Utilisation d’embryons de poisson zèbre Tg(Vtg1:mcherry) pour tester les effets œstrogéniques des composés perturbateurs endocriniens

Il y a un grand nombre de produits chimiques EDC dans notre environnement, principalement des substances œstrogènes. La diversité chimique des substances appartenant au groupe rend leurs tests difficiles, car différentes méthodes sont nécessaires pour leur détection. Basé sur la structure chimique, il est vraiment difficile de déterminer si une substance est réellement capable de travailler comme un oestrogène.

En outre, ces substances ne sont jamais présentes sous une forme pure dans l’environnement, de sorte que leurs effets peuvent être influencés par d’autres composés, aussi. Ce problème est résolu par des méthodes de dialecte d’effet telles que l’utilisation du biomonitor, organismes bioindicateurs qui montrent l’effet d’oestrogène. On sait que certains gènes réagissent sensiblement à l’œstrogène dans les organismes vivants.

La détection des produits génétiques par des méthodes moléculaires est également possible au niveau des protéines ou de l’ARNm, mais implique généralement des sacrifices d’animaux. Les lois sur la protection des animaux sont de plus en plus strictes et la demande de systèmes d’essai alternatifs est de plus en plus forte. Les technologies transgénétiques représentent la possibilité avec ce développement et avec la découverte de protéines fluorescentes, la voie à la création de biomarqueurs ont été pavées.

À l’aide d’une telle activation des gènes sensibles aux œstrogènes peuvent être testés in vivo. Dans cette vidéo, une méthode possible pour l’utilisation des embryons transg:1mCherry transgene zebrafish est montrée pour l’essai des substances oestrogènes à l’aide de deux composés. Le protocole peut servir de base pour étudier l’effet d’oestrogène de différents échantillons chimiques ou environnementaux sur les embryons de biomarqueurs.

La ligne de poisson zèbre utilisée dans nos expériences est une ligne de poisson zèbre transgénique journaliste vitellogenin. La ligne a été créée à l’aide du système Tol2 Transposon. La construction transgénique utilisée pour le développement a porté la longue séquence naturelle de promoteur de vitellogenin-1, avec un nombre élevé de côtés d’IRA.

L’expression du signal fluorescent chez la femelle sexuellement mature est continue. Cependant, chez les mâles dans les embryons, il n’apparaît que par l’action ou la présence de substances oestrogènes, de sorte que ces derniers sont plus appropriés pour le dépistage. La sensibilité et la facilité d’utilisation des embryons de la lignée ont été testées sur plusieurs composés œstrogènes ainsi que sur des échantillons environnementaux.

Toutes les expériences sur des animaux vivants ont été réalisées conformément à la loi hongroise sur le bien-être animal et toutes les études ont été achevées avant que les animaux n’atteignent le stade de l’alimentation gratuite. Remplissez les réservoirs d’accouplement avec de l’eau système et installez le poisson pour accoupler les œufs avant de les récolter. Placez les poissons mâles et femelles dans le réservoir et séparez-les à l’aide d’un séparateur.

Retirez le séparateur des réservoirs lorsque la lumière s’allume le lendemain matin. Vérifiez les réservoirs d’accouplement pour les œufs toutes les 15 à 20 minutes. Récoltez tous les embryons à l’aide d’une passoire à thé, ou d’un maillage fin densément tissé, et combinez-les dans une grande boîte de Pétri avec tampon E3, ou eau claire du système.

Placez les embryons dans les incubateurs fixés à 25,5 degrés Celsius. Une à une heure et demie après, retirer et jeter les œufs non fertilisés ou insuffisamment divisés avec une pipette de transfert en plastique sous un microscope disséquant. Placer les embryons sélectionnés dans les récipients de traitement, par exemple dans des boîtes de Pétri ou des plaques de culture tissulaire, qui ont déjà été étiquetées et remplies de différentes concentrations de la substance d’essai.

Incuber les embryons à 25,5 degrés Celsius jusqu’à la fin de l’expérience. Actualisez la solution de test si nécessaire afin de maintenir la concentration du traitement. Soyez prudent lorsque vous modifiez la solution de test, afin d’éviter d’endommager les embryons.

Préparez quatre pour cent de méthhoseladose avec ms 222 à l’avance. Placez les larves de cinq jours dans une boîte de Pétri de cinq centimètres par groupe de traitement avec une pipette en plastique. Retirez la solution de traitement des larves avec une pipette en plastique, puis remplissez la boîte de Pétri avec deux millilitres de solution anesthésique de 0,02 pour cent ms 222.

Remplissez chaque carré d’une boîte de Pétri spécialement conçue de 10 centimètres avec 4 % de methoseladose ms 222. Transférer les larves anesthésiées à la méthhoseladose avec un peu d’eau dans l’un des deux carrés. Du premier carré, transférer les larves dans le deuxième carré.

Dans le deuxième carré, faire pivoter et orienter les larves sur le côté gauche et les presser doucement vers le bas de la pointe de pipette microchargeur coupé jusqu’à deux centimètres. Afin d’évaluer le signal du journaliste exprimé, imagez les embryons dans la même vue et les mêmes paramètres. Placez la boîte de Pétri sur la scène du microscope.

Concentrez-vous sur le foie de l’embryon et capturez une image de champ lumineux à l’aide du logiciel associé. Passez le microscope au filtre mCherry, et prenez une image florescente du foie sous lumière fluorescente à l’aide du logiciel associé. Répétez les deux étapes précédentes jusqu’à ce que vous avez capturé tous les embryons de l’expérience.

Ouvrez ImageJ, puis téléchargez l’image fluorescente à analyser en faisant glisser et en laissant tomber l’image, ou en cliquant sur File Open. Cliquez sur Image, Couleur, Split Channels pour diviser l’image faite par le filtre florescent selon le graphique de couleur RVB. Travaillez avec le spectre d’image du canal rouge.

Fermez les autres canaux. Désignez une zone elliptique de taille similaire dans l’image, de sorte que les signaux complets n’interfèrent pas avec l’évaluation. À l’aide des outils ovales dessiner une ellipse sur la zone hépatique surlignée aussi précisément que possible.

Si le signal est faible, utilisez des images microspic légères, la paire de champ lumineux de l’image fluorescente, pour déterminer l’emplacement du foie. Cliquez sur Analyser, Mesurer, pour déterminer la force du signal et la taille de la zone touchée. La valeur de densité intégrée est automatiquement calculée par la colonne logicielle du graphique.

Poursuivez l’analyse en répétant les étapes précédentes jusqu’à ce que vous analysiez toutes les images de fluorescence de tous les embryons du groupe de traitement. Enregistrez les données, puis analysez les valeurs de densité intégrées. Dans l’expérience, les embryons sensibles aux œstrogènes de la lignée du poisson zèbre biomarqueur ont été traités avec 0,5 et huit concentrations de micromole d’alpha-et bêta-Zearalenol, ou ZOL, pour la fécondation jusqu’à l’âge de cinq jours.

Nous avons étudié si des signaux florescents apparaissent dans le foie du poisson à la fin de l’expérience en raison de substances, et s’il existe des différences dans l’œstrogène des deux substances. Les résultats ont été évalués sur la base d’images fluorescentes et de valeurs de densité intégrées. Dans le cas de l’alpha-ZOL, à la plus forte concentration d’essai, tous les individus sont morts.

Ainsi, dans ce cas, le signal fluorescent n’a pas pu être examiné. À des concentrations plus faibles, un signal fluorescent fort peut être observé dans le foie de l’embryon. Sans différence significative dans la force du signal fluorescent et la taille des zones éclairées.

Il n’y avait pas non plus de différence significative entre les valeurs de densité intégrées et les traitements. Il n’y avait aucune mortalité pendant le traitement avec le bêta-ZOL. La substance induite activité transgénique dans toutes les concentrations de traitement.

L’augmentation de l’intensité du signal fluorescent et la taille de la zone illuminée peuvent être observées dans les images de fluorescence à mesure que la concentration augmente. En examinant les valeurs intégrées du bêta-ZOL, ce changement peut également être découvert. La valeur moyenne de densité intégrée double presque entre les concentrations de traitement les plus faibles et les plus élevées.

Cependant, dans le cas du bêta-ZOL, nous n’avons pas trouvé de différence significative entre les valeurs de densité intégrées des concentrations individuelles. En examinant les valeurs de densité intégrée obtenues à partir des mêmes concentrations de traitement des deux substances, on peut dire que l’alpha-ZOL a donné des moyennes de densité intégrée plus élevées dans chaque cas par rapport au bêta-ZOL, ce qui est compatible avec les différences entre la force du signal observée dans les images fluorescentes. Cette différence avec significative à toutes les concentrations.

L’utilisation de bioindicateurs pour les effets des œstrogènes s’est répandue dans des études toxicologiques. Plusieurs lignées transgéniques montrant des effets d’oestrogène ont également été produites à partir de poisson zèbre, dont vtg:1mCherry a été utilisé dans nos études. La méthode décrite ici illustre un protocole possible pour l’essai des embryons de cette ligne, afin de permettre la détection in vivo de l’activité d’oestrogène en cas d’agents purs.

Il est important de mentionner que dans le cas des embryons, l’expression du transgène, de la même manière que la production de vitellogénine endogène, montre une grande dispersion, et les différences de sensibilité individuelle doivent être prises en compte lors de la conception d’expériences. Un aspect important dans la détermination des concentrations de traitement est que les cellules des embryons, y compris les cellules hépatiques, peuvent être endommagées par des concentrations plus élevées de substances hautement toxiques, ce qui peut conduire à une baisse de l’induction de vitellogénine. Par conséquent, les tests doivent être effectués à des concentrations inférieures à L-C 10.

Ce protocole peut être modifié en plusieurs points en fonction des critères d’évaluation prévus, et des échantillons qui vont être testés. Il peut être complété avec d’autres méthodes d’essai, par exemple des méthodes moléculaires. Ainsi, nous espérons que l’utilisation de la ligne vtg:1mCherry apparaîtra comme un modèle de tests d’œstrogènes et peut également être un modèle pour les méthodes d’essai normalisées.