Une plate-forme intégrée de spectroscopie et de spectrométrie de masse Raman pour étudier l'apport, le métabolisme et les effets des médicaments à une seule cellule

Nous avons développé une méthode innovante pour la métabolomique. Nous avons combiné l’imagerie spectrale du Beffroi des cellules vivantes avec la spectrométrie de masse unicellique. Notre technique peut surveiller et prédire les changements métaboliques des cellules individuelles contre les médicaments.

Et cela ouvre beaucoup d’applications pour la recherche fondamentale et l’industrie. Notre méthode ajoute une résolution à cellule unique aux techniques actuelles d’évaluation des médicaments qui faciliteront grandement les efforts futurs de découverte de médicaments. Notre technique peut également nous aider à comprendre le rôle joué par l’hétérogénéité cellulaire dans la résistance au cancer.

L’échantillonnage à cellule unique et l’analyse des données sont les aspects les plus difficiles de cette expérience. Nous travaillons actuellement à l’automatisation de ces deux étapes, en particulier la partie échantillonnage. Nous vous recommandons de pratiquer l’échantillonnage à cellule unique bien avant l’expérience, car chaque configuration de micromanipulateur est légèrement différente et vous devriez prendre le temps de vous familiariser avec les contrôles.

Après l’incubation de cellules pour atteindre 70% de confluence, cellules de culture d’intérêt dans un média de culture approprié, ajouter pénicilline-streptomycine pour éviter la contamination. Après avoir mesuré la densité cellulaire sur un hémocytomètre, les cellules de sous-culture dans un plat de grille inférieure en verre de 35 millimètres ou des glissières de quartz, en utilisant le même milieu à une densité d’ensemencement de 0,7 fois 10 à la sixième. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, les cellules atteignent une confluence de 50 à 60% Laver les cellules deux fois avec tampon PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Divisez les cellules en sous-groupes traités par drogue et non traités en plats de culture de 35 millimètres. Mélanger tamoxifène dissous dans du sulfoxyde de diméthyle avec le média de culture pour obtenir un volume final de deux millilitres et la concentration de Tamoxifen de 10 micromolaires.

C’est le groupe traité par drogue. Mélanger un volume correspondant de DMSO dans le milieu en tant que groupe témoin pour étudier les effets du DMSO. Incuber les deux groupes en deux millilitres du média à pointes pendant 24 heures pour atteindre une confluence de 70 à 80 % Avant les mesures spectrales, vérifiez le sténopé et la correspondance de position laser à l’aide d’une cible.

Pour calibrer le spectrophotomètre avant chaque expérience, placez l’éthanol dans un plat de fond en verre, mesurez le spectre à une intensité laser donnée pendant une seconde et associez le pic aux longueurs d’onde connues. Ensuite, installez la micro-chambre à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Une fois que le système de microscope est prêt, retirez les cellules de l’incubateur et rincez immédiatement les cellules deux fois avec un tampon PBS réchauffé à 37 degrés Celsius.

Ajouter ensuite deux millilitres de PBS réchauffé ou de FluoroBrite DMEM. Ajouter 10 microlitres d’eau sur la lentille objective d’immersion dans l’eau. Et placez délicatement le plat de cellule de fond en verre sur l’étape de microscope.

Fixez le système d’échantillonnage cellulaire sur le microscope Raman. Connectez le micromanipulateur 3D au support capillaire en verre qui est fixé à une seringue vide pour la succion de l’échantillon. Réglez le microscope à un champ de grossissement élevé de 40 fois pour observer la pointe du capillaire en verre, et assurez-vous qu’il n’est pas cassé.

Contrôlez la position du capillaire en verre à l’aide du micromanipulateur. Assurez-vous que la pointe capillaire est centrée dans le champ de vision. Déplacez ensuite le capillaire vers le haut sur l’axe Z pour donner l’autorisation pour le plat de culture plus tard.

Placez le plat d’échantillon sur la scène du microscope, ajustez le grossissement et concentrez-vous, sélectionnez la cellule cible sur le plat de grille, et déplacez-la au centre de la vue. Mesurez chaque cellule en concentrant la ligne laser. Un temps d’exposition de 15 secondes par cellule est suffisant pour obtenir une section transversale d’une cellule avec un signal Raman clair.

Un galvano-miroir permet la numérisation d’une cellule ou d’un groupe de cellules en quelques dizaines de minutes. Ensuite, abaissez soigneusement le capillaire en verre à l’aide d’un micromanipulateur jusqu’à ce que la pointe soit mise au point. Sous observation microscopique, toucher la cellule unique cible avec la pointe capillaire.

Ensuite, commencez à appliquer une pression négative à l’aide de la seringue pour piéger la cellule à l’intérieur de la pointe capillaire. Enregistrez cette procédure en prenant une vidéo pour vérifier le moment et l’emplacement aspiré de la cellule avec précision. Déplacez le capillaire vers le haut sur l’axe Z.

Détachez ensuite le capillaire du support capillaire à l’aide de forceps en préparation de l’analyse de spectrométrie de masse. Après la mise en place de l’instrument de spectrométrie de masse et l’analyse des supports, ajouter deux microlitres du solvant d’ionisation au capillaire contenant la cellule. Fixez le capillaire à un adaptateur nano-électrospray relié à un spectromètre de masse approprié et démarrez la méthode d’acquisition automatique.

Une analyse comparative du spectre moyen de chaque condition, avec et sans traitement médicamenteux, est montrée ici. Le spectre moyen des deux conditions diffère clairement à différents sommets. En particulier, les pics à 1000 par centimètre, ce qui est un signe pour les composés aromatiques tels que la phénylalanine et la tyrosine, montrent de fortes différences.

Sur la base de la projection sur le modèle de structure latente, les scores VIP ont été calculés qui représentent l’importance des longueurs d’onde dans la discrimination des conditions expérimentales. Fait important, les pics les plus élevés des profils VIP correspondaient aux pics raman pour lesquels de fortes différences ont été observées entre les deux traitements. Ceci a confirmé les différences moléculaires spécifiques entre les cellules traitées et non traitées.

Après identification positive, l’abondance relative du médicament et de ses métabolites a été mesurée dans chaque cellule et comparée aux pics de fond dans les cellules non traitées. De fortes variations ont été observées dans l’abondance du tamoxifène. Et ce phénomène a été encore plus prononcé dans le cas de son métabolite 4-hydroxy-tamoxifène.

Les chercheurs peuvent être intéressés à explorer le lien entre les images spectrales et les profils métaboliques des cellules. Notre recherche a également des applications industrielles car elle permet le criblage local des cellules pour la fabrication pharmaceutique. Il faut prendre soin de préparer le solvant d’ionisation pour les mesures du spectromètre de masse.

Il doit être préparé sous un capot de fumée. Aussi, veillez à ne pas toucher la source iration de l’instrument spectromètre de masse pour éviter d’être électrocuté. Enfin, les capillaires d’échantillonnage utilisés tout au long de la mesure sont très pointus, alors manipulez-les avec soin pour éviter les blessures.