Name: Capturer la réponse aux blessures cardiaques des populations cellulaires ciblées par l’imagerie tridimensionnelle du cœur effacé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez l'imagerie 3D du cœur effacé pour étudier la réparation cardiaque et les populations cellulaires impliquées. Cette méthode permet de visualiser la dynamique cellulaire lors de la régénération cardiaque.

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Le financement de ce projet a été fourni par l’UW School of Medicine and Public Health du Wisconsin Partnership Program (A.I.M.) et un American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide pour l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire et conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’École de médecine et de santé publique de l’Université du Wisconsin-Madison. Toutes les méthodes ont été effectuées sur le type sauvage C57BL/6J (B6) et les lignées de souris transgéniques obtenues auprès des laboratoires Jackson.
1. Occlusion coronaire (Infarctus du myocarde) induite par la Ligation de l’artère descendante antérieure gauche (LAD) chez les souris néonatales de 1-Day-Old6
<ol><li>Séparez les chiots néonatals d’un jour de la mère en les plaçant dans une cage propre avec une partie du matériel de nidification d’origine.</li>
	<li>Placer la moitié de la cage sur un coussin chauffant à feu moyen. Les chiots doivent rester sur le côté non chauffé de la cage, seulement être placés sur le côté chauffé après la chirurgie.</li>
	<li>Créez une zone chirurgicale stérile sous un microscope opératoire. Recueillir de l’équipement chirurgical stérilisé(tableau 1).</li>
	<li>Anesthésiez le chiot par hypothermie : enveloppez le chiot dans de la gaze pour éviter un contact direct avec la glace et enterrez-le dans un lit de glace pendant environ 3 à 4 min. Vérifiez périodiquement l’hypothermie des souris en effectuant une pincée d’orteil. Les nouveau-nés tolèrent bien l’hypothermie, cependant, l’exposition prolongée à l’hypothermie peut avoir comme conséquence des engelures et la mortalité suivante.</li>
	<li>Une fois anesthésié, placez la souris sur la zone chirurgicale en position de supine, en fixant les bras et les jambes avec du ruban adhésif. Stériliser la zone chirurgicale de la souris avec une solution antiseptique.</li>
	<li>Localiser la région inférieure de la poitrine et faire une incision transversale dans la peau avec de petits ciseaux disséquants. Pour élargir la vue chirurgicale des côtes, séparer la peau du muscle en soulevant doucement la peau avec une paire de forceps de pansement et appuyez doucement contre les muscles intercostal avec les petits ciseaux en position fermée.</li>
	<li>Localisez le quatrième espace intercostal(figure 1A) et faites une petite ponction superficielle à l’aide de forceps pointus, en prenant soin de ne pas perforer les organes internes. Effectuez une dissection émoussée en élargissant la zone entre les muscles intercostal avec des forceps de pansement. Un bon positionnement anatomique de l’incision est essentiel pour un accès approprié au cœur.</li>
	<li>Guidez doucement le cœur hors de la cavité thoracique en plaçant un doigt et en appliquant une pression croissante sur le côté gauche de l’abdomen tout en maintenant l’espace intercostal ouvert avec des forceps d’habillage(figure 1B). Une fois que le cœur est à l’extérieur de la poitrine, retirez les forceps de pansement, soulagez la pression et laissez le cœur reposer sur les muscles intercostalaux.</li>
	<li>Localiser le LAD comme la zone du cœur qui a moins de sang commun et est dans la position anatomique correcte (figure 1C). Le LAD ne peut être vu sous le microscope que si le cœur est accessible dans les quelques minutes suivant le début de la chirurgie.</li>
	<li>Effectuez la ligature LAD en suturant le LAD avec une suture 6-0(figure 1D). Attachez un noeud carré deux fois pour induire l’infarctus du myocarde (figure 1E). La profondeur de la suture dans le myocarde peut varier, cependant, le positionnement anatomique approprié de la ligature LAD est crucial pour la reproductibilité. Lors de la ligature de la LAD, la suture doit être tirée étroitement, mais soigneusement afin de ne pas couper le LAD. Blanchir au sommet du cœur sera vu immédiatement (Figure 1E)</li>
	<li>Laisser le cœur se repepre à la cavité thoracique; ce processus peut être doucement facilité avec des forceps de pansement. Suture les côtes avec le noeud d’un chirurgien suivi d’un noeud carré, en utilisant des forceps émoussés pour soulever l’ensemble supérieur des côtes tout en passant une suture 6-0 à travers l’ensemble supérieur et inférieur des côtes.</li>
	<li>Retirez la bande qui a été utilisée pour fixer les pattes postérieures du chiot.</li>
	<li>Adhérez la peau ensemble en plaçant une petite quantité de colle de peau sur le haut de l’abdomen. Ensuite, saisissez la peau du bas-ventre avec de fines forceps et couvrez la région thoracique exposée. Limitez la quantité d’excès de colle qui reste sur les chiots, car cela peut augmenter la probabilité de rejet et de cannibalisme par la mère.</li>
	<li>Faciliter immédiatement la récupération de l’anesthésie en plaçant le chiot sur un coussin chauffant réglé à feu moyen. Passez périodiquement le placement des nouveau-nés pour réchauffer uniformément toutes les parties du corps.</li>
	<li>Laisser le nouveau-né rester directement sur la plaque chauffante pendant 10 à 15 min. En règle générale, le mouvement est rétabli dans les 5 minutes suivant sa mise à feu.</li>
	<li>Nettoyez le sang résiduel et la colle avec une lingette d’alcool.</li>
	<li>Couvrez les parfums étrangers sur les nouveau-nés en frottant tout le corps avec la literie de la cage d’origine. Placez le chiot dans la cage sur le côté chauffé pendant que d’autres chirurgies sont effectuées.</li>
	<li>Une fois toutes les chirurgies terminées et les chiots chauds et mobiles, transférez la litière avec le matériel de nidification d’origine dans la cage de la mère.</li>
	<li>Surveillez les souris pendant 30-60 min après la chirurgie et surveillez l’acceptation des chiots par la mère en niche et/ou en toilettage.</li>
	<li>Vérifiez les souris le matin suivant la chirurgie. Si la mère est en détresse et n’a pas imbriqué les chiots, considérez une mère adoptive pour les chiots.</li>
</ol>2. Effacer le cœur de la souris avec LA CLARTÉ passive21,22,23
<ol><li>Anesthésiez la souris avec l’isoflurane. Effectuez une pincée d’ateil pour s’assurer que la souris est entièrement sous sédatif.</li>
	<li>Placez la souris sur une zone propre et chirurgicale en position de supine, en fixant les bras et les jambes avec du ruban adhésif.</li>
	<li>Maintenir la sédation de l’isoflurane sur la souris à l’aide d’un cône nasal jusqu’à ce que le cœur soit extrait.</li>
	<li>Ouvrez la poitrine inférieure en tenant la fourrure juste en dessous du processus xiphoid avec des forceps de tissu et faire une incision couvrant la largeur de la cage thoracique utilisant les grands ciseaux disséquants.</li>
	<li>Couper à côté des parties distales de la cage thoracique avec des ciseaux chirurgicaux.</li>
	<li>Exposez le muscle du diaphragme en saisissant le processus xiphoïde avec des forceps de tissu. Détachez le diaphragme à l’aide de forceps incurvés.</li>
	<li>Tout en maintenant une compréhension du processus xiphoïde, tirez le tissu cranially jusqu’à ce que le cœur battant est accessible.</li>
	<li>Saisissez le cœur à la base avec des forceps incurvés et disséquez le cœur de la cavité thoracique en coupant l’aorte et le cava supérieur avec des ciseaux d’iridectomy.</li>
	<li>Alors que le cœur bat encore, placez le cœur dans un plat Petri rempli de PBS de sorte que le cœur pompe le sang à l’intérieur comme il ne cesse de battre. L’infarctus du myocarde peut être confirmé en vérifiant que le placement de la suture est dans la position anatomique appropriée pour la ligature DE LAD.</li>
	<li>Serrez doucement le cœur avec des forceps pour permettre au cœur d’expulser le sang résiduel.</li>
	<li>Transférer le cœur de la souris dans une fiole en verre jetable de 2,5 ml avec 2 ml de PBS. Laver le sang résiduel en incuber le cœur sur un shaker pendant 10 minutes à température ambiante (RT) à plusieurs reprises. Modifier la solution PBS à chaque fois jusqu’à ce que PBS reste clair.</li>
	<li>Jetez le PBS et remplissez la fiole de 2 ml de paraformaldéhyde froid de 4 % (PFA). Incuber pendant 4 heures à RT (figure 2A).</li>
	<li>Après l’incubation, jetez la PFA et la fiole avec 2 ml de PBS. Laver le cœur sur un shaker pendant 10 min à RT. Répétez l’étape de lavage deux fois, vidange et remplissage de la fiole avec nouveau PBS à chaque fois pour laver complètement l’excès de PFA.</li>
	<li>Jetez PBS et remplissez la fiole avec 2 ml d’acrylamide de 4 % et 0,5 % de solution VA-044. Incuber pendant la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Le lendemain, effectuer la polymérisation en transférant la fiole à un bloc de chaleur fixé à 37 oC pendant 3 heures.</li>
	<li>Transférer le cœur dans une nouvelle fiole de coquille de verre et répéter l’étape 2.12 (cycle de lavage PBS).</li>
	<li>Jetez PBS et remplissez la fiole de 2 ml de solution de compensation(tableau 2). Incuber à 37 oC jusqu’à ce que le cœur soit dégagé. Changez la solution et remplissez-le avec une solution de compensation fraîche tous les 2 à 3 jours. Le processus de compensation pourrait prendre jusqu’à plusieurs semaines(figure 2B-C). REMARQUE : Les cœurs P1 prennent généralement environ 3 à 5 jours, tandis que les cœurs P21 peuvent prendre près d’un mois avant que l’incubation de la solution de compensation soit terminée.</li>
	<li>Jetez PBS et remplissez la fiole de 2 ml de PBS et répétez l’étape 2.12 (cycle de lavage PBS). Remplissez le flacon avec PBS frais et incuber toute la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Si l’immunostaining sera effectué, sautez les étapes 2.21-2.22 et passez à la section 3 pour l’immunostaining. Si vous vous fiez uniquement à la fluorescence endogène, passez les étapes 2.21-2.22 et sautez la section 3.</li>
	<li>Jetez PBS et modifiez la solution en solution de correspondance des indices réfractifs (RIMS) (tableau 3). Incuber pendant la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Après l’incubation, le tissu défriché peut être stocké dans la solution RIMS à RT. Tissu peut sembler blanc et opaque dans le centre lors de la première modification dans RIMS; les tissus doivent devenir transparents après avoir été incubés dans les RIMS à température ambiante pendant plusieurs semaines(figure 2D).</li>
</ol>3. Optionnel : Immunohistochimie Staining of the Whole-Mount Mouse Heart
<ol><li>Retirez le cœur dégagé de la solution RIMS et placez-le dans un flacon de verre propre de 2,5 ml avec 2 ml de PBST (PBS avec 0,1 % De Triton-X 100)</li>
	<li>Laver le cœur dans PBST 3 fois sur un rotateur orbital avec des incubations de 30 min à RT.</li>
	<li>Bloquer la fixation d’anticorps non spécifique en plongeant le cœur dans 2 ml de tampon de blocage de 20 % (dilué dans PBST) et incuber avec rotation pendant 3 heures à RT. Transférer à 4 oC pour tacher avec rotation pendant la nuit. REMARQUE : Le tampon de blocage est fabriqué à partir du sérum normal correspondant à l’espèce dans laquelle l’anticorps secondaire a été soulevé.</li>
	<li>Laver le cœur dans PBST 3 fois avec rotation pour 5 min incubations à RT.</li>
	<li>Plongez le cœur dans l’anticorps primaire (dilué dans un tampon de blocage de 2 % avec PBST) et évitez l’exposition à la lumière en enveloppant la fiole de verre dans du papier d’aluminium. Incuber avec rotation pendant la nuit à RT. REMARQUE : À partir de ce point, le papier d’aluminium doit être utilisé en permanence pour protéger le secondaire contre l’exposition à la lumière ambiante.</li>
	<li>Incuber pendant 24 heures supplémentaires avec rotation à 4 oC.</li>
	<li>Après la coloration primaire, répétez l’étape 3.2 (long cycle de lavage PBST) pour enlever l’anticorps primaire non lié du tissu. Étendre le lavage avec une incubation de nuit avec rotation à RT.</li>
	<li>Travailler dans une zone avec un éclairage limité pour prévenir l’exposition secondaire à la lumière des anticorps, immerger le cœur dans des anticorps secondaires (dilué dans un tampon de blocage de 2 % avec PBST) et incuber avec rotation pendant 3 heures à RT. Transférer à 4 oC pour tacher avec rotation pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, répétez l’étape 3.2 (long cycle de lavage PBST) pour enlever les anticorps secondaires non liés.</li>
	<li>Remplacez la solution par un tampon de blocage de 2 % (dilué dans PBST). Enlever les anticorps résiduels non liés en lavant toute la nuit avec rotation à RT.</li>
	<li>Le lendemain, vérifiez que l’excédent d’anticorps secondaire a été enlevé à l’aide de microscopie confocienne. Étendre le lavage au besoin, en remplaçant quotidiennement la solution tampon de blocage de 2 %. Procéder une fois peu ou pas de secondaire non spécifique est présent.</li>
	<li>Rangez le cœur immunostendié dans PBS à 4 oC.</li>
	<li>Directement avant la microscopie à monture entière, incuber le cœur dans la solution RIMS pendant la nuit à 37 oC. Prolonger l’incubation de 24 heures supplémentaires si le tissu n’est toujours pas entièrement effacé.</li>
	<li>Conservez le cœur entièrement dégagé et immunostendié dans RIMS à RT.</li>
</ol>4. Visualiser les populations non myocytes en 3D avec l’imagerie à microscopie confoque mono-photon du cœur de souris effacée
REMARQUE : Si les cœurs de souris sont récoltés embryonnairement, continuez avec la section 4.1. Pour les cœurs de souris récoltés par voie postnatale, continuer avec la section 4.2.
<ol><li>Imagerie du cœur de souris embryonnaire effacé<ol>
<li>Remplissez la glissière de dépression de microscope avec la solution PBS.</li>
		<li>Ramassez soigneusement le cœur dégagé avec des forceps incurvés et placez le tissu sur la glissière.</li>
		<li>Monter la glissière avec un coverlip en verre. Le tissu peut maintenant être photographié sous un microscope confocal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagerie du cœur postnatal de souris effacé<ol>
<li>Remplissez la moitié de la chambre de la diapositive de dépression avec la solution PBS. Afin de créer une chambre assez grande pour s’adapter à un cœur de souris adulte, une diapositive de dépression en polypropylène imprimée en 3D a été faite sur mesure(figure 4).</li>
		<li>Ramassez soigneusement le cœur dégagé avec des forceps incurvés et placez le tissu dans la chambre. Remplissez le volume restant de la chambre avec PBS.</li>
		<li>Remplissez la chambre de PBS de sorte que la surface du liquide forme un dôme au-dessus du haut de la chambre. Monter la glissière de couverture. Le tissu peut maintenant être photographié sous un microscope confocal droit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les interactions cellulaires entre les cardiomyocytes et les populations non myocytes sont un facteur déterminant de la question de savoir si le cœur subira la fibrose ou la réparation après une blessure. Des découvertes ont été faites démontrant qu’une variété de types de cellules, y compris les nerfs14, les cellules épicardiales24, macrophages péritonéaux25, artérioles12,13, et les cellules...

Le cœur a longtemps été considéré comme un organe post-mitotic, mais des preuves récentes démontrent que le renouvellement cardiomyocyte se produit dans le cœur humain adulte à environ 1% par an1. Cependant, ces faibles taux de rotation de cardiomyocyte sont insuffisants pour reconstituer la perte massive de tissu qui se produit après des dommages. Un cœur qui a subi une infarctus du myocarde perdra environ un milliard de cardiomyocytes, servant souvent de prélude à l’insuffisance cardiaque et la mort cardiaque soudaine2,3. Avec plus de 26 millions de personnes touchées par l’insuffisance cardiaque dans le monde, il ya un besoin non satisfait de thérapies qui peuvent inverser les dommages infligés par la maladie cardiaque4.
Afin de combler cette lacune dans la thérapeutique, les scientifiques ont commencé à étudier les mécanismes évolutivement conservés qui sous-tendent la régénération endogène après des dommages. Un modèle pour étudier la régénération cardiaque des mammifères est la souris néonatale. Dans la semaine qui suit la naissance, les souris néonatales ont une réponse régénératrice robuste suite à des dommages cardiaques5. Nous avons déjà démontré que les souris néonatales peuvent régénérer leur cœur par la prolifération cardiomyocyte suite à une résection apique5. Bien que cette technique puisse évoquer la régénération cardiaque dans les nouveau-nés, la chirurgie manque de pertinence clinique aux dommages cardiaques humains. Afin d’imiter une blessure humaine dans le modèle néonatal de souris, nous avons développé une technique pour induire une infarctus du myocarde par une occlusion coronaire6. Cette technique nécessite la ligature chirurgicale de l’artère descendante antérieure gauche (LAD), qui est responsable de la livraison de 40%-50% du sang au myocarde ventriculaire gauche6,7. Ainsi, la chirurgie entraîne une infarctus qui affecte une partie significative de la paroi ventriculaire gauche. Ces dommages au myocarde stimuleront la prolifération cardiomyocyte et la régénération cardiaque dans les nouveau-nés5.
La chirurgie d’occlusion de l’artère coronaire fournit une méthode hautement reproductible et directement translationnelle pour découvrir le fonctionnement interne de la régénération cardiaque. La chirurgie néonatale parallèle à l’athérosclérose de l’artère coronaire dans le cœur humain, où l’accumulation de la plaque dans les parois intérieures des artères peut causer une occlusion et l’infarctus du myocarde suivant8. En raison d’un vide dans les traitements thérapeutiques pour les patients souffrant d’insuffisance cardiaque, une occlusion dans le LAD est associée à des taux de mortalité atteignant jusqu’à 26% dans l’année suivant la blessure9, et par conséquent a été appelé le «fabricant de veuves». Les progrès de la thérapeutique exigent un modèle qui reflète fidèlement les effets physiologiques et pathologiques complexes des lésions cardiaques. Notre protocole chirurgical pour les lésions cardiaques néonatales de souris fournit une plate-forme qui permet aux chercheurs d’étudier les indices moléculaires et cellulaires qui signalent la régénération de coeur de mammifères après la blessure.
Des recherches récentes mettent en évidence la relation dynamique entre l’environnement extracellulaire et la prolifération des cardiomyocytes. Par exemple, la fenêtre régénératrice postnatale peut être prolongée en diminuant la rigidité de la matrice extracellulaire entourant le cœur10. Les biomatériaux de la matrice extracellulaire néonatale peuvent également favoriser la régénération cardiaque dans les cœurs de mammifères adultes à la suite d’une blessure cardiaque11. La prolifération cardiomyocyte accompagne également une réponse angiogénique12,13; la formation d’artère collatérale unique au coeur régénérant de la souris néonatale s’est avérée essentielle pour stimuler la régénération cardiaque12. En outre, notre laboratoire a démontré que la signalisation nerveuse régule la prolifération cardiomyocyte et la régénération cardiaque par modulation des niveaux de facteur de croissance, ainsi que la réponse inflammatoire après la blessure14. Ces résultats soulignent la nécessité de retracer les populations de cellules non myocytes en réponse aux dommages cardiaques. Afin d’atteindre cet objectif, nous avons profité du système de recombinaison Cre-lox dans les lignées de souris transgéniques pour incorporer l’expression constitutive ou conditionnelle des protéines de journaliste fluorescent pour le traçage de la lignée. En outre, nous pouvons utiliser des méthodes avancées pour déterminer le modèle d’expansion clonale avec la ligne de souris Rainbow, qui s’appuie sur l’expression stochastique des cre-dépendants, multi-couleurs des journalistes fluorescents pour déterminer l’expansion clonale des populations cellulaires ciblées15. L’utilisation de la traçabilité de lignée avec la chirurgie néonatale d’occlusion d’artère coronaire est un outil puissant pour disséquer les mécanismes cellulaires complexes de la régénération cardiaque.
Il est difficile de suivre la lignée des cellules étiquetées fluorescentes à l’imagerie d’organes entiers tridimensionnelles (3D) en utilisant la technique traditionnelle de sectionnement et de reconstruction, en particulier lorsque les populations cellulaires sont fragiles, comme les fibres nerveuses ou les vaisseaux sanguins. Tandis que l’imagerie complète directe de l’organe par section optique peut capturer des populations superficielles de cellules, les structures qui résident profondément dans le tissu restent inaccessibles. Pour contourner ces barrières, des techniques de compensation tissulaire ont été développées pour réduire l’opacité des tissus d’organes entiers. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés pour effacer les méthodes compatibles acrylamide-hybridées d’imagerie rigide compatibles à l’imagerie par les lipides, les méthodes basées sur le tissu hYdrogel (CLARITY), qui effacent les tissus fixes par extraction lipidique16. Des mesures sont également prises pour homogénéiser l’indice réfractivant et réduire par la suite la diffusion de la lumière lors de l’imagerie17. Une telle méthode est active CLARITY, qui accélère la décomposition des lipides en utilisant l’électrophorèse pour pénétrer le détergent dans tout le tissu18. Bien qu’efficace, cette méthode de compensation tissulaire nécessite un équipement coûteux et peut causer des lésions tissulaires, ce qui rend l’approche incompatible avec les populations cellulaires fragiles telles que les nerfs cardiaques19. Ainsi, nous utilisons l’approche passive CLARITY, qui repose sur la chaleur pour faciliter doucement la pénétration du détergent, contribuant ainsi à la rétention des structures cellulaires complexes20,21.
La CLARITY passive est généralement considérée comme moins efficace que LA CLARITY18active, car la technique est souvent accompagnée de deux obstacles majeurs : l’incapacité à effacer toute la profondeur de l’organe et la quantité considérable de temps nécessaire pour effacer les tissus adultes. Notre approche passive CLARITY surmonte ces deux barrières grâce à un processus de compensation accéléré capable de nettoyer complètement les tissus cardiaques néonatals et adultes. Notre technique passive de compensation des tissus CLARITY a atteint une efficacité qui permet la visualisation d’une variété de populations de cellules cardiaques, y compris les populations rares réparties dans tout le cœur adulte. Lorsque le cœur dégagé est photographié avec la microscopie confocale, l’architecture des motifs spécifiques aux cellules pendant le développement, la maladie et la régénération peut être éclairée.

<table><tbody><tr><td>1-thioglycérol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutures prolène</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>Sutures en polypropylène</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide</td><td></td><td></td><td></td>borique</tr><tr><td>Pince incurvée Excelta</td><td></td><td>16-050-146</td><td>Demi-courbée, dentelée, 4 po</td></tr><tr><td>Pince à pansement</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>Flacon de dissection, 4,5 po</td></tr><tr><td>en verre</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>12 x 35 mm Flacon avec capuchon</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Gradient de densité moyen</td></tr><tr><td>Ciseaux d’iridectomie</td> Outils <td>de science fine</td><td>15000-03</td><td>Tranchant de 2 mm</td></tr><tr><td>Grands ciseaux de dissection</td><td>Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>Droit, 6 po</td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar, 6 po</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de phosphate de paraformaldéhyde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince tranchante</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z168777</td><td>pointe fine, droite, 4,25 po</td></tr><tr><td>Petit ciseau de dissection</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>Tranchant 30 mm</td></tr><tr><td>Azoture</td> de sodium Dodécyle <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sulfate (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus</td><td>Excelta</td><td>16050133</td><td>Tissu moyen, 1X2 Dents</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td></td><td>Initiateur azoïque soluble dans l’eau</td></tr></tbody></table>

capturer la réponse aux blessures cardiaques des populations cellulaires ciblées par l’imagerie tridimensionnelle du cœur effacé

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Les maladies cardiovasculaires surclassent toutes les autres causes de décès et sont responsables d’un nombre stupéfiant de 31 % des mortalités dans le monde. Cette maladie se manifeste dans les dommages cardiaques, principalement sous la forme d’une infarctus aigu du myocarde. Avec peu de résilience suite à une blessure, le tissu cardiaque une fois en bonne santé sera remplacé par du tissu cicatriciel fibreux et non contractuel et souvent un prélude à l’insuffisance cardiaque. Pour identifier de nouvelles options de traitement en médecine régénérative, la recherche s’est concentrée sur les vertébrés avec des capacités régénératrices innées. Un tel organisme modèle est la souris néonatale, qui répond aux dommages cardiaques avec la régénération myocardique robuste. Afin d’induire une blessure dans la souris néonatale qui est cliniquement pertinente, nous avons développé une chirurgie pour occlude l’artère descendante antérieure gauche (LAD), reflétant une infarctus du myocarde déclenchée par l’athérosclérose dans le coeur humain. Lorsqu’il est jumelé à la technologie pour suivre les changements à la fois au sein des populations cardiomyocytes et non-myocytes, ce modèle nous fournit une plate-forme pour identifier les mécanismes qui guident la régénération cardiaque. L’amélioration des changements dans les populations de cellules cardiaques à la suite d’une blessure reposait autrefois fortement sur des méthodes telles que la section tissulaire et l’examen histologique, qui sont limitées à l’analyse bidimensionnelle et endommagent souvent le tissu dans le processus. En outre, ces méthodes n’ont pas la capacité de retracer les changements dans les lignées cellulaires, au lieu de fournir simplement un instantané de la réponse aux blessures. Ici, nous décrivons comment les méthodes technologiquement avancées dans les modèles de traçage de lignée, le dégagement entier d’organe, et la microscopie entière tridimensionnelle (3D) de montage entier peuvent être employées pour élucider des mécanismes de réparation cardiaque. Avec notre protocole pour la chirurgie néonatale d’infarctus du myocarde de souris, le dégagement de tissu, et la formation image entière d’organe de 3D, les voies complexes qui induisent la prolifération cardiomyocyte peuvent être démêlées, révélant de nouvelles cibles thérapeutiques pour la régénération cardiaque.

Souvent, les deux étapes les plus difficiles guident le cœur hors de la cavité thoracique et ligatant le LAD. Pour dépanner ces étapes, des ajustements peuvent être apportés au placement de la ponction initiale entre les quatrièmes muscles intercostal; si la ponction et la dissection émoussée sont trop proches du sternum, le cœur peut ne pas être en mesure de sortir de la cavité thoracique(figure 1A).
En outre, une pression accrue sur l’abdomen ga...

La prolifération cardiomyocyte suivant la blessure est un processus dynamique qui exige une symphonie des repères extracellulaires des populations de cellules non-myocytes. En utilisant le traçage de la lignée, le CLARITY passif et les techniques de microscopie confocale à monture entière en trois dimensions, nous pouvons analyser l’influence d’une variété de types de cellules sur la réparation cardiaque et la régénération.

Capturer la réponse aux blessures cardiaques des populations cellulaires ciblées par l’imagerie tridimensionnelle du cœur effacé

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

La régénération endogène du cœur est un processus dynamique qui implique plusieurs types de cellules travaillant ensemble de concert pour monter une réponse régénérative robuste. Peering dans le tissu régénérant par l’imagerie 3D du coeur dégagé en réponse aux dommages peut aider à la reconstruction de la dynamique cellulaire qui guident cette réponse régénératrice cardiaque. Notre protocole est spécifiquement conçu pour suivre les cellules pendant le développement et la régénération.Nous ne prévoyons aucune limite à l’application générale de nos techniques de compensation, de coloration et d’imagerie à d’autres types d’organes. Pour l’occlusion coronaire lad-induite, stérilisez d’abord la zone chirurgicale d’un chiot néonatal anesthésié d’un jour avec la solution antiseptique. Faire une incision transversale de la peau dans la région de la poitrine.Pour séparer la peau du muscle, utilisez une paire de forceps de pansement pour soulever la peau soigneusement tout en appuyant doucement sur les ciseaux contre les muscles intercostals en position fermée. Localiser le quatrième espace intercostal et utiliser de petits forceps pour faire une petite ponction superficielle en prenant soin d’éviter les organes internes. À l’aide de la dissection contondante et des forceps d’habillage, élargir la zone entre les muscles intercostals jusqu’à ce qu’un doigt puisse être appliqué sur le côté gauche de l’abdomen tout en tenant l’espace intercostal ouvert avec des forceps d’habillage pour guider doucement le cœur hors de la cavité thoracique.Une fois que le cœur a été extrait, permettre au cœur de se reposer sur les muscles intercostals et de localiser le LAD comme la région du cœur avec moins de sang mis en commun. Pour induire l’infarctus du myocarde, utilisez une suture 6-0 pour attacher un nœud carré étroitement autour du navire deux fois sans couper l’artère. Le blanchiment au sommet doit être observé immédiatement.Il est important de rester cohérent sur le placement de suture le long du LAD pour une taille infarctus similaire. Ceci est mieux réalisé en accédant au cœur rapidement tandis que le sang coule encore à travers les artères. Lorsque la suture a été placée, laissez le cœur se glisser dans la cavité thoracique.Suture les côtes avec un chirurgien et un noeud carré en utilisant des forceps émoussés pour soulever l’ensemble supérieur des côtes tout en passant une suture 6-0 à travers l’ensemble supérieur et inférieur des côtes. Appliquer un petit volume de colle de peau sur le haut de l’abdomen et utiliser des forceps fins pour positionner la peau du bas-ventre sur la région de la poitrine exposée. Ensuite, placez le chiot sur un coussin chauffant et effectuez la ligature sur l’animal suivant.Lorsque toutes les chirurgies ont été effectuées, retournez les chiots chauds et mobiles dans la cage familiale de la mère. Pour la clarté passive du tissu cardiaque récolté, 21 jours de postsurgery après confirmation d’un manque de réponse au pincement d’onteil, placez la souris sur une zone chirurgicale propre dans la position supine et fixez les membres avec le ruban adhésif. À l’aide de forceps tissulaires, saisir la fourrure juste en dessous du processus xiphoïde et faire une incision couvrant la largeur de la cage thoracique.Couper le long des parties distales de la cage thoracique et utiliser les forceps pour soulever le processus xiphoïde pour exposer le diaphragme. Détachez le diaphragme avec des forceps incurvés et tirez le tissu cranially jusqu’à ce que le cœur battant est accessible. Utilisez les forceps incurvés pour saisir le cœur à la base et utilisez des ciseaux iridectomy pour couper l’aorte et le cava vena supérieur.Placez le cœur battant dans une boîte de Pétri de PBS de sorte que le cœur pompe tout sang retenu. L’infarctus du myocarde peut être confirmé par un placement anatomique correct de la ligature lad. Lorsque le cœur cesse de battre, presser doucement l’organe avec des forceps pour expulser le sang résiduel et transférer le spécimen dans un flacon de coquille de verre jetable de 2,5 millilitres contenant deux millilitres de PBS.Placez le flacon sur un shaker pendant au moins 30 minutes à température ambiante en changeant la solution PBS toutes les 10 minutes jusqu’à ce que la solution reste claire du sang. Lorsque le PBS est clair, remplacez le PBS par deux millilitres de paraformaldéhyde froid de 4 % pour une incubation de quatre heures à température ambiante, suivi de trois lavages de 10 minutes sur le shaker avec deux millilitres de PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, remplissez le flacon de deux millilitres de 4% d’acrylamide complété par une solution VA-044 de 0,5% pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, placez le flacon dans un bloc thermique de 37 degrés Celsius pendant trois heures. À la fin de la polymérisation, transférer le cœur dans un nouveau flacon de coquille de verre et laver le tissu cardiaque en deux millilitres de PBS frais 10 minutes à la fois rafraîchir le PBS à la fin de chaque incubation. Lorsque le PBS est clair, remplacez le tampon de lavage par deux millilitres de solution de compensation.Incuber le spécimen à 37 degrés Celsius pendant plusieurs semaines jusqu’à ce que le cœur soit clair, rafraichissant la solution de compensation tous les deux à trois jours. Lorsque l’organe est clair, lavez le spécimen avec du PBS sur le shaker tel que démontré avant de remplir le flacon avec du PBS frais pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le PBS par rims pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, le tissu est entièrement défriché. Le tissu doit devenir transparent après plusieurs semaines. Pour l’imagerie du cœur de souris postnatale effacé après l’intronisation du myocarde, remplissez la moitié d’une chambre d’une glissière de dépression sur mesure avec PBS et utilisez des forceps incurvés pour transférer soigneusement le cœur dégagé dans la chambre.Remplissez le volume restant de la chambre de PBS. Remplissez ensuite la chambre de PBS jusqu’à ce que la surface du liquide forme un dôme au-dessus du haut de la chambre et montez la glissière de couverture avant d’imagerie du tissu par microscopie confocale selon les protocoles d’imagerie standard. Si la perforation et la dissection émoussée sont trop proches du sternum, le cœur peut ne pas être en mesure de sortir de la cavité thoracique.Si le cœur ne sort pas facilement de la cavité, appliquez une pression sur l’abdomen gauche pour faciliter le processus. Des complications peuvent survenir en reposant le cœur sur les muscles intercostals. Par conséquent, il est important de maintenir la dissection émoussée à une taille minimale dans une orientation horizontale pour permettre une visualisation claire et l’accessibilité du LAD.Notez qu’une ligature superficielle aura moins de place pour l’ajustement dans le placement final de suture et que la suture lissant autour du LAD devrait être exécutée avec des mouvements réguliers commandés. À la fin de l’étape de compensation, tout le cœur doit être constamment opaque sans décoloration au centre. Après quelques jours dans la solution RIMS à température ambiante, le cœur doit être complètement dégagé et une certaine expansion des tissus peut être observée.Comme observé par l’expression de protéine de journaliste de tdTomato, les nerfs cardiaques sont principalement superficiels avec quelques populations résidant dans la couche épidardiale. Fait important, la confirmation de l’expression protéique du journaliste est préservée après avoir subi le protocole de clarté tel que démontré. Le dégagement et l’imagerie du cœur 3D offrent une perspective sur l’emplacement et la morphologie des populations de cellules cardiaques.Cela nous permet d’identifier de nouveaux aspects dans le modelage cellulaire et les interactions cellule-cellule.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Myocytes cardiaques adultes sont des cellules primaires qui peuvent être isolés de coeurs d'animaux et cultivées pendant plusieurs jours. Durant cette période, la culture de transfert de gènes adénoviraux peut être utilisé pour exprimer les biocapteurs génétiquement codés (ADB) ou des protéines de fusion fluorescentes. Les deux approches permettent d'enquêtes cellulaires par microscopie confocale.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Nous décrivons un protocole permettant d’imager volumétriquement des cellules marquées par des protéines fluorescentes profondément à l’intérieur de cœurs embryonnaires et postnatals intacts. En utilisant des méthodes de nettoyage des tissus en combinaison avec la coloration de l’ensemble du support, des cellules uniques marquées par des protéines fluorescentes à l’intérieur d’un cœur embryonnaire ou postnatal peuvent être imagées de manière claire et précise.

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Le test actuel de 2,3,5-Triphényltétrazolium (TTC) introduit un protocole de coloration affiné de la TTC qui permet l’analyse des lésions du myocarde à la résolution microscopique, produisant des images de haute qualité permettant une évaluation précise et fiable de la taille de l’infarctus et de la viabilité des cardiomyocytes au niveau cellulaire.

Un test microscopique de chlorure de 2,3,5-triphényltérazolium pour une analyse précise et fiable des lésions myocardiques

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Capturer la réponse aux blessures cardiaques des populations cellulaires ciblées par l’imagerie tridimensionnelle du cœur effacé (Vidéo) | JoVE Journal

Capturer la réponse aux blessures cardiaques des populations cellulaires ciblées par l’imagerie tridimensionnelle du cœur effacé

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