Name: Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez la culture 3D de matrice extracellulaire et adipocytes humains pour étudier le métabolisme du tissu adipeux et les interactions matrice-cellule. Ce modèle permet d'explorer le rôle de la matrice dans la différenciation adipogène.

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Nous remercions Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa et Retha Geiss pour leur aide dans la coordination des études. SEM a été réalisé par l'Université du Michigan Microscopy et L'analyse d'images Laboratoire de recherche biomédicale Core Facility. Ce projet a été soutenu par des subventions des NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant du Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Subventions pilotes VISN 10 SPARK de l'Administration des anciens combattants ( RWO). Microscopie électronique à balayage effectuée par l'University of Michigan Microscopy and Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figure 4 de ce manuscrit a été publiée à l'origine dans Baker et coll., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, et a été reproduit avec la permission d'Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Pour obtenir la permission de réutiliser ce matériel, veuillez visiter http://global.oup.com/academic/rights.

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li>
<li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li>
<li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology.+960%22%5BJournal%5D)">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li>
<li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR%CE%B3+and+adipocyte+size%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+in+human+adipose+tissue%3A+composition%2C+distribution%2C+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li>
<li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li>
<li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+fibrosis%2C+hypertrophy%2C+and+hyperplasia%3A+correlations+with+diabetes+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li>
<li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li>
<li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li>
<li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Patholology%22%5BJournal%5D)">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li>
<li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li>
<li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).</li>
<li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Macedonian+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li>
<li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia%27s+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165(2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent pas d'intérêts contradictoires.

Le modèle de culture ECM-adipocyte fournit un outil précieux pour disséquer les rôles individuels de l'ECM et des cellules dans la dictation du phénotype tissulaire ultime. Le protocole d'isolement d'ECM est tout à fait reproductible, mais la variabilité dans le processus de décellularization peut être observée. L'étape de délipidation du Jour 3 est un point critique du protocole. À l'achèvement de l'extraction de nuit, la délipidation de la matrice devrait être démontrée par la solution de solvant polaire qui devient ja...

La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement un échafaudage mécanique pour les tissus, mais s'engage également dans le crosstalk complexe avec des cellules qui résident en elle, régulant divers processus nécessaires pour l'homéostasie tissulaire, y compris la prolifération cellulaire, différenciation, signalisation et métabolisme1. Tandis que l'ECM sain joue un rôle essentiel le maintien de la fonction normale de tissu, l'ECM dysfonctionnel a été impliqué dans les maladies multiples2.
Le tissu adipeux joue un rôle important dans la pathogénie de la maladie métabolique. L'obésité est associée à l'hypertrophie excessive d'adipocyte et à l'hypoxie cellulaire, aux défauts dans le métabolisme cellulaire d'adipocyte, et au reticulum et à l'inflammation d'endoplasmique de tissu adipeux. Bien que mal compris, ces processus complexes conspirent pour altérer la capacité de tamponde de nutriment de tissu adipeux, menant au débordement nutritif du tissu adipeux, à la toxicité dans les tissus multiples, et à la maladie métabolique systémique3,4 ,5. La séquence des événements et des mécanismes spécifiques qui sous-tendent l'échec de tissu adipeux sont mal compris, mais des altérations dans l'ECM de tissu adipeux ont été impliquées. La composition d'ECM est modifiée dans le tissu adipeux dans l'obésité humaine et murine, avec le dépôt accru de protéine d'ECM avec les différences biochimiques et structurales qualitatives dans le tissu adipeux ECM lié à la maladie métabolique humaine, y compris diabète de type 2 et hyperlipidémie6,7,8,9,10,11.
En dépit de ces observations, le rôle de l'ECM de tissu adipeux en médiatisant le dysfonctionnement adipeux de tissu n'est pas bien défini. Cela est dû en partie à un manque de modèles expérimentaux traitables qui permettent la dissection des rôles spécifiques de l'ECM et des adipocytes dans la régulation de la fonction ultime du tissu adipeux. La culture eCM-adipocyte simule mieux l'environnement in vivo du tissu adipeux indigène à au moins deux égards. Tout d'abord, la culture ECM fournit un environnement moléculaire similaire au tissu adipeux indigène, y compris les collagènes indigènes, les élastines et autres protéines matricielles absentes dans la culture 2D standard. Deuxièmement, la culture sur le plastique 2D a été montré pour modifier le métabolisme des adipocytes par des effets mécaniques en raison de l'élasticité diminuée du substrat plastique12, qui ECM-culture élimine.
Les méthodes pour concevoir des échafaudages biologiques par l'isolement de l'ECM de l'adipose décellularisé et d'autres tissus ont été étudiées dans le contexte de la médecine régénératrice et reconstructive et de l'ingénierie tissulaire13,14, 15,16,17,18. Nous avons déjà publié une méthodologie dans laquelle nous avons adapté ces méthodes pour développer un modèle 3D in vitro de la culture humaine ECM-adipocyte, en utilisant des cellules souches ECM et adipocytes (préadipocytes) dérivés de tissus adipeux viscéraux humains11. Dans le présent article, nous décrivons ces méthodes en détail. La procédure de décellularisation du tissu adipeux humain est un processus de quatre jours qui implique des traitements mécaniques et enzymatiques pour enlever les cellules et les lipides, laissant un échafaudage biologique qui maintient les caractéristiques du tissu à partir duquel il est dérivé. L'ECM décellularisé soutient la différenciation adipogénique des préadipocytes humains, et lorsqu'il est reconstitué avec des adipocytes, maintient la microarchitecture et les caractéristiques biochimiques et spécifiques à la maladie du tissu adipeux intact et s'engage dans le métabolisme fonctions caractéristiques du tissu adipeux indigène. Cette matrice peut être étudiée seule ou réensemencée avec des cellules, permettant l'étude des interactions et du croisement entre les composants cellulaires et extra-cellulaires du tissu adipeux.

<table><tbody><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tube cryovial de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10 % Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; m filtre à mailles en nylon</td><td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 24 puits</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 96 puits</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycotique (ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#B4639</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I du pancréas bovin, type II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#BP231</td><td>Inflammable, caustique</td></tr><tr><td>EDTA disodique</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA États-Unis</td><td>Cat#BP118</td><td></td></tr><tr><td>Acide D-pantothénique sel hémicalcique</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié : Mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td><td>Cat#DSP-MD.43</td> Lames de comptage de cellules <td>EVE inflammables</td></tr><tr><td>, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis</td><td>Cat#10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#G5882</td><td></td></tr><tr><td>Hexaméthyldisalizane</td> caustique <td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#440191</td><td>Inflammable, caustique</td></tr><tr><td>Solution d’insuline humaine</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA États-Unis</td><td>Cat#A415</td><td></td></tr><tr><td>Isoprotérénol</td> inflammable <td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#I5627</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lipase du pancréas porcin, type VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, États-Unis</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA États-Unis</td><td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>Coupe optimale température (OCT) composé</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td><td>Cat# AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Solution (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Stain Kit</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#201030</td><td>Caustic</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#93482</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate caustique (PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A du pancréas bovin, type III-A</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>Fluide à scintillation</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr>Compteur <td></td><td></td><td></td>à<td>scintillation</td></tr><tr><td>Ciseaux, pinces,</td> tampon de phosphate de Sorensen stérile <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS # : 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture T-150</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, États-Unis</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur</td><td></td><td></td><td></td>orbital à température contrôlée</tr><tr><td>Homogénéisateur de tissus, BeadBug Homogénéisateur de microtubes</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Cat#D1030</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T3309</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détermination des triglycérides</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Coloration bleue trypan, 0.4 %</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Type II Collagénase</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman Reeve Angel, Grade 201, 150mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3d pour étudier matrix-cell metabolic crosstalk

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

La matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle central dans la régulation de l'homéostasie tissulaire, s'engageant dans le crosstalk avec les cellules et régulant de multiples aspects de la fonction cellulaire. L'ECM joue un rôle particulièrement important dans la fonction de tissu adipeux dans l'obésité, et des changements dans le dépôt et la composition d'ECM de tissu adipeux sont associés à la maladie métabolique chez les souris et les humains. Les modèles in vitro traitables qui permettent la dissection des rôles de l'ECM et des cellules en contribuant au phénotype global de tissu sont clairsemés. Nous décrivons un nouveau modèle in vitro 3D de la culture humaine d'ECM-adipocyte qui permet l'étude des rôles spécifiques de l'ECM et des adipocytes en régulant le phénotype métabolique de tissu adipeux. Le tissu adipeux humain est décellularisé pour isoler l'ECM, qui est ensuite repeuplé avec des prédipocytes qui sont ensuite différenciés dans l'ECM en adipocytes matures. Cette méthode crée des constructions ECM-adipocyte qui sont métaboliquement actives et conservent des caractéristiques des tissus et des patients dont ils sont dérivés. Nous avons utilisé ce système pour démontrer la maladie spécifique ECM-adipocyte crosstalk dans le tissu adipeux humain. Ce modèle de culture fournit un outil pour disséquer les rôles de l'ECM et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique global de tissu adipeux et permet l'étude du rôle de l'ECM en réglant l'homéostasie de tissu adipeux.

La préparation de l'ECM du tissu adipeux, l'ensemencement avec des préadipocytes et la différenciation in vitro en adipocytes matures entraînent des changements morphologiques séquentiaux clairs dans les tissus qui permettent l'évaluation visuelle des progrès tout au long du protocole (Figure 1) . Les prédipocytes utilisés pour semer l'ECM sont isolés à l'aide de la digestion de collagène à partir d'échantillons de TVA distincts (figure 2...

Nous décrivons un système de culture in vitro de matrice-adipocyte extracellulaire humain 3D qui permet la dissection des rôles de la matrice et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique de tissu adipeux.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Notre protocole démontre que l’ECM peut favoriser la différenciation adipogenic en l’absence des médiateurs adipogenic classiques et est le premier à démontrer la régulation maladie-spécifique du métabolisme cellulaire par l’ECM. Notre technique fournit un outil pour disséquer les rôles de l’ECM et des adipocytes dans le métabolisme des tissus adipeux et permettre l’étude du rôle de l’ECM dans la régulation de l’homéostasie des tissus adipeux. Comparé à la culture standard de cellules 2D, notre modèle 3D permet l’examen et la dissection plus robustes de la conversation croisée entre les adipocytes et l’ECM de tissu adipeux dans le contexte du diabète de type 2.Nous recommandons de commencer par des échantillons plus petits pour évaluer dans quelle mesure il est cellulaire. Gardez à l’esprit qu’il existe une variabilité interpatiale dans la façon dont les cellules se développent et dans quelle mesure le tissu se décellularise. Il est important d’observer le tissu avant et après chaque étape pour s’assurer que le tissu est en train de se décellulariser et pour comprendre les différences potentielles entre les échantillons.Après avoir obtenu le tissu adipeux viscéral ou la TVA de la chirurgie, préparez-le pour le stockage en ajoutant 5-10 grammes du tissu à 15-25 millilitres de solution tampon de congélation dans un tube conique de 50 millilitres. Immerger complètement l’échantillon et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la décellularisation. Pour l’isolement des préadipocytes, placez deux grammes d’un échantillon frais de TVA intacte dans 20 millilitres de solution de type II de collagène, puis insérez des ciseaux stériles dans le tube et hachez soigneusement le tissu.Une fois haché dans une boue fine, l’incuber dans la solution de collagène à 37 degrés Celsius sur un shaker orbital pendant 60 minutes. Après l’incubation, filtrer le résultat digéré à travers un maillage en nylon de 100 micromètres dans un tube conique frais de 50 millilitres. Le digéré doit être un liquide jaune-orange avec une viscosité modérée et une petite quantité de brins résiduels de tissu non digéré.Centrifuger l’échantillon à 270 fois g pendant 10 minutes, enlever le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en deux millilitres de solution de lysage RBC 1X avec une pipette. Incuber la solution pendant une minute à 25 degrés Celsius, puis ajouter 10 millilitres de 15%FBS DMEM F12 et la centrifuger à 270 fois g pendant 10 minutes. Pour préparer l’ECM, congeler/décongeler l’échantillon de TVA préalablement congelé à 37 degrés Celsius en l’incubant dans un bain d’eau préchauffé pendant 20 minutes avec une agitation manuelle périodique douce.Une fois décongelé, transférez le tissu à moins 80 degrés Celsius pendant 20 minutes et répétez le processus de gel/dégel trois fois se terminant par la décongélation. Utilisez des forceps stériles pour transférer l’échantillon de TVA dans un tube conique frais de 50 millilitres contenant de 15 à 25 millilitres de solution enzymatique 1 en s’assurant que l’échantillon est complètement immergé. Puis l’incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 130 RPM.Le lendemain, lavez l’échantillon trois fois avec 15-25 millilitres de solution tampon de rinçage, versant la solution après chaque lavage. Transférer l’échantillon dans un tube frais de 50 millilitres avec 15-25 millilitres de solution enzymatique 2 et l’incuber pendant la nuit. Répétez les lavages avec la solution tampon de rinçage et transférez l’échantillon dans un tube frais contenant de 15 à 25 millilitres de solution d’extraction de solvant polaire.Incuber l’échantillon toute la nuit en secouant. Après incubation avec la solution de solvant polaire, il est important d’examiner l’échantillon pour l’élimination des lipides. Si la majeure partie du lipide n’est pas enlevée, il peut être nécessaire de répéter cette étape.Un temps d’incubation plus court peut être utilisé. Après l’incubation, transférer l’échantillon dans un tube frais contenant de 15 à 25 millilitres de solution tampon de rinçage et laver l’échantillon trois fois sur le shaker. Lavez ensuite l’échantillon trois fois avec une solution à 70 % d’éthanol, en versant l’éthanol après chaque lavage.Lavez l’échantillon une fois avec la solution de stockage, puis utilisez des forceps stériles pour transférer dans un tube frais contenant 15-25 millilitres de solution de stockage en s’assurant de l’immerger complètement. L’échantillon peut ensuite être conservé à quatre degrés Celsius pendant une période d’un mois. L’isopropanol et l’éthanol sont inflammables et doivent être à température ambiante et éliminés dans des déchets inflammables.Tous les déchets humains doivent être éliminés séparément des déchets biorisques habituels. Transférer les fragments d’ECM stockés dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits avec des forceps stériles ajoutant autant de fragments que nécessaire pour les analyses prévues en aval. Lavez-les trois fois avec 500 microlitres de 70% d’éthanol sur un shaker orbital, puis réhydratez-les en les lavant trois fois avec du PBS.Utilisez des ciseaux stériles pour couper l’ECM en fragments de 100 milligrammes. Placez chaque fragment dans un puits d’une plaque de 24 puits et incubez la plaque à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre à l’excès de PBS d’extruder des fragments. Retirez ensuite soigneusement les restes de PBS des puits à l’aide d’une pipette.Ensemencer chaque fragment avec 20 microlitres de suspension cellulaire préadipocyte en pipetant les cellules directement dans l’ECM. Placez la pointe de pipette dans l’ECM et expulsez-la doucement au centre de la matrice en vous assurant que la suspension cellulaire ne déborde pas et ne se retrouve pas au fond du puits. Si la suspension cellulaire déborde de l’ECM, retirez la pointe pipette de cet endroit et insérez-la ailleurs dans l’ECM.Après l’ensemencement cellulaire, incuber l’ECM pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Remplissez chaque puits de 500 microlitres de supports de croissance pour couvrir les fragments d’ECM ensemencés. Culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures.Après 72 heures, aspirez soigneusement le média de croissance sans perturber le fragment d’ECM. Ajouter 500 microlitres de médias de différenciation et de culture des cellules pendant 14 jours en changeant les médias tous les deux à trois jours. Vérifiez la différenciation à l’aide d’une microscopie légère.Les cellules accumuleront des lipides, deviendront de couleur brun-jaune et deviendront plus sphériques à mesure qu’elles se différencieront. La préparation de l’ECM de tissu adipeux, l’ensemencement avec des preadipocytes, et la différenciation in vitro dans les adipocytes mûrs ont été surveillés avec la microscopie électronique de balayage qui a indiqué la dcellularisation de l’ECM et la récapitulation suivante des lipides contenant des adipocytes sur le résédage et la différenciation. Le collagène 1 immunohistochimie spécifique de l’ECM décellularisé a montré le maintien de la micro-architecture de collagène tandis que la coloration rouge-o d’huile des constructions vivantes et fixes d’ECM-adipocyte de 3D a montré le lipide contenant des adipocytes.Les adipocytes différenciés dans ECM ont été examinés pour des gènes adipogenic utilisant le PCR en temps réel quantitatif qui a démontré que ces gènes sont upregulated dans les cellules différenciées par rapport aux préadipocytes indifférenciés cultivés dans ECM. La différence complète dans les niveaux de transcription est indiquée. Quatre combinaisons d’ECM et d’adipocytes des sujets diabétiques et nondiabetic ont été soumises au phénotypage métabolique.L’absorption altérée de glucose dans la fonction lipolytique a été découverte dans des constructions des tissus diabétiques. Fait important, il a été constaté que l’ECM nondiabetic sauve l’absorption insuline-stimulée de glucose et la capacité lipolytique dans les adipocytes diabétiques. La contamination des préadipocytes isolés, du tissu décellulaire et de l’ECM réséqué n’est pas rare.La stérilité doit être maintenue avec diligence tout au long du protocole.

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