td></tr><tr><td>500ml Sachet salin IV</td><td>Fresenius Kabi</td><td>K690521</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycotique</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15240112</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage de cellules</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de stimulation cellulaire (500x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4970-93</td><td></td></tr><tr><td>Sacs de transfert de cellules</td><td>Terumo</td><td>T1BBT060CBB</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Prolifération Testation (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>DMEM : Média F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Lecteur de plaques</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>Al221C</td><td></td></tr><tr><td>Raccords Luer (femelle)</td><td>CPC</td><td>LF41</td><td></td></tr><tr><td>PC, ordinateur portable ou PC, tablette</td>, <td>ASUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques (SpectraMax i3)</td><td>Dispositif moléculaire</td><td>: N/A</td><td></td></tr><tr><td>: IFN-&gamma humain recombinant ;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Rotea Dispositif de traitement de cellules centrifuges à contre-courant</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rotea Kit de traitement à usage unique</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI média</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>ProSciTech</td><td>420SS</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399-250g</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de digestion de la trypsine (TrypLE Express Enzyme)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr></tbody></table>

système centrifuge automatisé de contre-flux pour le traitement cellulaire à petite échelle

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

La commercialisation réussie des thérapies géniques et cellulaires nécessite des procédés de fabrication rentables et évolutifs. L'échange de tampons et la concentration des produits sont des composants essentiels pour la plupart des procédés de fabrication. Cependant, aux premiers stades du développement du produit, ces étapes sont souvent effectuées manuellement. La centrifugation manuelle sans issue pour l'échange de tampons est laborieuse, coûteuse et non évolutive. Un système automatisé fermé peut effectivement éliminer cette étape laborieuse, mais la mise en œuvre peut être difficile. Ici, nous décrivons un dispositif de traitement cellulaire nouvellement développé qui convient au traitement cellulaire à petite et moyenne échelle et vise à combler l'écart entre le traitement manuel et l'automatisation à grande échelle. Ce protocole peut être facilement appliqué à divers types et processus cellulaires en modifiant le débit et la vitesse de centrifugation. Notre protocole a démontré la récupération élevée de cellules avec des temps de traitement plus courts par rapport au processus manuel. Les cellules récupérées du processus automatisé ont également maintenu leurs taux de prolifération. L'appareil peut être appliqué comme un composant modulaire dans un processus de fabrication fermé pour accueillir des étapes telles que l'échange de tampons, la formulation cellulaire, et la cryoconservation.

Dans ce protocole, nous avons utilisé les cellules Jurkat et les MSC comme exemples représentatifs pour démontrer le processus automatisé d'échange de tampons. Pendant le processus, les cellules Jurkat et les MSC ont partagé les mêmes étapes de traitement avec les différences de force centrifuge et de vitesse de la pompe qui contrôlent le débit (tableau 1). La figure 2 montre des images représentatives capturées par la caméra de la façon dont le lit de cellule fluidisé peut ...

L'automatisation est essentielle à la mise à l'échelle et à la gestion des coûts dans la fabrication de cellules. Ce manuscrit décrit l'utilisation d'un dispositif de traitement centrifuge de contre-flux pour automatiser l'échange de tampons et les étapes de concentration cellulaire pour le biotraitement à petite échelle.

Système centrifuge automatisé de contre-flux pour le traitement cellulaire à petite échelle

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Ce protocole fournit une solution pour l’échange et la concentration automatisés fermés de tampon pour la fabrication de cellules à petite échelle. Fait important, l’échange tampon peut être effectué avec une récupération élevée et la livraison d’un très petit volume de produits concentrés. Les nouveaux utilisateurs peuvent avoir du mal à suivre toutes les étapes d’automatisation.La pratique de la programmation de ces étapes et l’exécution de tests avec moyen sont de bonnes façons de se familiariser avec l’appareil. Avant de commencer l’échange tampon, dans une tête d’écoulement laminaire de classe deux, utilisez une seringue et un assemblage d’aiguilles pour retirer 50 millilitres de solution saline d’un sac salin de 500 millilitres. Remplacez ce volume par 50 millilitres d’albumine sérique 20% humaine et récoltez les cellules d’intérêt de leurs vaisseaux culturels.Après comptage, utilisez la seringue pour charger les cellules dans un sac de transfert, et utilisez la serrure Luer pour connecter le sac de transfert à un kit de traitement à usage unique. Connectez ensuite le sac de tampon de lavage préparé précédemment à la trousse de traitement à usage unique. Pour configurer un échange tampon automatisé, ouvrez l’interface utilisateur graphique de l’appareil et cliquez sur le bouton de démarrage.Cliquez neuf pour créer un nouveau protocole, et cliquez sur le contrôle pour sélectionner les vannes à ouvrir et à fermer, les vitesses centrifuges et de pompe, la direction de la pompe et les déclencheurs d’action. Lorsque tous les paramètres ont été définis, cliquez sur enregistrer. Accrochez les sacs appropriés connectés sur l’appareil et placez le kit de traitement à usage unique sur la machine.Cliquez ensuite sur le bouton connectez-vous et téléchargez le programme enregistré. Lorsque le bouton de jeu s’allume, le protocole est prêt à être lancé. Pour effectuer l’échange de tampon automatisé, ouvrez les pinces manuelles pour le tube sac de transfert, et cliquez sur commencer à lancer le programme d’échange tampon.À la fin de l’étape six de l’automatisation, le processus s’arrêtera en raison du déclenchement du capteur de bulle par l’air dans le sac maintenant vide. Si le sac est effectivement vide, appuyez sur à côté pour déplacer le processus à l’étape suivante. Lorsque le processus automatisé est terminé, fermez toutes les pinces à tubes et ouvrez la porte de l’appareil.Retirez ensuite le kit à usage unique de l’appareil et déconnectez la seringue pour permettre aux cellules d’être collectées pour une analyse ultérieure. En règle générale, le lit cellulaire fluidisé apparaît comme représenté dans cette image avec les cellules s’accumulant au milieu et vers l’avant du cône, un petit espace à la pointe de la chambre dans lequel les cellules ne s’accumulent pas, et une ouverture visible à l’intérieur de l’entrée de chargement cellulaire. Le lit cellulaire fluidisé peut être comprimé lors de l’introduction d’un nouveau tampon qui est à une viscosité ou une densité différente.Un débit élevé peut être appliqué pour sélectionner les cellules vivantes car les cellules mortes sont plus petites et plus légères et peuvent être forcées de quitter la chambre en augmentant le débit. Le processus automatisé de traitement des échanges tampons est plus court que celui du processus manuel d’échange de tampons. Dans cette analyse, les taux de récupération entre le manuel et les processus automatisés étaient similaires pour les deux types de cellules testées, et la viabilité cellulaire n’a pas été affectée par l’un ou l’autre processus.Les cellules récupérées ont démontré des taux de prolifération similaires, des capacités pour produire des cytokines, et des idéo-activités, indépendamment du type de traitement. Il est important de se rappeler que ce protocole ne sert que de ligne directrice, et donc les utilisateurs ont besoin de programmer le débit et la vitesse de centrifugation en fonction de leur type de cellule et tampon. L’échange tampon est une étape intermédiaire dans la fabrication cellulaire qui peut suivre l’expansion de la culture cellulaire ou la cryopréservation et la formulation.L’objectif est de développer des moyens d’enfermer l’ensemble du processus. La centrifugation de contre-flux est une plate-forme très polyvalente. Les études futures exploreront des applications dans la sélection cellulaire, telles que l’enlèvement de cellules mortes et l’isolement cellulaire mononucléaire d’un produit chorisis.

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Système centrifuge automatisé de contre-flux pour le traitement cellulaire à petite échelle

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