Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Présenté ici est un protocole pour l’analyse in situ entière d’hybridation d’ARN in situ dans le poisson zèbre et l’essai de formation de tube dans les cellules endothéliales pluripotentes induites par le patient pour étudier le rôle de l’endoglin dans la formation vasculaire.

L’hybridation in situ de l’ensemble de la monture, WISH, offre une haute résolution et un faible résultat de fond par rapport aux méthodes traditionnelles. En outre, les plaques u-slide améliorent la mise au point à la même longueur focale en utilisant moins wish peut être appliqué sur les embryons de souris, embryons de Drosophile et d’autres tissus difficiles à manipuler. L’analyse de formation de tube peut être appliquée aux cellules souches des cellules androgènes différenciées.

WISH permet de comprendre facilement le sens fonctionnel de la correction de la mutation. La personne qui démontrera la procédure est Yong Wang, un assistant de recherche de mon laboratoire. Au microscope, utilisez le système FemtoJet pour injecter deux nanogrammes de Morpholinos et 500 picogrammes de MRNA dans des embryons à cellules unique.

Pratiquez la microinjection de Morpholinos plusieurs fois jusqu’à ce que vous puissiez l’injecter dans les cellules avec succès et garder l’intégrité des œufs. Incuber les zygotes jusqu’à ce qu’ils soient déchorionés et atteindre l’état de développement qui correspond à l’expérience prévue. Tel que décrit dans le tableau un du manuscrit.

Ensuite, utilisez une pipette en plastique pour transférer de 20 à 40 embryons dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de solution 4% PFA fraîchement préparée à température ambiante. Après avoir fixé, lavé et déshydraté les embryons tels que décrits dans le manuscrit, placez les embryons dans un tamis avec maille en nylon au fond.

Hydrater les embryons en les lavant séquentiellement à 75%50% et 25% de méthanol pendant cinq minutes chacun. Après avoir lavé les embryons avec PBST, ajouter 50 microlitres de proteinase K dans le tube avec les embryons. Après la digestion, retirer la proteinase K et laver les embryons avec PBST trois fois pendant cinq minutes à chaque fois.

Ajouter 50 à 100 microlitres de sondes cibles mixtes dans chaque tube avec les embryons. Incuber les embryons pendant la nuit à 40 degrés Celsius. Après avoir lavé les embryons comme décrit dans le manuscrit, utilisez 4% de paraformaldéhyde pour fixer les embryons pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez les embryons en solution 2x SSCT trois fois pendant 15 minutes à chaque fois à température ambiante. Retirez la solution SSCT et remplacez-la par 50 microlitres d’Amp 1. Puis incuber les embryons à 40 degrés Celsius.

Après 30 minutes, laver les embryons en solution 2x SSCT trois fois pendant 15 minutes à chaque fois à température ambiante. Retirez la solution SSCT et ajoutez 50 microlitres d’Amp 2. Après avoir couvé pendant 15 minutes et lavé l’embryon comme cela a été fait précédemment, ajouter 50 microlitres d’Amp 3 et appuyez doucement sur le tube.

Incuber les embryons à 40 degrés Celsius. Après 30 minutes laver les embryons comme décrit précédemment. Ajouter ensuite 50 microlitres d’Amp 4 dans le sens de la goutte et appuyez soigneusement sur le tube.

Puis incuber les embryons à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes et les laver trois fois avec SSCT. Après avoir préparé les embryons à l’imagerie tel que décrit dans le manuscrit, utilisez une trousse de substrat de peroxydée DAB pour tacher l’échantillon. Ajouter 50 microlitres chacun des reagents de couleur A, B et C à un millilitre d’eau distillée.

Et bien mélanger pour obtenir un fluide de travail DAB complet. Ajouter le liquide à l’échantillon et couvrir pendant dix minutes. Après avoir soigneusement lavé les spécimens, utilisez un microscope optique pour les imager.

Pour commencer la culture et le contrôle des iPSCs HHT, ajoutez la matrice membranaire du sous-sol à six plaques de culture cellulaire de puits pour couvrir le fond des puits. Incuber les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirez la solution de matrice membranaire du sous-sol utilisée des puits et ajoutez deux millilitres de mTeSR 1 milieu dans chaque puits.

Ensuite, plaque les iPSCs récoltés à partir du dernier passage à environ une fois dix pour les six cellules par puits. Après avoir cultivé les iPSCs pendant environ quatre jours, échangez le milieu de culture cellulaire avec le milieu bel complété. Faire croître les cellules pendant trois jours pour générer des cellules mésodérm.

Pour développer les cellules endothéliales vasculaires, remplacer le milieu par un milieu BEL complété pendant quatre jours. Et ensuite traiter les cellules avec le même milieu et la culture pendant encore trois à quatre jours. Purifier les cellules endothéliales vasculaires matures à l’aide de Dynabeads CD31 selon les instructions du kit.

Puis collecter les cellules CD31 positives par tampon d’élitution. Maintenir et étendre les cellules endothéliales purifiées dans le milieu EC-SFM contenant VEGF165, bFGF et FBS. Pour plaquer les cellules endothéliales, commencez par ajouter 10 microlitres de matrice membranaire sous-sol par puits aux plaques d’angiogenèse.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Récoltez les cellules endothéliales et résuspendez-les dans le milieu de croissance endothélial 2 en pipetting à plusieurs reprises. Ajouter 50 microlitres de cette suspension cellulaire à la matrice solidifiée dans chaque puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius.

Après trois à cinq heures d’incubation, utilisez un microscope à haute résolution pour évaluer la formation de tubes endothéliales. Capturez des images d’au moins dix zones pour chaque groupe. Inspecter la longueur globale du tube, le numéro de tube et les points de branche.

CISH et WISH ont été exécutés pour déterminer l’expression de l’endogline dans les embryons post-fertilisation 24 heures. Un marqueur endothélial hémogenic et un marqueur endothélial d’ancêtre ont été utilisés pour examiner l’effet du silencing d’endoglin. Les flèches rouges indiquent les régions où l’expression de ces marqueurs, aplnrna et npr1a, a considérablement diminué.

L’essai endothélial de formation de tube a été exécuté sur le mutant d’endoglin et les cellules endothéliales iPSC-dérivées de contrôle. La formation de tube a été évaluée et photographiée après trois heures. La longueur du tube, le numéro de tube et la ramification ont été quantifiés à l’aide du logiciel ImageJ.

Les cellules endothéliales mutantes formaient moins de branches que les cellules endothéliales de contrôle. Et les branches dans les cellules endothéliales mutantes ont augmenté de manière significative après stimulation avec le facteur vasculaire de croissance endothéliale. Cette méthode peut également être utilisée pour la génération iPS à partir de sang périphérique.

Et par la méthode clarifie le rôle de l’endocrinien dans la formation vasculaire in vitro et in vivo. Sachant que la correction de la mutation peut faire une différence dans l’angiogenèse, il est possible de transplanter les cellules de nouveau dans les patients pour la thérapie potentielle de cellules souches.