Mesure de la dynamique des microtubules par la microscopie du disque filature dans des spindles mitotiques monopolaires

Ce que nous présentons ici est une méthode robuste et simple pour analyser la dynamique des microtubules à l’aide de l’imagerie confocale du disque de filature à cellules vivantes dans des cellules synchronisées dans la prométaphe, et les images sont ensuite analysées sur une plate-forme basée sur MATLAB. L’utilisation de protéines fluorescentes à décale rouge en combinaison avec la microscopie à disque filature réduit la phototoxicité. Par conséquent, un plus grand nombre de cellules peuvent être photographiées dans la même préparation.

La dynamique des microtubules est altérée dans un grand nombre de conditions pathologiques. Par conséquent, la compréhension de la régulation et le comportement de la dynamique des microtubules dans ces processus peut nous aider à comprendre le mécanisme de la maladie, et éventuellement, le développement de thérapies pour compenser pour eux. Et la méthode est également haut de gamme, de sorte qu’il pourrait potentiellement être appliqué dans un effort de découverte de médicaments.

La méthode peut être modifiée en modifiant le protocole de désynchronisation de la fluorescence et en obtenant des cellules de différentes phases du cycle cellulaire. Ceci peut être utile lors du criblage des médicaments contre les microtubules et de l’identification des défauts sur les cellules de division et de non-division. Il est nécessaire d’optimiser le protocole de transfection et la densité d’ensemencement pour chaque type de cellule.

Le niveau d’expression de l’EB3 devrait être faible, afin de détecter les microtubules à croissance unique. Commencez par rincer les cellules HeLa à croissance asynchrone dans DPBS, puis incubez-les avec de la trypsine-EDTA pendant cinq minutes, à 37 degrés Celsius. Arrêtez la trypsinisation en ajoutant RPMI-1640 moyen complété par 10% de chaleur inactivée FCS à un rapport de trois contre un, la trypsine ajoutée-EDTA.

Calculez la concentration des cellules selon les instructions manuscrites, et ensemencez 50 000 cellules dans chaque puits d’un coverslip préparé et chambé. Retournez le coverslip à l’incubateur, et cultivez des cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, retirez les cellules de l’incubateur et ajoutez 100 microlitres de mélange de transfection dans chaque puits.

Retourner les cellules à l’incubateur, et après quatre heures d’incubation compléter les cellules avec un milieu frais et en plus incuber pendant 20 heures. Préparer une solution micromolaire de 2,5 micromolairestron, ou DME, en phénol rouge libre DMEM, complétée par 10%FCS et deux millimolaire L-glutamine. Remplacez le milieu de croissance dans le coverslip chambé par le milieu de croissance DME, et retournez les cellules à l’incubateur.

Après 3,5 heures d’incubation, transférez les cellules au microscope en montant le couvercle chambé dans une chambre environnementale réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, avec des panneaux foncés pour l’imagerie. Ensuite, continuez l’incubation pendant un total de quatre heures. Effectuez l’imagerie en accéléré sur un microscope inversé avec une ouverture numérique 100X, 1,49, un objectif d’immersion d’huile, un système confocal à double disque et un système de mise au point automatique fiable.

Définissez les paramètres d’imagerie tels que décrits dans le manuscrit du texte. Trouvez une cellule en prophase et concentrez-vous dans le plan Z correspondant au centre du fuseau mitotique monopolisaire. Puis acquérir des images toutes les 5 secondes, sur un total d’une minute, sans binning et sans éclairage entre les expositions.

Commencez par charger le logiciel d’analyse numérique et en ajoutant le dossier V2.2.0 u-track dans le chemin de recherche logiciel, appelé gui sélecteur de film, à partir de la fenêtre de commande. Ensuite, importez les fichiers bruts générés par le logiciel d’acquisition d’images. Entrez manuellement l’ouverture numérique de l’objectif et l’intervalle de temps utilisé pour l’imagerie.

Une fois que toutes les images sont chargées, enregistrez la série time lapse saisie en tant que film en sélectionnant enregistrer comme liste de films, et l’option u-track sur le côté droit de la fenêtre de dialogue. Sélectionnez microtubule plus-extrémités du menu pop-up, et cliquez bien, ce qui ouvre une nouvelle fenêtre de dialogue pour déterminer les paramètres des trois étapes de l’analyse. Pour la première étape, cliquez sur paramètres et sélectionnez la détection des comètes à partir du menu drop down.

Définissez les paramètres de la différence du filtre gaussien et de la segmentation du bassin versant, tel que décrit dans le manuscrit. Ensuite, sélectionnez appliquer les paramètres à tous les films et cliquez sur appliquer. Pour la deuxième étape, sélectionnez la dynamique microtubule plus-end, et utilisez les options de réglage pour définir les valeurs pour relier, combler les écarts, fusionner et fractionner, et kalman fonctions de filtre, selon le manuscrit du texte.

Pour les problèmes de dimensionnalité, choisissez-en deux dans le menu drop down et utilisez cinq images pour combler l’écart maximal, et trois images pour une longueur minimale de segments de piste dès la première étape. Comme auparavant, sélectionnez appliquer les paramètres à tous les films et cliquez sur appliquer. Pour la troisième étape, choisissez la classification de la dynamique des microtubules comme méthode d’analyse de la voie et définissez les paramètres à l’aide du bouton de réglage.

Sélectionnez les cases pour supprimer les pistes au début et à la fin du film, et faites des histogrammes statistiques. De la liste de drop down, sélectionnez en utilisant deux à trois images avant l’écart vers l’avant, et 95e percentile de la répartition de la vitesse d’écart vers l’avant, pour le reclassement vers l’avant et vers l’arrière, respectivement. Une fois que tous les paramètres sont définis, sélectionnez appliquer check/uncheck à tous les films, et exécuter toutes les boîtes de films à partir de la fenêtre de contrôle panes u-track, puis appuyez sur exécuter.

Un message est affiché une fois le traitement de film terminé. Le plasmide pEB3-tdTomato a été transitoirement exprimé dans les cellules hela. Les cellules ont été synchronisées avec le traitement de DME.

Des films de time lapse de croissance de microtubule ont été analysés, et la vitesse de croissance et la dynamique résultantes ont été tracées. Les paramètres décrits pour affecter l’analyse, tels que la longueur maximale de l’écart et le facteur de rétrécissement maximal, ont été modifiés pour le même ensemble de films de laps de temps. Les valeurs correspondantes de vitesse de croissance et de dynamique ont été calculées.

Bien que la vitesse de croissance qui en résulte n’ait pas été affectée de façon significative, la dynamique était différente lorsque la longueur maximale de l’écart a été modifiée. Dans les trois cas, la détection des sous-voies de microtubule était semblable, pourtant la reconstruction des trajectoires pleines de MT a été la plupart du temps affectée quand la longueur maximale d’écart a été réglée à 15. Afin d’évaluer si les conditions de formation image ont interféré avec le comportement de microtubule, les première et deuxième moitiés de la série de laps de temps ont été analysées séparément, et la vitesse de croissance correspondante et la dynamique ont été comparées.

Comme prévu, aucune différence significative n’a été détectée. Il est important de garder à l’esprit, que parce que les cellules sont synchronisées dans la prométaphe, la densité du microtubule est très élevée. Par conséquent, il faut définir les paramètres de l’analyse très soigneusement, de ne pas mal identifier différents microtubules.

La mesure de la dynamique des microtubules avec cette méthode peut être comparée à des études d’autres cibles biologiques régulant directement, indirectement, les microtubules.