Identification des voies d'accueil ciblées par les protéines d'effetbactérieur à l'aide d'écrans de toxicité et de suppression de levures

Les bactéries intracellulaires sécrètent des protéines effectrices dans l’hôte qui peuvent manipuler les voies biologiques pour favoriser la survie des pathogènes. Révéler les cibles hôtes des effecteurs est essentiel pour comprendre les pathogènes intracellulaires comme Chlamydia trachomatis. La toxicité des levures et les écrans suppresseurs peuvent fournir un aperçu clé de la cible biologique naturelle des protéines effectrices bactériennes et peuvent être particulièrement utiles lorsqu’un partenaire liant est inconnu.

Nous démontrons la toxicité de levure et les analyses de suppresseur ici pour le criblage pour des protéines d’effecteur de trachomatis de Chlamydia, mais cette technique a également été employée pour caractériser legionella pneumophila et effecteurs de burnetii de Coxiella. Commencez par inoculer cinq millilitres de bouillon d’abandon unique avec la colonie unique de levure transformée avec la protéine effectrice contenant du plasmide. Utilisez la levure transformée avec le vecteur seul comme un contrôle négatif et incuber l’inoculum pendant la nuit à 30 degrés Celsius tout en secouant.

Le lendemain, ajouter 180 microlitres d’eau stérile aux puits A2 à A6 d’une plaque de 96 puits. Vortex de la culture de nuit et ajouter 180 microlitres de levure au puits A1. Ensuite, diluer périodiquement la levure dans les puits avec de l’eau. Utilisez une pipette multicanal pour repérer cinq microlitres de chaque dilution sur un seul glucose décrocheur et des plaques d’agar galactose décrocheuses et incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après l’incubation, évaluer visuellement la toxicité en comparant la croissance de la levure exprimant la protéine effectrice cultivée sur le média contenant de la galactose à la croissance de levure exprimant le seul vecteur. Inoculer 100 millilitres du bouillon d’abandon unique avec un millilitre du bouillon de levure préalablement préparé et l’incuber pendant 16 à 24 heures à 30 degrés Celsius avec secousses à 150 RPM. Le lendemain, ajouter les 100 millilitres entiers de la culture nocturne à 900 millilitres de bouillon unique préchauffé et incuber le flacon pendant quatre à cinq heures à 30 degrés Celsius en secouant.

Après l’incubation, pelleter la culture à 6000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille en 250 millilitres d’eau stérile. Répétez la centrifugation et jetez le supernatant.

Puis resuspendez la pastille en 250 millilitres d’acétate de lithium millimlaire. Pelleter la culture par centrifugation, enlever l’acétate de lithium, et resuspendre la pastille en 9,6 millilitres de 50%PEG 3350. Ajoutez ensuite les réapprovisionnements de transformation tels que décrits dans le manuscrit et ajustez le volume à 15 millilitres avec de l’eau stérile inversant doucement pour mélanger.

Incuber le mélange à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 750 microlitres de DMSO et incuber dans un bain d’eau à 42 degrés Celsius pendant encore 30 minutes. L’ajout du DMSO avant le choc thermique est crucial pour atteindre une efficacité de transformation élevée.

Après l’incubation, pelleter la levure en centrifugant à 3000 fois g pendant cinq minutes. Jeter le supernatant et laver la pastille avec 10 millilitres d’eau stérile, puis répéter la centrifugation pour pelleter la levure. Resuspendez la pastille en huit millilitres d’eau.

Déterminez l’efficacité de la transformation en diluant l’échantillon un à 10 et en placage de 100 microlitres de chaque dilution sur une double agar décrochée. Ensuite, plaquez 200 microlitres de l’échantillon sur les plaques d’agar galactose double abandon et couvez les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 à 96 heures ou jusqu’à ce que les colonies apparaissent. Une fois que les colonies sont apparues, patchez-les sur la double agar galactose décrochées et incubez-les pendant encore 24 à 48 heures.

Utilisez une partie de la tache pour inoculer cinq millilitres de bouillon double abandon et incuber l’inoculum pendant la nuit à 26 degrés Celsius avec des secousses à 150 RPM. Le lendemain, ajouter 180 microlitres d’eau stérile à cinq puits d’une plaque de 96 puits en commençant par le puits A2. Vortex le mélange de culture du jour au lendemain. Ajouter 180 microlitres de levure au puits A1 et les diluer en série en utilisant l’eau dans les puits A2 à A6. Placez cinq microlitres de chaque dilution sur le glucose décrocheur unique et les plaques d’agar galactose d’abandon unique en s’assurant d’inclure l’effecteur toxique seul comme contrôle.

Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 heures, puis comparer la croissance de la levure avec effecteur toxique seul à la croissance de la levure avec le suppresseur potentiel. Pour confirmer les suppresseurs qui ont démontré une toxicité diminuée par rapport à l’effecteur toxique seul, isoler le plasmide selon les instructions manuscrites et le transformer en levure toxique. Inoculer le bouillon de glucose double décrochage avec une colonie de la plaque de transformation.

Incubez-le pendant la nuit et repérait sur le glucose double abandon et l’agar de galactose pour confirmer la suppression de la toxicité. Avant d’effectuer l’écran suppresseur de levure, les protéines effectrices d’intérêt ont été testées pour la toxicité dans la levure. La protéine d’intérêt a été exprimée dans la levure sous le contrôle d’un promoteur inductible de galactose et la croissance sur le galactose a été comparée à la croissance sur le glucose.

Lorsque le CT229 a été testé pour la toxicité, de plus petites colonies et la suppression de la croissance ont été observées. Idéalement, une diminution de deux à trois rondins devrait être observée pour procéder à des écrans suppresseurs de levure. L’écran suppresseur a été réalisé en transformant la souche toxique avec la bibliothèque génomique de levure pYAP 13 et en placage des transformateurs sur l’agar galactose.

Les clones suppresseurs obtenus ont été repérés sur une double agar galactose décrochée pour confirmer la suppression de la toxicité. Suppresseurs pSup1 et pSup2 supprimé la toxicité de la protéine effecteur tandis que pSup3 n’a pas. Ces procédures nécessitent une attention particulière aux détails en plus des travaux préparatoires critiques, y compris le fait d’avoir de grandes quantités de supports et de plaques prêts avant d’effectuer l’expérience.

Une fois que les suppresseurs sont identifiés, des expériences peuvent être effectuées pour vérifier les interactions avec l’effecteur d’intérêt, y compris les retraits, la colocalisation de l’immunofluorescence, le KO effecteur ou le renversement des facteurs d’hôte identifiés dans les écrans. Le développement de cette technique pour les effecteurs de chlamydia a permis une caractérisation préliminaire accélérée des protéines effectrices et a aidé à concentrer nos efforts sur l’élucidation des mécanismes moléculaires sous-jacents qui médiation les interactions des pathogènes hôtes.