Augmentation de la durabilité des cultures de cellules neurales dissociées à l’aide d’une matrice coralline biologiquement active

L’importance de ce protocole est qu’il fournit une nouvelle façon d’augmenter la durabilité et la croissance des neurones, des cellules gliales et des cellules souches in vitro. Il s’applique également à d’autres cellules. Le principal avantage de la technique est l’utilisation d’une matrice faite de squelette de corail.

Cette matrice nourrit et protège les cellules neurologiques et favorise la repousse. Soutenant les cellules neurales in vitro, le squelette corallien peut fonctionner de la même manière qu’un implant régénératif dans les sites de lésions cérébrales. Pour commencer, utilisez un marteau pour briser le squelette de corail et divisez-le en fragments de 0,5 à deux centimètres.

Afin de dissoudre les résidus organiques et non organiques, faites tremper les fragments de squelette corallien dans une solution d’hypochlorite de sodium à 10 % pendant 10 minutes. Ensuite, lavez une fois avec de l’eau distillée doublement. Pour éliminer les résidus organiques restants, faites tremper les fragments dans une solution molaire d’hydroxyde de sodium pendant cinq minutes, puis lavez-les une fois avec de l’eau doublement distillée.

Poursuivez l’élimination des dépôts organiques en trempant les fragments dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 30 % pendant 10 minutes et lavez les fragments trois fois avec de l’eau distillée doublement. Retirez autant d’eau double distillée que possible et laissez sécher les fragments de corail dans la capuche. Nettoyez ensuite les lamelles en verre en les trempant dans 10 millilitres d’éthanol à 95 % dans une boîte de Pétri en verre de 100 millimètres.

Après 15 minutes, retirez l’éthanol et lavez-le trois fois à l’eau distillée, en attendant 10 minutes entre chaque lavage. Retirez l’eau distillée deux fois et placez le plat sur une plaque chauffante préchauffée à 80 degrés Celsius. Ensuite, remuez doucement les lamelles jusqu’à ce que l’eau distillée deux fois s’évapore.

Autoclave les glisses de couverture. Broyez les fragments de squelette de corail à l’aide d’un mortier et d’un pilon jusqu’à ce qu’ils se décomposent complètement. On obtient un mélange de grains d’une taille allant de 20 à 200 micromètres.

Vous pouvez également broyer les fragments de squelette de corail à l’aide d’une machine à broyer électrique d’une longueur de lame de six centimètres et d’une largeur de 0,5 à un centimètre, à une vitesse de 1000 tr/min pendant 30 secondes. Pour purifier les grains, transférez-les sur une crépine électrique à mailles filtrantes de 40 microns. Ajustez les paramètres de la crépine électrique pour qu’elle secoue à 600 amplitudes par minute et rebondisse six fois par seconde.

Puis autoclavez les grains. Dans des conditions stériles, ajoutez les grains du squelette de corail dans une solution PDL de 20 microgrammes par millilitre, dissoute dans la solution de Hank pour atteindre la concentration de cinq milligrammes ou 10 milligrammes de grains par solution PDL d’un millilitre. Versez la solution dans des flacons et des plats à la concentration d’environ deux millilitres par 25 centimètres carrés, et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Les grains coulent et se fixent au fond. Le lendemain, lavez une fois les flacons et la vaisselle avec de l’eau stérile double distillée. Laissez sécher les flacons et la vaisselle dans la hotte.

Pour recouvrir le lamelle de verre, ajoutez d’abord des grains de squelette de corail à de l’eau distillée deux fois à une concentration de cinq ou 10 milligrammes par millilitre. Placez les lamelles sur une plaque chauffante préchauffée à 80 degrés Celsius. Ensuite, versez 40 microlitres de la solution de grains au centre de la lamelle et attendez 15 minutes pour une évaporation complète.

Cela aura pour conséquence que les grains adhèrent à la lamelle. Autoclavez les lamelles enrobées et stockez-les dans des conditions stériles. Ensuite, placez les lamelles sur le couvercle d’une plaque stérile à 24 puits, ajoutez 100 microlitres de solution PDL de 20 microgrammes par millilitre à chaque lamelle.

Utilisez l’astuce pour vous assurer que le liquide recouvre toute la région du grain et le reste de la surface de la lamelle. Couvrez le couvercle avec le fond de l’assiette et enveloppez les côtés de l’endroit d’un film de paraffine. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, lavez une fois les lamelles de couverture avec de l’eau distillée deux fois et séchez-les dans la capuche. Après avoir préparé des têtes de rats, tenez-les par la bouche avec une grande pince à épiler. Coupez la peau recouvrant le crâne avec un petit ciseau.

Avec des ciseaux propres, entrez sous le crâne sur le côté du cervelet et coupez le crâne à droite et à gauche pour permettre son retrait. À l’aide d’une petite pince à épiler, décollez le crâne du cerveau. Séparez le cerveau de la tête et mettez-le dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant deux millilitres de MEM froid.

À l’aide d’un stéréomicroscope, utilisez deux petites pinces à épiler pour disséquer l’hippocampe. Transférez l’hippocampe dans le plat préparé de 35 millimètres contenant du MEM. Coupez l’hippocampe en tranches d’environ un millimètre à l’aide du scalpel.

Ajouter 200 microlitres de solution de trypsine. Mélangez doucement et incubez à 37 degrés Celsius et 5 à 10 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez deux millilitres de MEM froid dans la boîte pour désactiver la trypsine.

Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre du plus grand diamètre, transférez le tissu trypsinisé dans un tube de 15 millilitres contenant un millilitre de milieu du premier jour, préchauffé à 37 degrés Celsius. Triturez le tissu en le passant 10 à 15 fois dans la pipette en verre de plus grand diamètre. Répétez ensuite ce processus à l’aide de la pipette en verre de diamètre moyen.

Poursuivez la trituration avec la pipette de plus petit diamètre. Évitez les bulles pour réduire la mort cellulaire. Laissez couler les morceaux de tissu dissociés pendant deux à cinq minutes.

Transférez ensuite le surnageant dans un autre tube de 15 millilitres. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour atteindre la densité cellulaire préférable entre 200 000 et 400 000 cellules par millilitre.

Utilisez le moyen du premier jour pour diluer. Ensuite, ensemencez 100 microlitres de cellules sur chaque lamelle de verre. Assurez-vous de couvrir toute la lamelle avec des cellules.

Incuber à 37 degrés Celsius et à 5 à 10 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajoutez 500 microlitres de milieu de croissance neuronale dans les puits. À l’aide d’une pince à épiler, retirez le milieu du premier jour en inclinant la lamelle et en transférant doucement chaque lamelle dans son puits approprié.

Aspirez le fluide restant du couvercle. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et à 5 à 10 % de dioxyde de carbone. Maintenez l’incubateur humidifié au maximum à l’aide d’un bac d’eau au fond de l’incubateur.

Ne remplacez pas le fluide. Les cultures peuvent être maintenues dans ces conditions jusqu’à un mois. Dans cette étude, les machines de meulage manuelles et électriques ont toutes deux donné des résultats similaires, avec un mélange de grains d’une taille comprise entre 20 et 200 micromètres.

Les crépines manuelles ou électriques produisaient deux types de mélanges de grains. L’un avec des grains d’une taille allant de 40 à 200 micromètres, et le second d’une taille de 40 micromètres ou moins. Les micrographies à contraste de phase montrent que la culture de cellules hippocampiques sur des lamelles recouvertes de grains de squelette corallien formait des réseaux neuronaux complexes en l’absence et en présence de la matrice.

La coloration des noyaux cellulaires a indiqué que 14 jours après l’ensemencement, la densité cellulaire était plus élevée sur la matrice que sur les lamelles non enrobées. La coloration avec la protéine deux associée aux microtubules a montré qu’un réseau neuronal et dendritique complexe se formait sur la matrice par rapport au contrôle. De plus, les cellules gliales cultivées sur la matrice du squelette corallien visualisées à l’aide de la protéine acide fibrillaire gliale ont subi des changements morphologiques significatifs.

Elles ont acquis une apparence plus épineuse, avec des processus plus longs, que les cellules gliales cultivées sur le substrat de contrôle, où elles semblaient plus rondes et plus plates. Lors de l’isolement des cellules, il est important de se rappeler de travailler vite, de maintenir le pH en ajoutant du CO2 si nécessaire, et de travailler aussi doucement que possible afin d’éviter le détachement des grains de corail.