Name: Une plate-forme intégrée de spectroscopie et de spectrométrie de masse Raman pour étudier lapport, le métabolisme et les effets des médicaments à une seule cellule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez une méthode innovante combinant spectroscopie Raman et spectrométrie de masse pour analyser le métabolisme cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette technique permet de surveiller les réponses aux médicaments et d'améliorer la découverte de nouveaux traitements.

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Les auteurs remercient Toshio Yanagida pour son soutien et les fonds de collaboration interne RIKEN attribués au Dr Arno Germond.

1. Culture cellulaire
<ol><li>Cellules de culture d'intérêt dans un média culturel approprié. La pénicilline-streptomycine peut être ajoutée pour éviter la contamination. Dans le cas des cellules HepG2, cellules de culture dans un milieu de culture contenant le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco (DMEM) complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) et 0,1% pénicilline-streptomycine. Pour faciliter les mesures de spectroscopie Raman, les cellules peuvent être cultivées sur un plat à fond de verre enduit de gélatine de 0,1 % ou des lames de quartz.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 2 jours à 37 oC et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.</li>
	<li>Synchroniser les cultures cellulaires pour atteindre 70% de confluence.</li>
	<li>Les cellules de sous-culture dans un plat de grille de 35 mm à fond de verre ou des glissières de quartz utilisant le même milieu à une densité d'ensemencement de 0,7 x 106, puis incuber à 37 oC pendant 24 h. REMARQUE : Les plats ou les lames de culture peuvent être pré-enduits avec la solution de revêtement de collagène ou de gélatine avec un rapport de surface de culture de 5 ug/cm2 pour leur permettre de fixer, assurant leur survie pendant la mesure.</li>
</ol>2. Traitement médicamenteux
<ol><li>Retirez les cultures cellulaires de l'incubateur et lavez 2x avec un tampon PBS préchauffé (37 oC). REMARQUE: Il est optimal d'enlever les cellules pour le traitement médicamenteux à une confluence de 50%-60%.</li>
	<li>Divisez les cellules en sous-groupes traités par des médicaments et non traités dans des plats de culture de 35 mm.</li>
	<li>Mélangez la drogue de choix avec les médias culturels. Par exemple, dissoudre le tamoxifène dans le sulfoxide de diméthyle (DMSO) et mélanger avec le support culturel pour obtenir un volume final de 2 ml et une concentration de tamoxifène de 10 M. Ce sera le groupe traité par la drogue.</li>
	<li>Mélanger un volume correspondant de solvant (DMSO) dans le milieu comme un contrôle pour étudier les effets de DMSO. Ce sera le groupe témoin.</li>
	<li>Incuber les deux groupes dans 2 ml des supports à pointes préparés en étapes 2.3-2.4 pour 24 h. La confluence attendue après l'incubation devrait être de 70%-80%.</li>
</ol>3. Imagerie spectrale Raman et traitement spectral
REMARQUE : Bien que les systèmes de spectroscopie de Raman soient disponibles dans le commerce, le système de spectroscopie Raman utilisé ici est un microscope confocal de balayage de ligne construit à la maison précédemment décrit7,8. En bref, ce système est équipé d'une diode de 532 nm pompé laser à l'état solide. La lumière laser est formée en un plan à l'aide d'une lentille cylindrique, ce qui permet de mesurer 400 spectres en une seule exposition. Les spectres Raman ont été enregistrés à l'aide d'une caméra CCD refroidie montée sur un polychromator qui utilise un grating de 1 200 rainures/mm pour maximiser la résolution spectrale de la région d'empreintes digitales (de 500 à 1 800 cm-1). Cette zone spectrale contient une forte densité de fréquences spécifiques aux molécules qui génèrent la diffusion de Raman. Une lentille d'immersion de l'eau (NA 0,95) est également utilisée. La résolution spatiale de ce système est de 300 nm et la résolution spectrale est de 1 cm-1. Pour assurer la survie des cellules pendant l'expérience, une microchambre fixée sur un stade de microscope motorisé est utilisée.
<ol><li>Avant les mesures spectrales, vérifiez l'alignement de l'optique. Un trou d'épingle de 50 m peut être utilisé pour vérifier que le trou d'épingle et la position laser correspondent exactement. Entrez dans la pari du spectrophotomètre lorsqu'il est rétréci autant que possible.</li>
	<li>Utilisez de l'éthanol pour calibrer le spectrophotomètre avant chaque expérience. Pour ce faire, placez EtOH dans un plat à fond de verre, mesurez le spectre à une intensité laser donnée (mesurée à l'échantillon) pendant 1 s, et associez le pic aux longueurs d'onde connues7.</li>
	<li>Réduire au minimum l'intensité laser de l'échantillon à 2,4 mW/m2 afin que les cellules survivent à l'exposition au laser.</li>
	<li>Installer la microchambre à 5% de CO2 et 37 oC.</li>
	<li>Une fois que le système de microscope est prêt, retirer les cellules de l'incubateur et rincer immédiatement les cellules 2x avec un tampon PBS réchauffé (37 oC), puis ajouter 2 ml de PBS réchauffé (37 oC) ou DMEM pour resuspendre les cellules. NOTES: Les médias PBS et FluoroBrite DMEM sont des options suffisantes pour les mesures de spectroscopie Raman parce qu'ils produisent un signal de fond minimal.</li>
	<li>Ajouter 10 l'eau sur la lentille objective d'immersion en eau et placer délicatement le plat à cellules à fond de verre sur le stade du microscope.</li>
	<li>Mesurez chaque cellule en concentrant la ligne laser. Un temps d'exposition de 15 s par cellule est suffisant ici pour obtenir une section transversale d'une cellule avec un signal clair de Raman. Un miroir de galvano permet la numérisation d'une cellule ou d'un groupe de cellules en quelques dizaines de minutes. NOTES: Une résolution plus élevée de l'imagerie spectrale complète des cellules nécessite plus de temps et peut conduire à photodamage. Ici, les cellules ont été mesurées à l'aide d'une exposition à une seule ligne pour obtenir une section transversale de chaque cellule. Cette approche est un bon compromis pour augmenter le débit et obtenir suffisamment d'informations pour discriminer les cellules, tout en assurant la viabilité des cellules en limitant les photodommages.</li>
</ol>4. Prétraitement des données spectrales et analyses multivariées
REMARQUE : Le prétraitement est une étape nécessaire avant une analyse supplémentaire afin d'éliminer les variations techniques indésirables dans les données spectrales. En raison de la diversité des méthodes et des logiciels, une liste exhaustive ne peut pas être fournie, et il ya beaucoup d'examens utiles trouvés dans la littérature7,8. Dans cette section, nous décrivons brièvement l'approche utilisée pour analyser et interpréter les données spectrales de Raman obtenues à partir de cellules individuelles vivantes.
<ol><li>Extraire et prétraiter les images raman pour éliminer les interférences possibles des rayons cosmiques. REMARQUE : L'axe spectral des spectres obtenus au cours de différents jours/semaines/mois peut inclure certaines variations dues à de petites variations techniques lors de l'étalonnage à l'aide d'éthanol. Cela aura un impact important sur les analyses multivariées et les comparaisons statistiques ultérieures. Dans le cas où des expériences sont effectuées au cours de différentes semaines/mois, de petites variations optiques sont attendues. Dans ce cas, les données doivent être interpolées pour corriger les déplacements spectrals éventuels des données à travers les expériences. Interpolation à l'aide de spline cubique est utilisée ici. Après cette étape, tous les axes spectrals doivent être alignés. Une plage de 500-1800 cm-1 est considérée pour l'analyse ultérieure.</li>
	<li>Extraire les données spectrales des cellules et de l'arrière-plan (absence de cellules) de chaque image à l'aide d'un algorithme fait maison. Soustrayez le signal d'arrière-plan du signal de la cellule. Ensuite, moyenne des spectres des pixels restants, ce qui devrait correspondre à une seule cellule. Les étapes suivantes sont effectuées à l'aide des spectres 2D des cellules.</li>
	<li>Effectuer une correction de base à l'aide du ModPoly9 ou de tout autre algorithme qu'il a estimé pour s'adapter suffisamment. Coupez la plage spectrale à 600-1700 cm-1 pour sélectionner la région d'empreinte digitale et s'assurer qu'il n'y a pas d'effets de bord indésirables sur les spectres en raison d'un mauvais ajustement polynomial.</li>
	<li>Effectuer une étape de normalisation telle que la normalisation des vecteurs (l'intensité à chaque nombre d'ondes est divisée par la norme globale l2 ou la valeur unique maximale d'un spectre) pour normaliser l'intensité spectrale10, bien que d'autres normalisations puissent être envisagées.</li>
	<li>Préparer un jeu de données avec l'étiquette appropriée pour chaque classe/condition. REMARQUE : Des analyses spectrales comparatives peuvent être effectuées pour explorer la nature des différences possibles entre les classes/conditions cellulaires (p. ex., en soustrayant le spectre moyen du groupe témoin à d'autres groupes afin d'identifier les régions d'intérêt [comme les biomarqueurs potentiels]). Les calculs des scores ANOVA et Fisher peuvent également être effectués10.</li>
	<li>Pour identifier les cellules traitées et non traitées en fonction des caractéristiques spectrales, des analyses multivariées peuvent être appliquées. Une donnée spectrale normalisée doit être utilisée comme ensemble de données de formation, et un jeu de données inconnu (sans étiquette) d'une expérience de repli devrait être utilisé comme données de test, si possible. REMARQUE : Analyse discriminante effectuée sur un vecteur d'une analyse principale des composants (PCA-DA10),projection sur des scores latents suivi d'une analyse discriminante (PLS-DA), et les machines vectorielles de soutien (SVM)11 sont des modèles souvent utilisés sur le terrain, et chacun présente des considérations statistiques différentes. Le prétraitement des données doit être effectué par conséquent.</li>
	<li>Utilisez l'apprentissage automatique qui correspond aux objectifs expérimentaux. Ici, une projection sur la structure latente (PLS) modèle est construit en utilisant la région d'empreintes spectrales de Spectres Raman (600-1,710 cm-1)11,12. Centre zona les données au besoin. Pour la validation croisée du modèle, différentes techniques peuvent être appliquées. REMARQUE: Ici, une validation croisée vénitienne aveugle avec 10 fractionnements est appliquée. La complexité du modèle (nombre de composants ou variable latente) doit être testée afin que le meilleur modèle minimise la valeur de l'erreur carrée moyenne racine (RMSE). Il a été constaté que trois vecteurs latents (LV) fournissaient la meilleure discrimination avec notre jeu de données.</li>
	<li>Identifier les pics spectrals Raman qui contribuent à la discrimination des cellules (p. ex., en traçant le score d'importance variable dans la projection [VIP] pour chaque nombre d'ondes Raman ou l'ampleur du coefficient de régression). NOTES: Le score VIP d'une variable est calculé comme une somme pondérée des corrélations au carré entre les composants PLS-DA et la variable d'origine. Les détails concernant PLS et l'algorithme de scores VIP peuvent être trouvés dans la littérature11,12.</li>
</ol>5. Configuration et procédures d'échantillonnage à cellule unique
<ol><li>Fixer le système d'échantillonnage cellulaire sur le microscope Raman comme le montre la figure 1. Connectez le micromanipulateur 3D au support capillaire en verre qui est attaché à une seringue vide pour aspirer l'échantillon en appliquant une pression négative (Figure 1).</li>
	<li>Mettre le microscope sur un champ de grossissement élevé (40x) pour observer la pointe du capillaire en verre et s'assurer qu'il n'est pas cassé. Contrôlez la position du capillaire en verre à l'aide du micromanipulateur (x-, y-, z-axes). Assurez-vous que la pointe capillaire est centrée dans le champ de vision, puis déplacez le capillaire vers le haut sur l'axe z pour donner l'autorisation pour le plat de culture plus tard. REMARQUE : Le microéchantillonnage des cellules est effectué par le capillaire en verre pour les cellules de diamètre s'établissant entre 10 et 15 m. Il est recommandé d'avoir un capillaire d'une taille d'alésage de 5 millions d'euros. Si la taille de l'alésage est trop petite, la pointe capillaire sera obstruée par la cellule, et si elle est trop grande, la sensibilité des mesures ultérieures de la SP peut être compromise.</li>
	<li>Placez la plaque d'échantillon/plat sur la scène du microscope, ajustez le grossissement et concentrez-vous, sélectionnez la cellule cible sur le plat de grille, et déplacez-la dans le centre de vue. Ensuite, abaissez soigneusement le capillaire en verre à l'aide d'un micromanipulateur (axe Z) jusqu'à ce que la pointe soit mise au point. REMARQUE: Assurez-vous de ne pas déplacer le capillaire dans les x- et y-axes jusqu'à ce que le capillaire est au point.</li>
	<li>Sous observation microscopique, touchez la cellule unique cible avec la pointe capillaire, puis commencez à appliquer une pression négative à l'aide de la seringue pour piéger la cellule à l'intérieur de la pointe capillaire. Enregistrez cette procédure en prenant une photo ou une vidéo pour vérifier le moment et l'emplacement aspiré de la cellule avec précision, si nécessaire.</li>
	<li>Déplacez le capillaire vers le haut sur l'axe z. Ensuite, détachez le capillaire du support capillaire à l'aide de forceps en préparation à l'analyse de la SP.</li>
</ol>6. Mesures de spectrométrie de masse
<ol><li>Calibrer la précision de masse de l'instrument MS selon les recommandations du fabricant. Après l'étalonnage, assurez-vous que l'erreur de masse n'est pas supérieure à 3 ppm.</li>
	<li>Optimisez l'instrument MS aux paramètres qui conviennent le mieux à l'analyte d'intérêt. REMARQUE : Dans le cas du tamoxifène et de l'analyse 4-OHT, les paramètres de l'instrument sont réglés sur les paramètres suivants : température capillaire d'entrée : 400 oC, tension de pulvérisation : 1500 V, objectif de contrôle automatique des gains (AGC) : 5,00E-06, niveau RF S-lentille : 90 %, gamme SIM : 347-397 m/z, temps d'injection maximum SIM : 200 ms, résolution SIM : 140 000 FWHM, FWHM, Gamme MS/MS: 50-400 m/z, Cible MS/MS AGC: 2.00E-05, MS/MS temps d'injection maximum: 100 ms, résolution MS/MS: 17.500 FWHM, Fenêtre d'isolement MS/MS: 1 m/z, MS/MS normalized collision energy (NCE): 35.</li>
	<li>Mettre en place une méthode d'acquisition automatique d'une durée de 5 minutes pour le mode SIM afin d'atteindre une quantitation relative, et une autre méthode de SP/MS pour l'identification positive du médicament et de son métabolite. Les paramètres de la méthode d'acquisition doivent être réglés sur les valeurs optimisées mentionnées à l'étape 6.2.</li>
	<li>Préparer le solvant d'ionisation sous une hotte de fumée. La composition du solvant dépend de l'analyte d'intérêt. Ici, le solvant organique utilisé se compose de 80% MeOH, 10% DMSO, et 0,1% d'acide formique.</li>
	<li>Mélanger une norme interne appropriée avec le solvant organique avant les mesures. Dans cette expérience, 5,31 nM de d5-tamoxifène est utilisé comme norme interne.</li>
	<li>Pour éviter les faux positifs, aspirez les médias entourant les cellules traitées avec le médicament à l'aide d'un capillaire de taille aléa de 1 m d'aperçage avec une observation microscopique constante pour éviter d'échantillonner des pièces cellulaires.</li>
	<li>Ajouter 2 ll du solvant d'ionisation à l'extrémité large du capillaire contenant le support à l'aide d'une pipette attachée aux pointes du chargeur. Ensuite, analysez les médias échantillonnés par MS, vérifiez la présence de l'analyte d'intérêt (normalement, il ne devrait pas être détectable).</li>
	<li>Ajoutez 2 L le solvant d'ionisation au capillaire contenant la cellule, fixez le capillaire à un adaptateur de nanoélectrospray (nano-ESI) relié à un spectromètre de masse approprié, et commencez la méthode d'acquisition automatique.</li>
</ol>7. Traitement et analyse de données de spectrométrie de masse
REMARQUE : Tout logiciel approprié peut être utilisé pour effectuer l'analyse des données. Toutefois, si les chercheurs souhaitent effectuer une analyse de données à l'aide d'un logiciel qui n'est pas fourni par le fournisseur de SP, les données brutes doivent être converties du format fournisseur propriétaire à un format ouvert ou en tant que fichier texte en premier (ce qui a été fait ici).
<ol><li>Normaliser les données en divisant la zone de pointe de l'analyte d'intérêt par celle de la norme interne à partir de la même analyse de la SP. Ensuite, le journal transforme les ratios de pointe pour réduire l'inclinaison.</li>
	<li>Tracer l'intensité normalisée du médicament ou de son métabolite comme une courbe de parcelle de terrain ou de densité pour visualiser la distribution entre les cellules individuelles. Ici, le logiciel statistique R est utilisé, avec le paquet ggplot2.</li>
	<li>Calculer le médicament métabolisé au rapport de drogue non métabolisé en divisant l'abondance du métabolite de drogue par celui de la molécule parente non métabolisée dans chaque cellule (c.-à-d., 4-OHT et tamoxifène, respectivement. REMARQUE : La corrélation entre les variations des pics d'intérêt spécifiques de Raman et les variations des pics de SP du médicament ou de ses métabolites peut être étudiée. Il s'agit d'un ajout à la corrélation possible entre le médicament lui-même et son métabolite dans les cellules individuelles. Cela peut être fait en calculant le coefficient de corrélation Pearson à l'aide d'un test à deux queues. Des approches intégratives plus avancées devraient également être envisagées.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Dans ce manuscrit, un cas simple a été choisi dans lequel les cellules HepG2 ont été exposées (ou non) au tamoxifène. La capacité d'un système de spectroscopie et de spectrométrie de masse de Raman est démontrée pour surveiller les effets du tamoxifène sur les cellules. La spectroscopie raman a permis d'identifier des biomarqueurs potentiels qui reflétaient une réponse générale des cellules individuelles à l'exposition aux médicaments. Une certaine hétérogénéité entre les cellules simples a été observée, suggérant que certaines cellules n'ont pas répondu à l'exposition de drogue. D'autre part, le LSC-MS était capable d'effectuer une analyse ciblée du médicament et de son métabolite au niveau unicellulaire, dans lequel un degré élevé d'hétérogénéité a été observé dans le médicament et son abondance de métabolites. Cette hétérogénéité aide à expliquer pourquoi certaines cellules sont affectées par le médicament alors que d'autres ne sont apparemment pas, malgré les cellules provenant d'une population soi-disant uniforme12.
Parmi les aspects particuliers de cette technique qui nécessitent une attention particulière, il est important d'évaluer la qualité de la configuration du microscope et le traitement du signal pour assurer la reproductibilité des données. Si le prétraitement des spectres est effectué avec soin, les variations du signal doivent être maximisées au maximum local de chaque pic. En revanche, la ligne de base et le bord des spectres devraient se chevaucher entre les conditions cellulaires testées. Un autre aspect important est le modèle multivarié utilisé pour étudier les différences entre les traitements. Il faut évaluer soigneusement les modèles et les paramètres du modèle pour assurer une analyse précise et précise. Un avantage du modèle PLS, contrairement aux réseaux neuronaux, est qu'il permet l'accès aux poids associés à chaque longueur d'onde (changements raman) qui distinguent le mieux les conditions testées par le modèle.
Malgré la spectroscopie Raman avec succès discriminant la réponse du médicament, il convient de souligner que cette technique est limitée dans son utilisation pour fournir une interprétation biologique. Cela est principalement dû à la complexité du signal spectral, qui englobe un mélange de milliers de molécules. Par conséquent, une étude plus approfondie est nécessaire pour évaluer les variations systématiques entre les intensités spectrales raman et les variations dans les concentrations de médicaments. En outre, des études similaires d'autres lignées cellulaires sont nécessaires pour évaluer la généralisation des biomarqueurs spectrals associés au tamoxifène.
En outre, il peut être intéressant d'effectuer des mesures des tissus vivants pour évaluer la pharmacodynamique et étudier comment les médicaments pénètrent et circulent dans chaque cellule. De plus, il convient de noter que l'étape d'échantillonnage de LSC-MS dépend fortement des compétences de l'exploitant. Les paramètres tels que la résolution spatiale, la position cellulaire à l'intérieur du capillaire après l'échantillonnage et la force de débit dépendent entièrement de l'opérateur, ce qui limite l'adoption à grande échelle du LSC-MS. Bien que, les systèmes d'échantillonnage automatisés peuvent atténuer ce problème. De plus, bien que le LSC-MS excelle dans l'échantillonnage des cellules adhérentes ou flottantes dans leurs États d'origine, il obtient de moins bons résultats dans les cellules d'échantillonnage intégrées dans les sections tissulaires. Cela est dû à la tendance de la pointe capillaire d'échantillonnage à se briser si la densité de l'échantillon est élevée. Par conséquent, une autre approche telle que la sonde unique peut être plus appropriée dans de tels cas14,15.
Étant donné que les cellules utilisées ici sont échantillonnées dans des conditions ambiantes avec une préparation minimale de l'échantillon, le LSC-MS peut être facilement intégré à d'autres technologies, comme le montre son intégration avec Raman dans ce protocole. Une autre intégration similaire avec l'holographie 3D a permis d'atteindre la quantitation absolue des métabolites cellulaires au niveau subcellulaire16. En outre, l'intégration avec la cytométrie de flux a permis la découverte de biomarqueurs métaboliques dans les cellules tumorales circulantes simples des patients atteints de cancer du neuroblastome17,18.
À l'avenir, en raison de l'intérêt croissant récent pour la combinaison des ensembles de données provenant des modalités d'imagerie19, il peut également être intéressant d'étudier les variations systématiques entre les signaux Raman et les résultats de spectrométrie de masse (ainsi que d'autres méthodes d'omics) en utilisant des approches de calcul intégratif. Fait intéressant, nous avons déjà trouvé plusieurs corrélations linéaires faibles mais significatives entre les intensités des pics Raman identifiés par les scores VIP et l'abondance de tamoxifène ou de son métabolite au niveau unicellulaire tel qu'identifié par MS4. Ces données peuvent suggérer une relation métabolique entre les profils de SP et les spectres Raman et la possibilité de prédire ces valeurs.

Les cellules réagissent différemment aux changements de leur microenvironnement au niveau unicellulaire, un phénomène appelé hétérogénéité cellulaire1. Malgré cela, les études actuelles de découverte de médicaments sont basées sur des mesures moyennes des populations cellulaires, qui obscurcissent l'information sur les sous-populations potentielles ainsi que les variations unicellulaires2. Ces informations manquantes peuvent expliquer pourquoi certaines cellules sont plus sensibles aux médicaments tandis que d'autres sont résistantes. Fait intéressant, le manque d'information à cellule unique sur la réponse aux médicaments est une raison possible de l'échec des essais cliniques de phase II des médicaments3. Par conséquent, pour résoudre ce problème, les interactions cellulaires avec le médicament (c.-à-d. l'utilisation, le métabolisme et la réponse) doivent être mesurées au niveau d'une seule cellule.
Pour ce faire, nous avons conçu un système unique dans lequel les cellules individuelles vivantes sont examinées à l'aide de la spectroscopie Raman sans étiquette, puis encore caractérisée à l'aide de la spectrométrie de masse4. La spectroscopie raman fournit une empreinte moléculaire de l'état cellulaire, un spectre complexe résultant de la contribution de nombreuses molécules à l'intérieur de la cellule. Malgré cette complexité, on peut considérer que les empreintes digitales de Raman reflètent la structure et le métabolisme d'une cellule entière5,6. La spectroscopie raman excelle dans la mesure des états cellulaires d'une manière non invasive et relativement élevée, ce qui le rend utile pour le dépistage et l'évaluation de la réponse des médicaments au niveau unicellulaire.
En revanche, la SP fournit la sensibilité et la sélectivité requises pour mesurer l'apport médicamenteux au niveau unicellulaire. Étant donné que la SP est destructrice (l'échantillon [cellule] est généralement consommé au cours de l'analyse), son intégration à la spectroscopie Raman non destructive et sans étiquette peut fournir un débit élevé et un système sensible. Cette plate-forme combinée est capable de fournir plus d'informations sur l'apport de médicaments, le métabolisme et les effets au niveau unicellulaire.
Ce manuscrit élucide un protocole utilisé pour étudier les interactions cellulaires avec les médicaments au niveau unicellulaire à l'aide de cultures in vitro à l'aide d'une plate-forme Raman-MS intégrée. Pour ce faire, les cellules de carcinome hépatocellulaire (HepG2) et le tamoxifène sont utilisés comme modèle. Les cellules HepG2 ont été choisies parce qu'elles prennent le tamoxifène et métabolisent le médicament, et elles sont simultanément affectées en raison de ses effets hépatotoxiques. Deux états sont utilisés dans ce manuscrit : les cellules traitées par drogue par rapport aux cellules non traitées (contrôle).

<table><tbody><tr><td>0,1 % pénicilline-streptomycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>Plat de grille à fond de verre 35mm</td><td>Matsunami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy Tamoxifen standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94873</td><td></td></tr><tr><td>532 nm Laser à semi-conducteurs pompé par diode</td><td>Ventus, Laser Quantum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIOS-L101T-S platine de microscope motorisé</td><td>OptoSigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CT-2 cellomics coated sampling capillaires</td><td>HUMANIX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d5-Tamoxifen standard</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide LC-MS grade</td><td>Nacalai Tesque</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf GELoader tips</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>Hyclone</td><td>laboratories SH3006603</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide formique LC-MS grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33015</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire HepG2 (RCB1886)</td><td>Centre de banque de cellules RIKEN</td><td>RCB1886</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur MC0-19A1C</td><td>Sanyo Electric Co.</td><td>MC0-19A1C</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol LC-MS grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1060352500</td><td></td></tr><tr><td>MMO-203 Micromanipulateur 3D</td><td>Narshige</td><td>MMO-203</td><td></td></tr><tr><td>NA :0.95, UPL40 lentille d’objectif Olympus à immersion dans l’eau</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoflex nano-ESI Adaptateur Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>ES071</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur sur scène</td><td>ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution d’étalonnage Pierce LTQ Velos ESI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88323</td><td></td></tr><tr><td>PIXIS BR400 caméra CCD refroidie</td><td>Princeton Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de revêtement de collagène Rat-tail</td><td>Cell Applications Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifène standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85256</td><td></td></tr></tbody></table>

une plate-forme intégrée de spectroscopie et de spectrométrie de masse raman pour étudier l'apport, le métabolisme et les effets des médicaments à une seule cellule

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Les cellules sont connues pour être intrinsèquement hétérogènes dans leurs réponses aux médicaments. Par conséquent, il est essentiel que l'hétérogénéité unicellulaire soit prise en compte dans les études de découverte de médicaments. Ceci peut être réalisé en mesurant avec précision la pléthore d'interactions cellulaires entre une cellule et un médicament au niveau d'une seule cellule (c.-à-d., l'utilisation de drogue, le métabolisme, et l'effet). Cet article décrit une plate-forme de spectroscopie et de spectrométrie de masse (MS) à cellule unique pour surveiller les changements métaboliques des cellules en réponse aux médicaments. À l'aide de cette plate-forme, les changements métaboliques en réponse au médicament peuvent être mesurés par spectroscopie Raman, tandis que le médicament et son métabolite peuvent être quantifiés à l'aide de la spectrométrie de masse dans la même cellule. Les résultats suggèrent qu'il est possible d'accéder à l'information sur l'utilisation des médicaments, le métabolisme et la réponse à un niveau unicellulaire.

L'analyse à cellule unique des interactions médicamenteuses (prise, métabolisme et effets) est essentielle pour découvrir toute sous-population cachée ou pharmacorésistante ainsi que pour comprendre les effets de l'hétérogénéité cellulaire. Dans ce protocole, deux techniques complémentaires ont été utilisées pour mesurer les interactions susmentionnées dans les cellules individuelles : la spectroscopie Raman et la spectrométrie De MS. Raman identifie rapidement les cellules affectées par les médicaments à partir de biomarqueurs spectrals de la réponse médicamenteuse. La SP est utilisée pour surveiller l'utilisation et le métabolisme du médicament d'une manière sélective et semi-quantitative. Les cellules ont d'abord été examinées par spectroscopie Raman, puis échantillonnées individuellement pour analyse par la SP.
Une analyse comparative du spectre moyen de chaque affection (avec et sans traitement médicamenteux) est présentée à la figure 2. Le spectre moyen des deux conditions diffère clairement à différents pics, qui ont été précédemment identifiés et assignés aux composés moléculaires2. En particulier, les pics à 1000 cm- (attribués à des composés aromatiques tels que la phénylalanine et la tyrosine) montrent de fortes différences. L'importance de la différence statistique devrait être évaluée par d'autres analyses multivariées.
L'ensemble de données a ensuite été utilisé pour former un modèle DeSP (étapes 4.5-4.8) visant à distinguer les deux traitements cellulaires (avec la drogue : n ' 290, sans médicament : n ' 115). La capacité prédictive de classer les cellules cultivées en présence de tamoxifène a atteint 100% de sensibilité et 72% de spécificité dans les données de test (inconnue du modèle formé validé transversal). La sensibilité est une mesure des vrais points positifs qui sont correctement identifiés par le modèle, tandis que la spécificité est une mesure des négatifs réels qui sont identifiés par le modèle. D'autres modèles tels que les SVM, les ALD et les réseaux neuronaux peuvent fournir des résultats similaires ou meilleurs, bien qu'aucune comparaison complète n'ait été effectuée dans cette étude.
Sur la base du modèle PLS, les scores VIP ont été calculés, ce qui représente l'importance des longueurs d'onde (changements de Raman) dans la discrimination des conditions expérimentales (figure 3). Fait important, les plus hauts sommets des profils VIP correspondaient aux pics de Raman pour lesquels de fortes différences ont été observées entre les deux traitements. Ceci a confirmé les différences moléculaires spécifiques entre les cellules traitées et non traitées. Par conséquent, les chercheurs peuvent identifier les biomarqueurs spectrals possibles qui reflètent la réponse des cellules individuelles au traitement médicamenteux. Ces biomarqueurs peuvent être testés plus avant pour vérifier leur pertinence biologique et leur généralisation à travers diverses conditions et lignées cellulaires.
Un système vivant de spectrométrie de masse unicellulaire (LSC-MS) a pu détecter le médicament et ses métabolites dans des cellules HepG2 simples et traitées par drogue qui étaient précédemment mesurées par la spectroscopie raman. En outre, le tandem MS peut être utilisé pour confirmer la structure des deux molécules. Après identification positive, l'abondance relative du médicament et de ses métabolites a été mesurée dans chaque cellule et comparée aux crêtes de fond dans les cellules non traitées. De fortes variations ont été observées dans l'abondance du tamoxifène, et ce phénomène était encore plus prononcé dans le cas de son métabolite, 4-OHT (Figure 4). La relation entre l'abondance de tamoxifène et ses métabolites a également été étudiée, dans laquelle une corrélation positive significative a été trouvée entre les deux (r - 0,54, p - 0,0001, n - 31).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg"> Figure 1 : Système de cueillette cellulaire monté sur une scène de microscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg"> Figure 2 : Spectre moyen des cellules traitées par la drogue (avec tamoxifène : n ' 295) et des cellules non traitées (sans tamoxifène : n ' 115). Les pics de Raman peuvent être identifiés à partir de la littérature. La plupart des fortes différences spectrales sont statistiquement significatives (ANOVA, p 0,5) comme décrit précédemment4. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg"> Figure 3 : Scores VIP extraits du modèle PLS prédictif. Les scores VIP reflètent les longueurs d'onde qui contribuent à faire la distinction entre les deux classes du modèle. La plupart des pics correspondent à des molécules spécifiques qui sont observées comme biomarqueurs spectrals des effets médicamenteux sur les cellules traitées par les médicaments. Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg"> Figure 4 : Répartition de l'abondance du tamoxifène et de son métabolite. Répartition de l'abondance de tamoxifène et de son métabolite, 4-OHT (mesuré au niveau unicellulaire) par rapport aux pics endogènes dans les cellules non traitées (contrôle). Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole présente une plate-forme intégrée de spectroscopie-masse de Raman (MS) qui est capable d'atteindre la résolution unicellulaire. La spectroscopie raman peut être utilisée pour étudier la réponse cellulaire aux médicaments, tandis que la SP peut être utilisée pour l'analyse ciblée et quantitative de l'utilisation et du métabolisme des médicaments.

Une plate-forme intégrée de spectroscopie et de spectrométrie de masse Raman pour étudier l'apport, le métabolisme et les effets des médicaments à une seule cellule

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Nous avons développé une méthode innovante pour la métabolomique. Nous avons combiné l’imagerie spectrale du Beffroi des cellules vivantes avec la spectrométrie de masse unicellique. Notre technique peut surveiller et prédire les changements métaboliques des cellules individuelles contre les médicaments.Et cela ouvre beaucoup d’applications pour la recherche fondamentale et l’industrie. Notre méthode ajoute une résolution à cellule unique aux techniques actuelles d’évaluation des médicaments qui faciliteront grandement les efforts futurs de découverte de médicaments. Notre technique peut également nous aider à comprendre le rôle joué par l’hétérogénéité cellulaire dans la résistance au cancer.L’échantillonnage à cellule unique et l’analyse des données sont les aspects les plus difficiles de cette expérience. Nous travaillons actuellement à l’automatisation de ces deux étapes, en particulier la partie échantillonnage. Nous vous recommandons de pratiquer l’échantillonnage à cellule unique bien avant l’expérience, car chaque configuration de micromanipulateur est légèrement différente et vous devriez prendre le temps de vous familiariser avec les contrôles.Après l’incubation de cellules pour atteindre 70% de confluence, cellules de culture d’intérêt dans un média de culture approprié, ajouter pénicilline-streptomycine pour éviter la contamination. Après avoir mesuré la densité cellulaire sur un hémocytomètre, les cellules de sous-culture dans un plat de grille inférieure en verre de 35 millimètres ou des glissières de quartz, en utilisant le même milieu à une densité d’ensemencement de 0,7 fois 10 à la sixième. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, les cellules atteignent une confluence de 50 à 60% Laver les cellules deux fois avec tampon PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Divisez les cellules en sous-groupes traités par drogue et non traités en plats de culture de 35 millimètres. Mélanger tamoxifène dissous dans du sulfoxyde de diméthyle avec le média de culture pour obtenir un volume final de deux millilitres et la concentration de Tamoxifen de 10 micromolaires.C’est le groupe traité par drogue. Mélanger un volume correspondant de DMSO dans le milieu en tant que groupe témoin pour étudier les effets du DMSO. Incuber les deux groupes en deux millilitres du média à pointes pendant 24 heures pour atteindre une confluence de 70 à 80 % Avant les mesures spectrales, vérifiez le sténopé et la correspondance de position laser à l’aide d’une cible.Pour calibrer le spectrophotomètre avant chaque expérience, placez l’éthanol dans un plat de fond en verre, mesurez le spectre à une intensité laser donnée pendant une seconde et associez le pic aux longueurs d’onde connues. Ensuite, installez la micro-chambre à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Une fois que le système de microscope est prêt, retirez les cellules de l’incubateur et rincez immédiatement les cellules deux fois avec un tampon PBS réchauffé à 37 degrés Celsius.Ajouter ensuite deux millilitres de PBS réchauffé ou de FluoroBrite DMEM. Ajouter 10 microlitres d’eau sur la lentille objective d’immersion dans l’eau. Et placez délicatement le plat de cellule de fond en verre sur l’étape de microscope.Fixez le système d’échantillonnage cellulaire sur le microscope Raman. Connectez le micromanipulateur 3D au support capillaire en verre qui est fixé à une seringue vide pour la succion de l’échantillon. Réglez le microscope à un champ de grossissement élevé de 40 fois pour observer la pointe du capillaire en verre, et assurez-vous qu’il n’est pas cassé.Contrôlez la position du capillaire en verre à l’aide du micromanipulateur. Assurez-vous que la pointe capillaire est centrée dans le champ de vision. Déplacez ensuite le capillaire vers le haut sur l’axe Z pour donner l’autorisation pour le plat de culture plus tard.Placez le plat d’échantillon sur la scène du microscope, ajustez le grossissement et concentrez-vous, sélectionnez la cellule cible sur le plat de grille, et déplacez-la au centre de la vue. Mesurez chaque cellule en concentrant la ligne laser. Un temps d’exposition de 15 secondes par cellule est suffisant pour obtenir une section transversale d’une cellule avec un signal Raman clair.Un galvano-miroir permet la numérisation d’une cellule ou d’un groupe de cellules en quelques dizaines de minutes. Ensuite, abaissez soigneusement le capillaire en verre à l’aide d’un micromanipulateur jusqu’à ce que la pointe soit mise au point. Sous observation microscopique, toucher la cellule unique cible avec la pointe capillaire.Ensuite, commencez à appliquer une pression négative à l’aide de la seringue pour piéger la cellule à l’intérieur de la pointe capillaire. Enregistrez cette procédure en prenant une vidéo pour vérifier le moment et l’emplacement aspiré de la cellule avec précision. Déplacez le capillaire vers le haut sur l’axe Z.Détachez ensuite le capillaire du support capillaire à l’aide de forceps en préparation de l’analyse de spectrométrie de masse. Après la mise en place de l’instrument de spectrométrie de masse et l’analyse des supports, ajouter deux microlitres du solvant d’ionisation au capillaire contenant la cellule. Fixez le capillaire à un adaptateur nano-électrospray relié à un spectromètre de masse approprié et démarrez la méthode d’acquisition automatique.Une analyse comparative du spectre moyen de chaque condition, avec et sans traitement médicamenteux, est montrée ici. Le spectre moyen des deux conditions diffère clairement à différents sommets. En particulier, les pics à 1000 par centimètre, ce qui est un signe pour les composés aromatiques tels que la phénylalanine et la tyrosine, montrent de fortes différences.Sur la base de la projection sur le modèle de structure latente, les scores VIP ont été calculés qui représentent l’importance des longueurs d’onde dans la discrimination des conditions expérimentales. Fait important, les pics les plus élevés des profils VIP correspondaient aux pics raman pour lesquels de fortes différences ont été observées entre les deux traitements. Ceci a confirmé les différences moléculaires spécifiques entre les cellules traitées et non traitées.Après identification positive, l’abondance relative du médicament et de ses métabolites a été mesurée dans chaque cellule et comparée aux pics de fond dans les cellules non traitées. De fortes variations ont été observées dans l’abondance du tamoxifène. Et ce phénomène a été encore plus prononcé dans le cas de son métabolite 4-hydroxy-tamoxifène.Les chercheurs peuvent être intéressés à explorer le lien entre les images spectrales et les profils métaboliques des cellules. Notre recherche a également des applications industrielles car elle permet le criblage local des cellules pour la fabrication pharmaceutique. Il faut prendre soin de préparer le solvant d’ionisation pour les mesures du spectromètre de masse.Il doit être préparé sous un capot de fumée. Aussi, veillez à ne pas toucher la source iration de l’instrument spectromètre de masse pour éviter d’être électrocuté. Enfin, les capillaires d’échantillonnage utilisés tout au long de la mesure sont très pointus, alors manipulez-les avec soin pour éviter les blessures.

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