Name: Évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Apprenez à évaluer la fonction cardiaque in vitro avec des cardiomyocytes écorchés. Cette méthode permet d'analyser la fonction des myofilaments à partir de petites biopsies myocardiques congelées pour étudier la physiopathologie cardiaque.

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Les auteurs remercient la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), l’Union européenne, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) et Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) pour le financement de l’unité de recherche unic (UID/IC/00051/2013). Ce projet est soutenu par FEDER dans le cadre de COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), le projet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), soutenu par le programme opérationnel régional Norte Portugal (NORTE 2020), dans le cadre de l’accord de partenariat Portugal 2020, par l’intermédiaire du Fonds européen de développement régional (FEDF), le projet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), soutenu par les Fonds structurels et d’investissement européens, programme opérationnel régional de Lisbonne 2020. Patrícia Rodrigues a été financée par fct (SFRH/BD/96026/2013) et João Almeida-Coelho a été par Universidade do Porto/FMUP et FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

L’évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés représente une technique importante pour clarifier les modifications qui se produisent au niveau des cardiomyocytes dans le contexte physiologique (p. ex., étirement) et pathologique (p. ex., ischémie). Cette méthodologie présente plusieurs avantages tels que l’exigence d’une quantité minimale de myocarde pour évaluer la fonction dans les cardiomyocytes obtenus à partir d’échantillons décongelés; en utilisant des cardiomyocytes d’un large éventaild’espèces (souris 13, rat1,14,15, lapin16, porc17, chien18, cobaye19 et humain20) et différents endroits cardiaques, y compris les atria, ventricules gauche et droit ou une région spécifique du cœur infarctus. De plus, cette technique permet d’offrir des concentrations spécifiques de Ca2+ et d’énergie (ATP) tout en mesurant la fonction des structures réglementaires et contractiles dans leur configuration native.
Malgré la simplicité de cette technique, il y a quelques étapes critiques. Il est essentiel de garantir la qualité de chaque étape dès le début, y compris la collecte d’échantillons. Les protéines de myofilament sont sensibles aux protéases21. Il est donc obligatoire de stocker les échantillons dans de l’azote liquide immédiatement après sa collecte. Les échantillons frais, qui n’étaient pas congelés auparavant, développeront des forces significativement plus élevées, de sorte qu’il n’est pas conseillé de mélanger la mesure effectuée dans des échantillons frais et congelés dans le même protocole. La deuxième étape la plus critique est l’extraction des cardiomyocytes. Au cours de cette procédure, il est crucial de maintenir l’échantillon sur la glace la plupart du temps. Un cocktail inhibiteur de la protéase peut être utilisé pour réduire le risque de dégradation des protéines pendant l’extraction/perméabilisation22. Troisièmement, les échantillons devraient être coupés en petits morceaux à l’aide de mouvements précis du scalpel puisque nous avons noté des cardiomyocytes de qualité réduite lorsque cette étape a été ignorée. Une autre étape critique est de laver les cardiomyocytes car il est difficile d’avoir le bon équilibre entre laver Triton (perméabilize la cellule, mais favorise son déglutage) et de garder autant de cellules dans le supernatant que possible. Il est important d’essayer d’abord l’extraction et le nombre de lavages pour chaque échantillon, espèce ou protocole. Par exemple, dans nos mains, nous avons noté que les extractions obèses de tissu de rat de ZSF1 ont un aspect « gras », qui a rendu ces cellules plus glissantes pendant le collage mais pas plus difficiles à mesurer. La façon dont nous contournons ce problème était d’effectuer plus d’expériences pour avoir un nombre raisonnable de cellules par animal. En outre, il est crucial de choisir une bonne cellule à coller, à savoir avec une bonne striation et une longueur raisonnable. Si le cardiomyocyte n’a pas ces dispositifs, il se détachera la plupart du temps des bouts d’aiguille ou développera aucune/basse force. Il est également important d’utiliser la colle correcte pour l’attachement cardiomyocyte, compte tenu du temps de collage et de son efficacité pour coller la cellule à l’aiguille. Dans nos mains, la colle de silicone (Table of Materials) guérit rapidement (10-15 min) et assez fort. Enfin, la dernière étape critique est liée au levage soigneusement du cardiomyocyte 5 min après collage de la cellule (pour éviter de coller la cellule à la couverture) et avant de la déplacer vers les puits (pour éviter que la cellule ne soit traînée par l’étape du microscope). Le tableau 7 résume le dépannage associé à cette technique, ses causes sous-jacentes et les solutions possibles pour surmonter les problèmes fréquents.
La principale limitation de cette méthode est qu’elle ne peut pas répondre à toutes les questions liées à la contractilité du myofilament, telles que la vitesse à laquelle les myofilaments s’activent/se désactivent. Dans le cadre in vivo, la dépolarisation membranaire, l’augmentation intracellulaire ca2+ et sa diffusion aux myofilaments doivent se produire pour que les myocytes se contractent, tandis que dans les cardiomyocytes écorchés Ca2+ diffusion aux myofilaments se produit immédiatement lorsque la cellule est submergée dans la solution Ca2+. Ce taux plus rapide de diffusion Ca2+ biaisera l’analyse d’activation/désactivation des myofilaments23.
Ces expériences sont influencées par différents facteurs, y compris la température, le pH de solution, la perturbation mécanique (slack-re-stretch vs slack) et les procédures de fixation cellulaire (attache d’épingle vs colle), toutes ces variables tenant compte des écarts de littérature en termes de ktr et de l’augmentation dépendante de la longueur du sarcomere en force4,12.
Les progrès futurs de la technique incluent l’exécution d’études fonctionnelles dans des cardiomyocytes intacts plutôt que perméabilisés. Cette technique a l’inconvénient de s’appuyer sur des cardiomyocytes fraîchement isolés (non préalablement congelés). Une autre question importante qui n’est pas directement liée à cette méthodologie, mais qui pourrait avoir une incidence importante sur celle-ci, est liée à la période maximale d’entreposage congelé de l’échantillon. Plus précisément, il est obligatoire d’établir le degré de dégradation du myofilament tout au long du temps d’entreposage (c.-à-d. pendant combien de temps les échantillons congelés peuvent être stockés afin d’assurer des données fonctionnelles de bonne qualité provenant des cardiomyocytes extraits).

Traditionnellement, l’évaluation des propriétés mécaniques myocardiques a été essayée la plupart du temps dans les préparations multicellulaires, telles que les muscles papillaires et le trabeculae1,2. Les bandes multicellulaires de muscles cardiaques incluent une population hétérogène de cellules, y compris les cardiomyocytes contractiles avec un modèle inconnu d’orientation et de génération de force, l’activité électrique et les distributions de stress/tension aussi bien qu’une matrice environnante de tissu conjonctif3,4. Une préparation sans collagène et contenant un seul cardiomyocyte permettrait de mesurer la longueur du sarcomère et les propriétés contractiles croisées d’une manière très précise etcontrôlée 5,6. Par conséquent, au cours des quatre dernières décennies, plusieurs méthodologies ont été développées permettant d’étudier les propriétés mécaniques, contractiles et de relaxation d’un seul cardiomyocyte6,7. La fonction contractile de ces cellules dépend fortement de la longueur du sarcomère et de la cinétique du cycle transmanie3. Ainsi, il est souhaitable d’étudier la fonction musculaire directement dans les cellules cardiaques isolées simples, considérant qu’il permet d’évaluer la longueur et la performance du sarcome ainsi que la fonction transversale et les propriétés contractiles. Cependant, isoler et attacher des cardiomyocytes fonctionnels avec une résolution optique raisonnable de sarcomere tout en enregistrant la mesure de force au niveau de μN est toujoursprovocant et évoluant 3,6. D’autres défis sont la logistique qui doit être installée pour isoler les cardiomyocytes des biopsies fraîchement recueillies. L’imprévisibilité de la collecte de biopsies humaines, par exemple, peut compromettre la faisabilité des expériences.
En outre, les préoccupations éthiques concernant le remplacement, la réduction et le raffinement de l’expérimentation animale pour les procédures scientifiques (principes des 3R) ont favorisé les changements d’étude au niveau cellulaire et tissulaire, de préférence dans les biopsies humaines, ou dans les échantillons d’animaux plus petits. En effet, un raffinement progressif des méthodologies d’évaluation in vitro de la fonction cardiaque à un plus petit niveau de complexité permet une bonne intégration des résultats à l’ensemble du corps et de les traduire au scénario clinique7. Au total, l’utilisation d’échantillons stockés à -80 °C pour extraire les cardiomyocytes peut être une alternative attrayante.
Le tissu myocardique est coupé en petits morceaux et homogénéisé avec un mortier et un pilon. Le résultat de cette homogénéisation est une suspension des cellules empaquetées et isolées écorchées avec des degrés variables de dommages sarcolemmal, dans lequel le myoplasme est exposé au milieu de bain et tous les composants cellulaires sont lavés. Des structures telles que les myofibriles qui sont plus loin de la sarcolemma sont préservées. Ainsi, le raccourcissement sarcomere et les propriétés fonctionnelles associées à l’appareil myofibrillar sont maintenus intacts et peuvent êtreenregistrés 8,9.
Le système de mesure de la force cardiomyocyte se compose d’un moteur électromagnétique, utilisé pour ajuster la longueur des cardiomyocytes, et d’un transducteur de force, qui mesure la contraction cardiomyocyte isométrique. Un cardiomyocyte perméabilisé ou écorché est placé dans une chambre expérimentale contenant une solution relaxante ([Ca2+] < 10 nM) et collée au silicium à 2 aiguilles minces : l’une attachée au moteur et l’autre au transducteur de force. Un système optique est utilisé pour déterminer la morphologie des cardiomyocytes et la longueur du sarcome. Le protocole expérimental consiste souvent en une série d’enregistrements de force sur des solutions tampons contenant différentes concentrations de Ca2+, la détermination de la cinétique entre actine et myosine et la mesure de la tension passive des cardiomyocytes montés à des longueurs de sarcomere prédéfinies (figure 1). L’isolement des cardiomyocytes perméabilisés des échantillons myocardiques congelés dans de l’azote liquide (et ensuite stockés à -80 °C) est une technique qui utilise la mécanique cellulaire et la biochimie protéique pour mesurer la force maximale ca2+activée (active) par zone transversale (Tactive,kN◊m-2),Ca2+-indépendante tension (passive) (Tpassive,kN◊m-2),myofilaments Ca2+-sensibilité (pCa50),monofilaments cooperativity (nHill), taux de réaménagement de la force (ktr) ainsi que dépendances de longueur sarcomere de Tactive,Tpassive, pCa50, nHill et ktr.
Le but de ce protocole est d’illustrer et de résumer le potentiel du système de mesure de la force cardiomyocyte comme une procédure fiable pour évaluer les propriétés mécaniques fonctionnelles des cardiomyocytes à peau unique isolés d’échantillons congelés de différentes espèces.

<table><tbody><tr><td>Acétone</td><td>Sigma</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate disodium hydraté (Na2ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de calcium (CaCO3)</td><td>Merck</td><td>1.02067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>VWR</td><td>24720.157</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2.6H2O)</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorure de magnésium (MgCl2 1M)</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Bis(2-hydroxyéthyl)taurine (BES)</td><td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Hydrate de sel disodique de phosphocréatine (Na2PCr)</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Merck</td><td>8.14353.1000</td><td></td></tr><tr><td>Acide propionique (C3H6O2)</td><td>Merck</td><td>8.00605.0500</td><td></td></tr><tr><td>Tube compressible en silicone</td><td>Marineland</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>Tritiplex (EGTA)</td><td>Merck</td><td>1.08435.0025</td><td></td></tr><tr><td>Triton&reg ; X-100 10 %</td><td>Merck</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur de tissus (GKH GT Motor Control)</td><td>Contrôleur de longueur Terre Haute Glas-col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(modèle 315C-I)</td>Capteur de force <td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(modèle 403 A)</td><td>Logiciel Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 600A</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sotware VSL (modèle 900B)</td><td>Microscope inversé Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(IX51)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Dans cet article, nous décrivons les étapes nécessaires pour isoler un seul cardiomyocyte permeabilisé (« écorché ») et l’attacher à un appareil de mesure de la force et un moteur pour effectuer des études fonctionnelles. Ces études permettront de mesurer la rigidité cardiomyocyte (force passive) et son activation avec différentes solutions contenant du calcium (Ca2+) pour déterminer, entre autres: le développement maximal de la force, le myofilament Ca2+-sensibilité (pCa50),la cooperativité (nHill) et le taux de réaménagement de la force (ktr). Cette méthode permet également de déterminer les effets des médicaments agissant directement sur les myofilaments et de l’expression de protéines recombinantes exogènes sur les propriétés actives et passives des cardiomyocytes. Cliniquement, les études écorchées de cardiomyocyte mettent en évidence la pathophysiologie de beaucoup de maladies myocardiques et permettent l’évaluation in vitro de l’impact des interventions thérapeutiques ciblant les myofilaments. Au total, cette technique permet de clarifier la pathophysiologie cardiaque en étudiant les corrélations entre les paramètres in vitro et in vivo dans les modèles animaux et les tissus humains obtenus lors d’une chirurgie à cœur ouvert ou d’une greffe.

Ce protocole vise à décrire étape par étape la technique d’extraction et d’évaluation de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés. Cette méthodologie permet la mesure et la modulation aiguë de la fonction myofilament à l’aide de petites biopsies congelées qui peuvent être recueillies à différents endroits cardiaques, des souris aux hommes.

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Cette technique permet de clarifier la physiopathologie des maladies cardiaques grâce à l’étude de la corrélation entre les paramètres in vitro et in vivo dans des modèles animaux et chez l’homme. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier la fonction profonde des myofilaments à l’aide de très petites biopsies ou d’échantillons conservés congelés. Cette technique permet d’évaluer in vitro l’impact des interventions thérapeutiques sur les myofilaments.Avant de tenter une expérience, il est conseillé de pratiquer l’extraction des cardiomyocytes plusieurs fois pour apprendre à sélectionner, coller et activer les cardiomyocytes de bonne taille, striation et forme. Avant de commencer la procédure, réglez la température de l’appareil d’essai dans la chambre à 15 degrés Celsius et allumez le capteur de force et le moteur. Décongelez trois à cinq microgrammes d’échantillon myocardique dans une boîte de Pétri contenant 2,5 millilitres de solution ISO relaxante et utilisez un scalpel pour couper précisément le tissu en petits morceaux sans causer de dommages cellulaires inutiles.Lorsque tout le tissu a été coupé, utilisez une pointe de pipette coupée pour transférer tout le volume de solution et de fragments de tissu dans un verre Potter-Elvehjem et utilisez un broyeur pour perturber mécaniquement le tissu à 30 à 40 rotations par minute. Lorsqu’une bonne suspension cellulaire a été obtenue, ajoutez 250 microlitres de Triton dans un tube de 15 millilitres contenant 2,25 millilitres de relax ISO et ajoutez la suspension cellulaire à la solution résultante. Retournez doucement le tube trois fois pour mélanger et laissez le tube reposer à température ambiante pendant une minute, suivi d’une incubation de quatre minutes sur de la glace.À la fin de l’incubation de la glace, portez le volume final du tube à 15 millilitres avec des ISO de relaxation supplémentaires et mélangez les tubes trois fois par inversion comme démontré, puis centrifugez les cellules, puis retirez soigneusement presque tout le liquide sauf les trois derniers millilitres du surnageant. Après le dernier lavage, retirez le surnageant jusqu’à un volume de cinq à 10 millilitres de suspension cellulaire. Pour la sélection de cardiomyocytes cutanés, ajoutez une goutte de suspension cellulaire sur une lamelle placée sur une lame de verre dans un porte-lames de microscope inversé et utilisez l’objectif 20X pour sélectionner un seul cardiomyocytes en forme de bâtonnet avec un bon motif de striation et une bonne taille.Utilisez vos deux mains pour faire pivoter la lamelle jusqu’à ce que le cardiomyocyte sélectionné soit positionné horizontalement avec ses extrémités alignées avec l’aiguille du capteur de force et le moteur, et utilisez une pointe de pipette pour placer une fine ligne de colle le long du côté de la lamelle. Pour coller la cellule en place, plongez les pointes de l’aiguille du capteur de force et du moteur dans la ligne de colle pour créer un halo de colle autour des deux pointes et déplacez rapidement la pointe de l’aiguille du capteur de force vers le bas afin qu’elle se colle à un bord du cardiomyocyte. Répétez cette procédure avec l’extrémité du moteur et l’autre extrémité de la cellule.Après cinq à huit minutes, déplacez les deux micromanipulateurs simultanément pour soulever les aiguilles d’environ 15 micromètres afin d’éviter de coller la cellule à la lamelle. Pour mesurer les forces actives et passives et la sensibilité au calcium, remplissez le premier puits expérimental avec 55 à 100 microlitres de solution relaxante et remplissez le deuxième puits expérimental avec 55 à 100 microlitres de solution activatrice. À l’aide du logiciel de la caméra, réglez la région d’intérêt sur une zone du cardiomyocyte avec un motif de striation clair et réglez la longueur du sarcomère sur 2,2 micromètres.Mesurez la distance entre les deux extrêmes du cardiomyocyte et enregistrez la valeur sous forme de longueur du myocyte dans le logiciel. Ensuite, déplacez les aiguilles légèrement plus haut et déplacez doucement la platine du microscope de sorte que la cellule se déplace de la lamelle au puits contenant la solution relaxante à l’arrière de la platine. Sélectionnez le protocole qui contient deux raccourcissements cellulaires à produire lorsque la cellule est émergée séquentiellement dans les solutions de calcium et de relaxation.Pour provoquer une contraction isométrique, déplacez la platine du microscope de manière à ce que le cardiomyocyte passe de la solution relaxante à la solution activatrice. Lorsque vous atteignez le plateau de force, commencez à enregistrer les données de force. Après 10 secondes, passez la cellule à la solution relaxante et enregistrez les données jusqu’à ce que le test s’arrête.Pour déterminer la sensibilité au calcium, remplacez la solution d’activation par 55 à 100 microlitres de chaque solution de calcium et enregistrez les données comme nous venons de le démontrer. À la fin de la mesure, étirez les pointes du capteur de force et du moteur pour retirer les aiguilles de la cellule et utilisez un coton-tige imbibé d’acétone pour retirer soigneusement le halo de colle des pointes des aiguilles. Bien qu’un certain degré de détérioration et de diminution de la force soit attendu après des expériences prolongées, les valeurs de tension active au sein des cardiomyocytes perméabilisés fonctionnels devraient être relativement stables.Ici, des traces de force représentatives de trois des huit enregistrements de force nécessaires à la réalisation d’un protocole de sensibilité au calcium des myofilaments sont présentées. En transférant la cellule dans un puits contenant la solution d’activation, les cardiomyocytes commencent à développer une force jusqu’à ce qu’ils atteignent un plateau. Après un test de mou rapide, les valeurs de base de force nulle peuvent être obtenues.La pente de la dernière partie de cette courbe peut être utilisée pour déterminer la valeur du taux de redéveloppement de la force, qui est une mesure du taux apparent d’attachement et de détachement du pont transversal. Après avoir transféré la cellule dans un puits contenant la solution relaxante, la cellule se détend et sa force diminue. En plus de la sensibilité calcique du myofilament et des mesures d’activation dépendantes de la longueur, les dépendances de la longueur du sarcomère de la tension passive et les dépendances de la longueur du sarcomère de la force activée par le calcium par section transversale et de la tension indépendante du calcium peuvent être calculées.Enfin, il est important de noter que la façon dont les cardiomyocytes sont isolés impacte significativement les résultats. L’utilisation de cardiomyocytes cutanés pour évaluer la fonction cardiaque in vitro est une technique importante pour clarifier les changements qui se produisent au niveau cellulaire ainsi que pour étudier les mécanismes des myofilaments dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. Cette méthode a l’avantage de nécessiter une quantité minimale d’échantillon myocardique et de permettre l’utilisation de cardiomyocytes d’un large éventail d’espèces, de localisations cardiaques et de pathologies.

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