Préparation des mitochondries à partir des tissus du cancer de l'ovaire et des tissus ovariens de contrôle pour l'analyse quantitative de la protéomique

Les changements mitochondriaux jouent un rôle important dans les cancers de l’ovaire chez l’homme. Ce protocole établit une plate-forme efficace pour isoler et purifier les mitochondries du cancer de l’ovaire humain et des tissus de contrôle pour l’analyse protéomique à grande échelle. Les mitochondries, en tant que centres du métabolisme énergétique, de la signalisation cellulaire et du stress oxydatif, la perspicacité dans les changements mitochondriques de protéome dans les cancers de l’ovaire bénéficient à notre mécanisme moléculaire de compréhension, et est une découverte des biomarqueurs efficaces et des cibles thérapeutiques.

Cette technique utilise la centrifugation à vitesse différentielle en combinaison avec la centrifugation du gradient de densité pour séparer les mitochondries du cancer de l’ovaire humain dans les tissus de contrôle, ce qui entraîne des échantillons de mitochondries de haute qualité pour l’analyse quantitative de la protéomique. La préparation des mitochondries, couplée à la protéomique quantitative iTRAQ, a été utilisée avec succès dans l’analyse du tissu du cancer de l’ovaire humain, qui se traduit facilement pour analyser d’autres tissus, la protéomique des mitochondries. Ceux qui n’ont jamais effectué cette méthode peuvent constater qu’il peut être difficile d’isoler les mitochondries du contrôle ovarien que les tissus cancéreux.

Il est nécessaire d’ajouter une trypsine pour améliorer l’homogénéisation des tissus de contrôle et ajouter une couche supplémentaire de milieu de gradient de densité pour améliorer la séparation des mitochondries. Pour commencer cette procédure, préparez 250 millilitres du tampon d’isolement mitochondrial tel que décrit dans le protocole de texte. Placer environ 1,5 gramme de tissus du cancer de l’ovaire dans un plat en verre propre.

Ajouter deux millilitres de tampon d’isolement mitochondrial pré-refroidi pour laver légèrement le sang de la surface du tissu. Répétez ce lavage trois fois. Ensuite, utilisez des ciseaux ophtalmiques propres pour hacher complètement le tissu en morceaux d’environ un millimètre cube, et transférer les tissus hachés dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres.

Ajouter 13,5 millilitres de tampon d’isolement mitochondrial contenant nagarse à une concentration de 0,2 milligramme par millilitre. Utilisez un homogénéiseur électronique pour homogénéiser les tissus hachés pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Après cela, ajouter encore trois millilitres de tampon d’isolement mitochondrial pour les homogénéités tissulaires et bien les mélanger par pipetting.

Centrifugeuse le tissu préparé homogénéiser à 1300 xg, et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirer la pastille et garder le surnatant. Ensuite, centrifuger le supernatant à 10 000 xg et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Retirez le supernatant contenant du microsome et gardez la pastille. Ajouter 2 millilitres de tampon d’isolation mitochondrial et suspendre à nouveau la pastille à fond par un tuyau lumineux. Centrifugeuse cette suspension à granulés à 7000 xg et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Jeter le supernatant, et garder la pastille, qui contient les mitochondries brutes. Ajouter 12 millilitres de 25% de densité de gradient moyen pour suspendre à nouveau les mitochondries brutes extraites. Faites un gradient de densité discontinu contenant les mitochondries brutes re-suspendues comme décrit dans le protocole de texte, et centrifugez-la à 52.000 xg, et à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes.

Utilisez une seringue longue et émoussée pour recueillir les mitochondries purifiées à l’interface entre les médiums de gradient de 25% et 30%, et transférez-la dans un tube propre. Ajouter le tampon d’isolement mitochondrial aux mitochondries collectées pour le diluer à un volume triple. Centrifugeuse à 15 000 xg, et à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Jetez le surnatant et gardez la pastille. Recueillir la pastille finale qui contient les mitochondries purifiées, et le stocker à 20 degrés Celsius. Tout d’abord, préparez 250 millilitres du tampon d’isolement mitochondrial tel que décrit dans le protocole de texte.

Ajouter environ 1,5 gramme des tissus ovariens de contrôle normaux à un plat en verre propre. Ajouter deux millilitres de tampon d’isolement mitochondrial pré-refroidi pour laver légèrement le sang de la surface du tissu. Répétez ce lavage trois fois.

À l’aide de ciseaux ophtalmiques propres, hacher complètement le tissu en morceaux d’environ 1 millimètre cube et transférer les tissus hachés dans un tube propre de 50 millilitres. Ajouter huit millilitres d’une solution contenant 0,05% trypsine et 20 millimolaire EDTA et PBS aux tissus de contrôle hachés, et digérer à température ambiante pendant 30 minutes pour aider à lyse les cellules et libérer les mitochondries. Centrifugeuse à 200 xg pendant cinq minutes.

Jetez le surnatant et gardez les tissus et les cellules. Ajouter 13,5 millilitres de tampon d’isolement mitochondrial contenant du nagarse à une concentration de 0,2 milligramme par millilitre, et utiliser un homogénéisateur électrique pour homogénéiser les tissus hachés à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Ajouter trois millilitres de tampon d’isolement mitochondrial aux homogénéités tissulaires et bien mélanger par pipetting.

Centrifugeuse le tissu préparé homogénéiser à 1300 xg et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirer la pastille et garder le surnatant. Centrifugeuse le supernatant à 10 000 xg et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Retirer le supernatant, qui contient les microsomes, et garder la pastille. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de tampon d’isolation mitochondrial et suspendez complètement la pastille par pipetting léger. Centrifugeuse cette suspension à granulés à 7000 xg et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Jetez le supernatant et gardez la pastille qui contient les mitochondries brutes. Ajouter 12 millilitres de 25% de densité de gradient moyen pour suspendre à nouveau les mitochondries brutes extraites. Faites un gradient de densité discontinu contenant les mitochondries brutes telles qu’elles sont décrites dans le protocole de texte, et centrifuger à 52 000 xg et à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes.

Utilisez une seringue longue et émoussée pour recueillir les mitochondries purifiées dans la gamme de l’interface entre les médiums de gradient de 25 et 30% à l’interface entre les médiums de gradient de 34 et 38%. Transférer les mitochondries purifiées dans un tube propre. Ajouter le tampon d’isolement mitochondrial aux mitochondries collectées pour le diluer à un volume triple.

Centrifugeuse à 15 000 xg et à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes, et jeter le supernatant. Ajouter 2 millilitres de tampon d’isolement mitochondrial pour suspendre à nouveau la pastille et la centrifugeuse à 15 000 xg et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Jetez le supernatant et gardez la pastille.

Recueillir la pastille finale et la stocker à 20 degrés Celsius. Dans cette étude, des échantillons mitochondriques de haute qualité sont préparés à partir du cancer de l’ovaire humain et des tissus de contrôle pour la protéomique quantitative à grande échelle. Il y a quelques différences dans la préparation des mitochondries des tissus de cancer ovarien et contrôlent des tissus ovariens, y compris en utilisant un gradient discontinu différent de densité.

Après centrifugation, les mitochondries purifiées des tissus du cancer de l’ovaire se trouvent à l’interface entre 25% et 30%, tandis que celles des tissus ovariens de contrôle se trouvent dans la gamme de l’interface entre 25% et 30% à l’interface entre 34% et 38%La qualité des mitochondries préparées est ensuite évaluée avec centrifugation différentielle de vitesse et centrifugation de gradient de densité par microscopie électronique. Les images du microscope électronique démontrent que dans les cancers de l’ovaire et les tissus ovariens de contrôle, les principaux organites isolés sont les mitochondries, à l’exception d’une petite quantité de peroxisomes. Cependant, la morphologie des mitochondries est vue pour changer plus dans les cancers ovariens que le tissu ovarien de contrôle.

La qualité des mitochondries préparées est également évaluée par tache occidentale. Les images occidentales de tache démontrent également que le composant principal dans les échantillons mitochondriques préparés des cancers ovariens et des ovaires témoins est mitochondries, excepté une petite quantité de peroxisomes, qui est compatible avec l’analyse électronique de microscopie. Il est raisonnable que les peroxisomes soient contenus dans les mitochondries préparées, parce que les mitochondries interagissent beaucoup avec les peroxisomes, ce qui reflète à son tour l’exhaustivité fonctionnelle des mitochondries.

Ces résultats démontrent la haute qualité des échantillons mitochondriaux préparés. Lorsque je fais cette procédure, il est très important que vous hacher complètement les tissus avant l’homogénéisation, et ajouter la trypsine aux tissus de contrôle hachés. Il est également important que vous faites et ou préparé le gradient de densité discontinue pour les échantillons de cancer et les contrôles.

Après cette procédure, iTRAQ ou TMT protéomique quantitative ou phosphoproteomics peuvent être exécutés pour clarifier le profil de protéome de mitochondries de cancer ovarien, et le profil de phosphoproteome peut être établi pour clarifier les rôles des mitochondries dans le cancer ovarien dans de grandes profondeurs. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour étudier systématiquement le protéome des mitochondries et le phosphoprotéome dans le cancer de l’ovaire, construire le système de réseau de voies de signalisation et découvrir les biomarqueurs fiables et les cibles thérapeutiques.