Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analyse

Les nano-sondes de fluorescence synchrotron nouvellement conçues permettent la visualisation de la distribution élémentaire d’un échantillon. L’utilisation d’approches cryogéniques est obligatoire pour ralentir les dommages causés par les radiations aux rayons X. Par conséquent, une cryofixation rapide est essentielle pour obtenir des cellules hydratées congelées afin d’optimiser la préservation de la structure cellulaire et son intégrité chimique.

La spécificité des préparations cellulaires pour les études synchrotron conduit à l’optimisation de ce protocole pour l’acquisition de monocouches cellulaires hydratées congelées. La démonstration visuelle est importante pour comprendre comment manipuler les échantillons de monocouche cellulaire pour atteindre des cellules cryofixed reproductiblement intégrées dans une mince couche de glace. Pour préparer un support de membrane de nitride de silicium, ouvrez la capsule contenant le soutien de membrane et pressez doucement la capsule pour desserrer légèrement le support.

Utilisez de fines pinces à épiler pour saisir un coin du cadre en silicium en prenant soin de ne pas toucher la membrane de nitride de silicium au centre du cadre et placez le cadre dans une boîte de Petri découverte dans une armoire à écoulement laminaire. Ensuite, les UV stérilisent la membrane pendant 25 à 30 minutes. À la fin de la stérilisation, ajouter 10 microlitres de facteur d’attachement tels que la poly-L-lysine.

Incuber pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone avec humidité. Remplissez ensuite les puits d’une plaque stérile de 48 puits de 200 à 250 microlitres de 0,22 micromètre filtré d’eau ultra pure et ultra trace par puits. Utilisez des pinces fines pour plonger soigneusement la membrane verticalement avec trois rinçages successifs de 10 secondes dans un puits d’eau.

Après le rinçage, placez la membrane verticalement dans un puits vide d’une plaque stérile de 96 puits sous le capot d’écoulement laminaire et laissez-la toute la nuit jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Pour l’ensemencement des cellules d’intérêt, placez la membrane enduite avec le côté plat face vers le haut dans un puits d’une plaque stérile de quatre puits. Ajouter cinq fois 10 aux quatre cellules dans 10 microlitres d’un milieu de culture approprié à la surface de la membrane de nitride de silicium sans toucher la membrane.

La goutte doit couvrir toute la membrane. Puis la culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité. Lorsque les cellules ont commencé à s’attacher au substrat, ajoutez lentement un millilitre de milieu de culture complet sur la paroi de chaque puits couvrant chaque membrane.

Puis la culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité. Pour la cryoimmobilisation de la préparation cellulaire, allumez d’abord un congélateur à plongeon automatique et remplissez le nombre approprié de puits dans une plaque en plastique de 12 puits avec un tampon d’acétate d’ammonium de 37 degrés Celsius. Immédiatement avant de rincer et de plonger le gel de la membrane, retirez l’échantillon de l’incubateur et utilisez l’anneau de pince noire d’une paire de pinces à libération rapide pour déverrouiller les pinces.

Utilisez les pinces déverrouillées pour saisir le support de la membrane et plonger la membrane verticalement dans la solution tampon d’acétate d’ammonium pendant environ cinq secondes. Pour enlever tout excès de tampon, appuyez sur le fond de la membrane sur le papier filtre et épongez chaque côté du cadre sur le papier filtre sans permettre à la membrane de toucher le papier. Lorsque l’excédent de tampon a été enlevé, ouvrez la porte de la chambre environnementale, glissez rapidement les pinces dans le verrouillage des forceps et fermez la porte de la chambre.

Appuyez sur blot Un plongeon. Les pinces qui retiennent la membrane du nitride de silicium seront rapidement plongées dans le cryogène. Après avoir plongé le gel, retirer le couvercle du récipient de transfert avec des forceps pré-refroidis et presser le transfert.

La membrane de nitride de silicium sera déplacée légèrement au-dessus du cryogène. En un seul mouvement rapide, faites glisser et inclinez légèrement les pinces hors du verrouillage des pinces pour amener les pinces directement dans une fente vide de la cryobox dans le récipient de transfert rempli de liquide azoté. Relâchez ensuite l’anneau de pince noire pour libérer la membrane.

Pour le séchage au gel des cellules gelées, utilisez l’interrupteur rocker situé sur le panneau arrière de l’instrument de séchage au gel pour alimenter l’instrument. L’affichage affichera l’entrée de presse lorsqu’il est prêt à charger l’échantillon. Montez le support en laiton de membrane de nitride de silicium sur le dessus du support de transfert d’échantillon fourni par le fournisseur dans le récipient de stockage de polystyrène gardant le niveau d’azote liquide à environ un à deux millimètres au-dessous du bord supérieur de la première pièce en laiton.

Placez la membrane avec le côté échantillon cellulaire face vers le haut dans la cavité numérotée du support en laiton et pré-refroidir la tige de transfert dans une boîte en mousse de polystyrène remplie d’azote liquide. Utilisez la tige pour verrouiller l’assemblage complet, pressez pour briser le vide pour libérer le couvercle de la chambre de sécheuse, transférez immédiatement l’échantillon dans la chambre de sécheuse et fermez le couvercle de la chambre de sécheuse. Ensuite, appuyez immédiatement sur commencer à continuer avec le cycle de séchage de gel.

À la fin du cycle de séchage lyophilisé, appuyez sur l’arrêt pour évacuer la chambre et retirer l’assemblage complet pour accéder aux échantillons lyophilisés. Ici, une vue typique de microscope vidéo optique des cellules congelées hydratées de ligne de cancer du sein sous-cultivés sur un soutien de membrane en silicium enduit de poly-L-lysine comme démontré est montré. La cartographie élémentaire de fluorescence aux rayons X des cellules hydratées congelées révèle la distribution d’éléments physiologiques tels que le potassium, le soufre et le zinc.

Dans cet exemple représentatif, l’élément sulfuré étroitement lié a été réparti uniformément dans la cellule dans un modèle semblable à celui observé pour le potassium et représente une bonne estimation du profil cellulaire de masse. La distribution de zinc, cependant, a montré le signal plus élevé dans le noyau que dans le cytosol avec une séparation clairement définie du signal entre le cytosol et le noyau. Dans cette vue typique de microscopie de Brightfield des neurones hippocampal primaires lyophilisés de souris directement cultivés sur une membrane de nitride de silicium comme démontré, les cellules montrent une morphologie neurale typique qui n’est pas affectée par leur culture ou méthode de conservation.

L’imagerie par fluorescence aux rayons X des cellules gelées de plongeon révèle également des distributions élémentaires typiques telles qu’elles sont exposées par ces cellules lyophilisée représentatives à une résolution spatiale de 50 à 100 nanomètres. Tracer la fenêtre de nitride de silicium est essentiel pour obtenir la couche de glace la plus mince possible des cellules après le gel de plongeon. La préservation de l’intégrité chimique des cellules au niveau subcellulaire permet d’explorer le métallome des cellules à l’aide de nano-sondes synchrotron ainsi qu’avec d’autres techniques microanalytiques.

Comme toutes les analyses nano-sondes synchrotron ne peuvent pas être effectuées à température cryogénique, les cellules hydratées congelées peuvent être lyophilisés davantage pour faciliter leur analyse à température ambiante. N’oubliez pas d’utiliser l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide et d’utiliser toujours du gaz éthane dans un capot de fumée loin des flammes.