Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate

Les cyanobactéries sont un important phylum de microbes photosynthétiques qui sont de plus en plus reconnus comme des plates-formes utiles pour la biologie synthétique et les applications biotechnologiques renouvelables. Il est donc important de mettre au point des techniques robustes pour simplifier la conception, le clonage et l’introduction de l’ADN héterologique chez différentes espèces cyanobactériennes. Ainsi, cette technique démontre une méthode bien établie appelée conjugaison ou accouplement triparental pour introduire l’ADN dans les espèces cyanobactériennes qui ne sont pas naturellement transformables.

La conjugaison a été réalisée avec succès dans un large éventail de souches cyanobactériennes, de la cellule unique aux espèces filamenteuses multicellulaires. Si vous essayez cette technique pour la première fois, s’il vous plaît prendre soin de gérer à la fois votre cyanobactérien et vos souches e.coli avec soin. Par exemple, ne pas centrifuger au-dessus des valeurs données dans le protocole et ne pas vortex.

Le mélange des bactéries et des cyanobactéries peut sembler étrange aux utilisateurs pour la première fois. Nous espérons qu’en démontrant le processus de conjugaison, nous contribuerons à clarifier cela. Après la construction des assemblages de niveau 1, choisissez un vecteur d’accepteur de niveau T approprié.

Choisissez un lien d’extrémité approprié pour ligate les trois extrémités principales de l’assemblage de niveau un final à l’épine dorsale de niveau T. Pour assembler un ou plusieurs assemblages de niveau 1 au niveau T, préparez un mélange de réaction avec PBI1 et le vecteur de liaison final requis. Mettre en place le programme de cycleur thermique et procéder selon le manuscrit.

Le premier jour, cultiver la culture cyanobactérienne en mettant en place une nouvelle culture de Synechocystis PCC 6803 ou Synechococcus elongatus UTEX 2973. À l’aide d’une boucle stérile à chaleur, racler les cellules de la plaque d’agar axenique BG-11 et les placer dans une fiole conique de 100 millilitres remplie de 50 millilitres de BG-11 frais moyen à inoculer. Placez le flacon dans un incubateur secouant avec illumination pour faire croître les cultures cellulaires Synechocystis PCC 6803 à 30 degrés Celsius à 100 RPM.

Pour Synechococcus elongatus UTEX 2973, faire croître les cultures cellulaires à 40 degrés Celsius à 100 RPM. Après un à deux jours, dessiner un millilitre de la culture cellulaire et mesurer sur un spectrophotomètre. L’absorption à OD 750 atteint 0,5 à 1,5.

Le deuxième jour, inoculer une souche d’aide MC1061 E.coli contenant des vecteurs PRK24 et PRL528 dans cinq millilitres de moyenne LB avec ampicilline à une concentration de 100 microgrammes par millilitre et chloramphéniphélique à une concentration de 25 microgrammes par millilitre. Poussez à 37 degrés Celsius pendant la nuit à 225 RPM dans un incubateur secouant. Puis inoculer cinq millilitres de milieu LB contenant des antibiotiques appropriés avec la culture E.coli portant le vecteur de cargaison de niveau T.

Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit à 225 RPM dans un incubateur secouant. Le troisième jour, centrifugeuse de l’aide et de la cargaison E.coli pendant la nuit cultures à 3000 g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.

Lavez les granulés en ajoutant cinq millilitres de lB frais moyen sans antibiotiques. Resuspendez le granulé en pipetting doucement de haut en bas et centrifugeuse pour enlever le supernatant. Répétez cette étape de lavage trois fois pour éliminer les antibiotiques résiduels de la culture nocturne.

Après le dernier lavage, resuspendez la pastille cellulaire dans la moitié du volume de LB moyen du volume de culture initial. Ensuite, combinez 450 microlitres de la souche d’aide avec 450 microlitres de la souche de cargaison dans un tube de deux millilitres et laisser à température ambiante. Ensuite, préparez la culture cyanobactérienne en centrifugant un millilitre de culture cyanobactérienne à 1 500 g pendant 10 minutes à température ambiante.

Puis jetez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille cellulaire. Lavez la pastille quatre fois en ajoutant du BG-11 frais moyen du même volume initial. Ajouter 900 microlitres de la culture cyanobactérienne lavée à 900 microlitres des souches combinées d’E.coli dans un tube de deux millilitres.

Mélangez les cultures en descendant doucement de haut en bas. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes pour Synechocystis PCC 6803 ou deux heures pour Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifuger le mélange à 1500 g pendant 10 minutes à température ambiante.

Retirez 1,6 millilitres du supernatant et resuspendez la pastille dans le supernatant restant. Placez un filtre membranaire de 0,45 micron sur une plaque d’agar LB BG-11 sans antibiotiques. Étendre soigneusement 200 microlitres du mélange de culture E.coli/cyanobactérien sur la membrane à l’aide d’un épandeur stérile ou d’une pointe plissée stérile.

Sceller la plaque avec du film de paraffine et placer la plaque dans un incubateur illuminé pendant 24 heures. Après 24 heures, transférez soigneusement la membrane à l’aide de forceps stérilisés par flamme à une plaque d’agar BG-11 fraîche contenant des antibiotiques appropriés à sélectionner pour le vecteur de cargaison. Sceller la plaque avec du film de paraffine et incuber dans les mêmes conditions qu’auparavant jusqu’à l’arrivée des colonies.

Les colonies apparaissent généralement après 7-14 jours pour Synechocystis PCC 6803 et 3-7 jours pour Synechococcus elongatus UTEX 2973. Pour sélectionner les conjugués, à l’aide d’une tige d’inoculation stérile à la chaleur, sélectionnez au moins deux colonies individuelles de la membrane et stries sur une nouvelle plaque d’agar BG-11 contenant des antibiotiques appropriés. Puis inoculer une strie de culture cyanobactérienne dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres contenant cinq millilitres de LB moyen et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit à 225 RPM dans un incubateur secouant.

La culture claire confirme l’absence de contamination par E.coli. Après une période de croissance suffisante de sept jours, choisissez des colonies axeniques individuelles pour mettre en place des cultures liquides pour le stockage cryo à long terme ou l’expérimentation ultérieure. Dans cette étude, le flux de travail d’assemblage de porte d’or a été démontré.

À la suite de la transformation de la réaction de l’assemblage, des assemblages réussis ont été identifiés à l’aide d’un criblage blanc bleu standard des colonies d’E.coli. La cassette d’expression eYFP dans le vecteur de niveau un et le lien final un vecteur ont ensuite été assemblés dans un vecteur d’accepteur de niveau T pour donner le vecteur cpcBA-eYFP. Le vecteur cpcBA-eYFP assemblé a été vérifié par digestion de restriction.

Le transfert conjugal réussi de cpcBA-eYFP ou du vecteur pPMQAK1-T a eu comme conséquence la croissance de jusqu’à plusieurs centaines de colonies sur la membrane pour Synechocystis PCC 6803 et Synechococcus elongatus UTEX 2973. Comme prévu pour le promoteur pcpc560 forte, les valeurs pour la fluorescence normalisée d’eYFP du lecteur de plaque et la fluorescence d’eYFP par cellule du cytomètre de flux étaient élevées comparées au contrôle négatif. Avec le lecteur de plaque et le cytomètre de flux, les valeurs de fluorescence étaient plus élevées dans Synechococcus elongatus UTEX 2973 que dans Synechocystis PCC 6803.

Assurez-vous d’incuber pendant le temps minimum en fonction de la souche que vous conjuguez.