Name: Quantification des cellules proliférantes et mortes chez les entéroïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Apprenez à quantifier les cellules proliférantes et mortes dans les entéroïdes murins par cytométrie en flux. Cette méthode permet d'évaluer les effets des médicaments et des cytokines sur les cellules épithéliales intestinales.

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Ce travail est soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326, et 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Université de Nanjing (KF-GN-202004). La Fondation des sciences naturelles des Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), le Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030) et le Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Ce travail est également soutenu par Tang Scholar de l'Université de Soochow.

Ce protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux du Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) de l'Université Soochow.
1. Isolation et culture organoïdes intestinaux
<ol><li>Isolement des cryptes intestinales et de la culture entéroïde<ol>
<li>Euthanasiez une souris sauvage de 8 semaines avec inhalation de CO2. Utilisez des forceps tissulaires et des ciseaux fins à l'iris pour disséquer environ 8 cm d'ilém.</li>
		<li>Rincer à l'aide d'une seringue avec une aiguille d'alimentation gavage avec environ 40 ml de salin tamponné par le phosphate (DPBS) de Dulbecco, puis couper dans le sens de la longueur avec des ciseaux et ouvrir l'ilum.</li>
		<li>Couper l'ilédès en petits morceaux (0,5 à 1,0 cm). Placer les morceaux dans 5 ml de DPBS stérile glacé dans un tube conique de 15 ml, puis se balancer pendant 5 min sur glace.</li>
		<li>Utilisez un contrôleur de pipette pour aspirer le DPBS et le remplacer par 10 ml de tampon froid 1 (2 mM EDTA en DPBS). Roche pendant 30 min sur glace.</li>
		<li>Utilisez le contrôleur de pipette pour aspirer le tampon 1 et remplacer par 10 ml de tampon froid 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de saccharose en DPBS). Agiter pendant 2 à 3 min à la main (80 secousses/min).</li>
		<li>Prendre une gouttelette de 20 llet de 2 contenus tampon après avoir tremblé et inspecter sous un microscope.</li>
		<li>Filtrer le contenu tampon 2 avec une passoire à cellules stériles de 70 m, puis recueillir le tampon filtré avec un tube conique de 50 ml.</li>
		<li>Pipette 20 l de filtrate sur la diapositive pour compter les cryptes. Transférer un volume suffisant de tampon 2 à partir de l'étape 1.1.7 pour s'assurer qu'il y a 500 cryptes/puits.</li>
		<li>Faire tourner à 150 x g pendant 10 min à 4 oC. Une fois la filature terminée, aspirez soigneusement le supernatant.</li>
		<li>Suspendre les cryptes dans 50 L de matrice membranaire du sous-sol (p. ex. Matrigel) par 500 cryptes, pipette de haut en bas (en prenant soin d'éviter les bulles), puis placez une gouttelette de 50 llet de matrice de membrane de sous-sol / mélange de crypte au centre d'un puits dans une plaque de 24 puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC pour polymériser la matrice membranaire du sous-sol.</li>
		<li>Après 30 min de polymérisation, ajoutez soigneusement 600 l de minigut media (advanced Dulbecco's modified Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamine, pen/strep [100 unités/mL], 10 mM Hepes, supplément N2 [1:100], supplément B27 [1:50] avec facteur de croissance épidermique [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], et Y27632 [10 M]) à chaque puits, puis retournent la plaque à l'incubateur 37 oC. Observez au microscope chaque jour et changez les médias tous les deux à trois jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passaging Enteroid REMARQUE : Pour les cultures longues, les entéroïdes doivent être divisés environ chaque semaine.<ol>
<li>Pour passer les entéroïdes, placez la plaque de culture tissulaire sur la glace. Aspirez les médias et ajoutez 1 ml de DPBS froid à chaque puits. Utilisez une pointe P1000 pour faire monter et descendre jusqu'à ce qu'il ne reste plus de morceaux solides de matrice de membrane de sous-sol.</li>
		<li>Passer de haut en bas une fois à travers une seringue à insuline de 1 ml (27 G) et dans un tube conique de 15 ml. Faire tourner vers le bas pendant 5 min à 150 x g à 4 oC.</li>
		<li>Utilisez pipette pour supprimer DPBS. Resuspendre dans 50 L de matrice/puits de membrane de sous-sol.</li>
		<li>Placer la plaque dans un incubateur de 37 oC pendant 30 min pour permettre à la matrice de membrane du sous-sol de polymériser. Regroupez chaque puits de 600 oL de supports ENR (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), puis retournez la plaque à l'incubateur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Analyse de cytométrie de flux des cellules EdU-positives dans les entéroïdes
REMARQUE : La figure 1 montre le flux de travail pour l'analyse de cytométrie de flux des cellules EdU-positives dans les entéroïdes.
<ol><li>Incubation d'entéroïdes avec EdU<ol>
<li>Cultivez les entéroïdes à partir de l'étape 1.2.4 pendant 5 à 7 jours. Passage enteroids dans une nouvelle plaque de 24 puits dans un rapport de fractionnement de 1:2. Ajouter 600 l de milieu ENR à chaque puits. Incuber les entéroïdes pendant 4 à 5 jours dans un incubateur de 37 oC.</li>
		<li>Définir le groupe témoin (entéroïdes non traités) et le groupe expérimental (entéroïdes traités avec 5 ng/mL d'interleukine 22 [IL-22]). Préparer au moins trois répliques pour chaque groupe.</li>
		<li>Ajouter de l'EdU au support ENR pour préparer le milieu EdU avec une concentration de 50 M. Ajouter 600 oL de milieu EdU à chaque puits et incuber pendant 2 h dans un incubateur de 37 oC. Définir un puits d'entéroïdes sans traitement EdU comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond.</li>
	</ol></li>
	<li>Récolte des entéroïdes de la matrice de membrane de sous-sol<ol>
<li>Utilisez un contrôleur de pipette pour aspirer le milieu EdU et laver 1x avec DPBS. Ajouter 1 ml de DPBS.</li>
		<li>Utilisez la pointe de pipette P1000 et la pipette de haut en bas jusqu'à ce qu'il ne reste plus aucun morceau solide de matrice de membrane de sous-sol. Transférer dans un tube de 15 ml et faire tourner à 300 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant.</li>
		<li>Ajouter 500 l d'enzymes de dissociation cellulaire(tableau des matériaux)et incuber pendant 15 min à 37 oC. Utilisez la pointe de pipette P200 et la pipette de haut en bas pour décomposer les entéroïdes en cellules simples.</li>
		<li>Ajouter 3 mL de milieu DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et une pipette répétée avec une pointe de pipette P1000.</li>
		<li>Faites tourner à 300 x g pendant 5 min et aspirez le milieu supernatant. Resuspendre les cellules avec 1 ml de DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixation et perméabilisation des cellules<ol>
<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml, faire tourner à 300 x g pendant 5 min, et jeter le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules avec 1 ml de paraformaldéhyde de 4 % (PFA), fixer pendant 15 min à température ambiante (RT) et descendre à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant avec une pointe de pipette, lavez 1x avec DPBS, et faites tourner vers le bas pour enlever le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules avec 1 ml de 0,5% de surfactant nonionique. Incuber pendant 10 min à RT.</li>
		<li>Faites tourner à 300 x g pendant 5 min et aspirez le supernatant. Laver 1x avec DPBS et tourner vers le bas pour enlever le supernatant.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection de l'EdU<ol>
<li>Préparer des solutions de stock pour chaque composant à l'avance: 1) solution de travail de l'azide Alexa Fluor, 2) solution de travail de 1x tampon de réaction EdU, et 3) 10x solution de stock de l'additif tampon EdU.</li>
		<li>Préparer 1x Additif tampon EdU en diluant la solution 10x 1:10 dans de l'eau déionisée. Préparer cette solution fraîche.</li>
		<li>Préparer le cocktail de réaction selon le tableau 1. REMARQUE : Ajouter les ingrédients dans l'ordre indiqué dans le tableau. Utilisez le cocktail de réaction dans les 15 minutes suivant la préparation.</li>
		<li>Ajouter 100 l de cocktails de réaction à chaque tube de 1,5 ml. Resuspendre les cellules, protéger de la lumière, incuber pendant 30 min à RT.</li>
		<li>Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min et aspirelaz doucement la solution de réaction avec une pointe de pipette.</li>
		<li>Ajouter 0,5% de pénétrant nonionic surfactant à chaque tube pour laver 1x à RT. Centrifuge à 300 x g pendant 5 min, aspirer le supernatant avec la pointe de pipette doucement, et resuspendre les cellules dans 1 ml de DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des cellules par cytométrie de flux<ol>
<li>Filtrer les cellules suspendues à l'air d'une passoire de 40 m, puis recueillir les cellules filtrées avec un tube conique de 15 ml. Effectuer la détection FACS sur machine dès que possible. REMARQUE : Si les conditions sont limitées, les échantillons tachés de cellules doivent être stockés dans l'obscurité à 4 oC et testés dans les 3 jours.</li>
		<li>Sélectionnez le canal approprié (selon le type d'azide Alexa Fluor dans le kit EdU; ici, canal rouge) et la tension (ici, 150 à 350 V) pour l'analyse de cytométrie de flux.</li>
		<li>Stratégie de gating<ol>
<li>Dessinez une parcelle pseudo-couleur FSC-A (x-axe) vs SSC-A (y-axe) et distribuez la plupart des cellules à la plage visible de la carte à points en ajustant la tension. Sélectionnez la population cellulaire (R1) et excluez les débris cellulaires dans le coin inférieur gauche.</li>
			<li>De la population de cellules R1, établir un FSC-A (x-axe) vs. FSC-H (y-axe) pseudocolor plot, et définir la porte pour sélectionner les cellules uniques (R2) pour exclure les amas cellulaires.</li>
			<li>De la population de cellules R2, établir l'intensité de fluorescence (x-axe) vs. nombre de cellules (y-axe) trace, et utiliser le contrôle négatif pour définir la porte. La région du signal fluorescent est une région cellulaire positive (R3). Comparez le rapport des cellules EdU-positives (R3) entre les groupes expérimentaux et témoins.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse de cytométrie de flux des cellules PI-positives dans les entéroïdes
REMARQUE : La figure 2 montre le flux de travail pour l'analyse de cytométrie de flux des cellules PI-positives dans les entéroïdes.
<ol><li>Incubation de cellules entéroïdes avec PI<ol>
<li>Cultivez les entéroïdes à partir de l'étape 1.2.4 pendant 5 à 7 jours. Passage enteroids dans une nouvelle plaque de 24 puits dans un rapport de fractionnement de 1:2. Ajouter 600 l de milieu ENR à chaque puits. Incuber les entéroïdes pendant 4 à 5 jours dans un incubateur de 37 oC.</li>
		<li>Définir le groupe témoin (non traité) et le groupe expérimental (traité IL-22), en utilisant au moins trois répliques pour chaque groupe.</li>
		<li>Ajouter PI au milieu ENR pour préparer le milieu PI avec une concentration de 3 M.</li>
		<li>Ajouter 600 ll de PI moyen à chaque puits et couver pendant 30 min dans un incubateur de 37 oC. Définir un puits d'entéroïdes sans traitement IP comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Récolte des entéroïdes à partir de la matrice membranaire du sous-sol suivant les étapes 2.2.1-2.2.5.</li>
	<li>Analyse des cellules par cytométrie de flux<ol>
<li>Filtrer les cellules suspendues à l'intérieur d'une passoire de 40 m et recueillir les cellules filtrées à l'abri d'un tube conique de 15 ml.</li>
		<li>Effectuer la détection FACS sur machine dès que possible. REMARQUE : Si les conditions sont limitées, les échantillons tachés de cellules doivent être stockés dans l'obscurité à 4 oC et testés dans les 3 jours.</li>
		<li>Sélectionnez le canal approprié (ici, canal rouge) et la tension (ici, 150 à 350 V) pour l'analyse de cytométrie du débit.</li>
		<li>Utilisez la même stratégie de gating que décrite à la section 2.5.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole détaille les étapes nécessaires à la culture des entéroïdes in vitro et à la quantification des cellules EdU et PI-positives dans les entéroïdes par cytométrie de flux. Cette stratégie présente plusieurs avantages. Tout d'abord, l'étiquetage EdU est utilisé pour détecter les cellules proliférantes dans les entéroïdes. Par rapport à l'analyse BrdU traditionnelle, la méthode d'étiquetage EdU est plus rapide, plus sensible et plus précise. L'EdU est très similaire à la thymine (T), qui remplace la thymine dans ...

Une fonction fondamentale des cellules épithéliales intestinales est de protéger l'entrée de contenus luminaltels tels que les bactéries pathogènes et les toxines1,2. Pour remplir une telle fonction, les cellules souches intestinales prolifèrent et se différencient continuellement en une variété de cellules épithéliales, y compris les entéroocytes et les cellules sécrétrices, qui forment une barrière en formant des connexions serrées3. Le renouvellement rapide des cellules épithéliales intestinales exige la coordination stricte de la prolifération cellulaire, de la différenciation cellulaire, et de la mort cellulaire4,5. La prolifération cellulaire réduite ou la mort cellulaire excessive entraîne des dommages épithéliales et une fonction de barrière compromise1,6. La dysfonction de la barrière intestinale a été associée aux maladies inflammatoires d'entrailles7,8.
Une méthode de culture des cryptes intestinales a déjà été développée. En utilisant cette technique, les cryptes de souris isolées se développent en organoïdes intestinaux (entéroïdes), qui ont des crypte-villus comme des structures et contiennent toutes les lignées épithéliales intestinales9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) est un analogue thymidine qui est capable de remplacer la thymine (T) dans l'ADN qui subit une réplication pendant la prolifération cellulaire. Les cellules proliférantes peuvent être rapidement et avec précision étiquetées par la coloration EdU. Propidium iodide (PI) est un analogue du bromure d'éthidium qui libère la fluorescence rouge lors de l'insertion dans l'ADN à double brin. PI détecte spécifiquement les cellules mortes, car il ne passe à travers la membrane cellulaire endommagée.
Dans ce protocole, nous décrivons d'abord comment isoler des cryptes de l'intestin grêle murine puis les culture comme entéroïdes in vitro. Nous décrivons ensuite comment analyser les cellules proliquaires et mortes dans les entéroïdes par l'incorporation et la cytométrie d'écoulement d'EdU et d'IP.

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 G Aiguille à gavage</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 mm Filtre à cellules stériles</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 mm Filtre à cellules stériles</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td></td><td></td><td>2 mM EDTA dans DPBS</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td></td><td></td><td>54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de saccharose chez les</td></tr><tr><td>souris</td> <td>DPBS C57/B6Institut de recherche biomédicale de Nanjing de l’Université</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>Enzymes de dissociation cellulaire (TrypLE)</td><td>Life technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit d’imagerie</td><td>Life technologies</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-sorbitol</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>Média</td><td></td><td></td> ENR <td>Média Minigut, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris fin</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Life technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut média</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 unités/ml), 10 mM Hepes, supplément N2 (1:100), supplément B27 (1:50)</td></tr><tr><td>Supplément N2</td><td>R& D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>Tensioactif non ionique (Triton X)</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux opératoires (12,5 cm)</td><td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>EGF recombinant</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Cornege de souris recombinante</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus</td><td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification des cellules proliférantes et mortes chez les entéroïdes

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

L'épithélium intestinal agit comme une barrière qui empêche le contenu luminal, comme le microbiote pathogène et les toxines, d'entrer dans le reste du corps. La fonction de barrière épithéliale exige l'intégrité des cellules épithéliales intestinales. Tandis que la prolifération épithéliale de cellules maintient une couche continue de cellules qui forme une barrière, les dommages épithélial mènent au dysfonctionnement de barrière. En conséquence, le contenu luminal peut traverser la barrière intestinale par une voie sans restriction. La dysfonction de la barrière intestinale a été associée à de nombreuses maladies intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l'intestin. Les cryptes intestinales isolées de souris peuvent être cultivées et maintenues comme structures crypt-villus-like, qui sont appelées organoïdes intestinaux ou « entéroïdes ». Les entéroïdes sont idéaux pour étudier la prolifération et la mort cellulaire des cellules épithéliales intestinales in vitro. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour quantifier le nombre de cellules prolifératives et mortes dans les entéroïdes cultivés. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) et propidium iodide sont utilisés pour étiqueter la prolifération et les cellules mortes dans les entéroïdes, et la proportion de cellules proliférantes et mortes sont ensuite analysées par cytométrie de flux. Il s'agit d'un outil utile pour tester les effets du traitement médicamenteux sur la prolifération épithéliale intestinale et la survie cellulaire.

Les petites cryptes intestinales ont été isolées et cultivées comme entéroïdes dans la matrice de membrane de sous-sol. Les entéroïdes ont commencé à former des bourgeons 2 jours après l'isolement. Le jour 6, les entéroïdes avaient beaucoup de bourgeons avec beaucoup de débris (cellules mortes) dans le lumen. Les entéroïdes étaient prêts à être adoptés à ce stade (figure 3).
De nombreuses études ont montré que les cytokines inflammatoires sont essentielles pour le...

Le protocole présenté utilise la cytométrie de flux pour quantifier le nombre de cellules proliférantes et mortes dans les entéroïdes de souris cultivés. Cette méthode est utile pour évaluer les effets du traitement médicamenteux sur la prolifération et la survie des organoïdes.

Quantification des cellules proliférantes et mortes chez les entéroïdes

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Ce protocole est utile pour l’isolement enteroid dans une culture en plus d’étudier la prolifération cellulaire et la survie chez les enteroids. Les scientifiques peuvent appliquer cette technique à la culture des entéroïdes et étudier l’effet des médicaments et des cytokines inflammatoires sur les cellules épithéliales intestinales in vitro. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie d’eau de la maladie intestinale inflammatoire.Nous appliquons cette méthode pour trouver quelques cytokines thérapeutiques. Cette méthode fournit un aperçu de la prolifération épithéliale intestinale et de la survie; en outre, il peut également être utilisé dans les organoïdes, cultivés autour de tissus autres que l’intestin. Pour isoler les cryptes intestinales et effectuer la culture entéroïde, utilisez des forceps tissulaires et trouvez des ciseaux d’iris pour disséquer environ huit centimètres d’iléum d’une souris de type sauvage euthanasié vieille de huit semaines.Utilisez une seringue avec une aiguille d’alimentation gavage pour rincer l’iléum avec environ 40 millilitres de glace froide Dulbecco Phosphate-Tamponné Saline, puis couper dans le sens de la longueur avec des ciseaux et ouvrir l’iléum. Couper l’iléum en petits morceaux et les placer en cinq millilitres de DPBS stérile glacé dans un tube conique de 15 millilitres. Puis faire basculer l’échantillon pendant cinq minutes sur la glace.Utilisez un contrôleur pipette pour aspirer le DPBS et le remplacer par 10 millilitres de tampon froid. Après avoir basculé pendant 30 minutes sur la glace, utilisez le contrôleur pipette pour aspirer le tampon un et remplacer par 10 millilitres de tampon froid deux. Puis agiter de deux à trois minutes à la main à environ 80 secousses par minute.Après avoir secoué, inspecter une gouttelette de vingt micro litres de tampon deux contenus sous un microscope pour s’assurer qu’il ya des cryptes avec des cellules granulaires Paneth. Filtrez le tampon de deux contenus à l’aide d’une passoire cellulaire stérile de 70 microns et recueillez le tampon filtré dans un tube conique de 50 millilitres. Pipette 20 microlitres de filtrate sur la diapositive pour compter les cryptes.Transférez un volume suffisant du tampon filtré deux contenus pour s’assurer qu’il y a environ 500 cryptes par puits. Tournez vers le bas à 150 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirez soigneusement le supernatant. Resuspendez les cryptes en 50 microlitres de matrice membranaire sous-sol par 500 cryptes.Pipette de haut en bas en prenant soin d’éviter les bulles. Placez une gouttelette de 50 microlitres de matrice membranaire du sous-sol et un mélange de crypte au centre d’un puits d’une plaque de puits de 24 puits. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour polymériser la matrice membranaire du sous-sol.Après 30 minutes de polymérisation, ajouter soigneusement 600 microlitres de miniguts à chaque puits. Retournez la plaque à l’incubateur de 37 degrés Celsius et observez au microscope chaque jour, en changeant les médias tous les deux à trois jours. Pour passer les entéroïdes, placez la plaque de culture tissulaire sur la glace, aspirez le média et ajoutez un millilitre de DPBS froid à chaque puits.Utilisez une pointe P1000 pour pipette de haut en bas jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux matriciels. Passez l’échantillon à travers une seringue d’insuline d’un millilitre et vers le bas dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir tourné vers le bas pendant cinq minutes à 150 fois G et quatre degrés Celsius, utilisez une pipette pour enlever le DPBS.Suspendre à nouveau les entéroïdes dans 50 microlitres de matrice membranaire du sous-sol par puits. Placez la plaque dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre à la matrice membranaire du sous-sol de polymériser. Ensuite, superposez chaque puits avec 600 microlitres de supports ENR et retournez la plaque à l’incubateur.Cultivez des entéroïdes pendant cinq à sept jours avant de les passer dans une nouvelle plaque de puits 24 en utilisant un rapport de fractionnement de un à deux. Ajouter 600 microlitres de milieu ENR à chaque puits, puis incuber les entéroïdes pendant quatre à cinq jours dans l’incubateur de 37 degrés Celsius. Mettre en place le groupe témoin des entéroïdes non traités et le groupe expérimental d’entéroïdes traités avec cinq nanogrammes par millilitre d’interleukine-22.Préparez au moins trois répliques pour chaque groupe. Ajouter 600 microlitres de milieu EdU à chaque puits d’entéroïdes, sauf un puits à utiliser comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond. Incuber la plaque pendant deux heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius.Pour récolter les entéroïdes de la matrice membranaire du sous-sol, utilisez un contrôleur pipette pour aspirer edu moyen et laver une fois avec DPBS. Ajouter ensuite un millilitre de DPBS. Utilisez une pointe de pipette P1000 pour pipette de haut en bas jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux solides de matrice membranaire du sous-sol.Transférer l’échantillon dans un tube de 15 millilitres et faire tourner à 300 fois G pendant cinq minutes avant de jeter le supernatant. Ajouter 500 microlitres d’enzymes de dissociation cellulaire et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez une pointe de pipette P200 pour pipette de haut en bas et briser les entéroïdes en cellules individuelles.Ensuite, ajoutez trois millilitres de dulbecco’s Modified Eagle Medium contenant 10% de sérum bovin fœtal, et pipette à plusieurs reprises avec une pointe de pipette P1000. Après avoir centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, et aspirant le supernatant, nous suspendons les cellules en un millilitre de DPBS. Pour effectuer la fixation et la perméabilisation des cellules, transférez d’abord la suspension cellulaire à un tube d’un point de cinq millilitres, tournez vers le bas à 300 fois G pendant cinq minutes, et jetez le supernatant.Nous suspendons les cellules en un millilitre de 4% de paraformaldéhyde et fixons pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, aspirer le supernatant avec une pointe de pipette. Lavez les cellules une fois avec le DPBS, et tournez vers le bas à nouveau pour enlever le surnatant.Resuspendez les cellules avec un millilitre de 0,5% de surfactant non ionique, et incubez pendant 10 minutes à température ambiante avant de laver les cellules avec du DPBS comme avant. Pour détecter l’EdU, ajouter 100 microlitres de cocktail de réaction à chaque tube de 1,5 millilitre. Resuspendez les cellules et protégez-les de la lumière, incubez pendant 30 minutes à température ambiante.Après avoir centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, aspirez doucement la solution de réaction avec une pointe pipette Ajouter 0,5% de penetrant surfactant non ionique à chaque tube pour le laver une fois à température ambiante. Après centrifugation comme avant, nous suspendons les cellules en un millilitre de DPBS. Filtrer les cellules résuspendues à l’aide d’une passoire de 40 microns et recueillir les cellules filtrées dans un tube conique de 15 millilitres.Effectuez des faits sur la détection de la machine dès que possible. Sélectionnez le canal et la tension appropriés pour l’analyse de cytométrie de débit. Pour la stratégie de gating, dessinez une parcelle pseudocolor FSC-A versus SSC-A et distribuez la plupart des cellules à la plage visible de la carte des points en ajustant la tension.Sélectionnez la population cellulaire comme R1 et excluez les débris cellulaires dans le coin inférieur gauche. De la population de cellules R1, établir une parcelle pseudocolor FSC-A versus FSC-H. Réglez la porte pour sélectionner les cellules individuelles désignées comme R2 et exclure les touffes cellulaires.À partir de la population de cellules R2, établir l’intensité de fluorescence par rapport à la parcelle de nombre cellulaire et utiliser le contrôle négatif pour définir la porte. La région du signal fluorescent est une région cellulaire positive désignée R3.Comparez le rapport de ces cellules positives EdU entre les groupes expérimentaux et de contrôle. De petites cryptes intestinales ont été isolées et cultivés sous forme d’entéroïdes dans la matrice membranaire du sous-sol.Les entéroïdes ont commencé à former des bourgeons deux jours après l’isolement. Le sixième jour, les entéroïdes avaient beaucoup de bourgeons avec beaucoup de débris dans le lumen. Les entéroïdes étaient prêts à passer à ce stade.Les entéroïdes ont été traités avec IL-22 pendant 3 jours, après quoi l’ADN synthétique a été étiqueté avec EdU en rouge pour indiquer la prolifération cellulaire. Il-22 enteroids traités ont montré un nombre accru de cellules positives d’EdU. Il-22 a augmenté les cellules proliférantes de 40,1% à 83,5%, telles qu’analysées par cytométrie de flux.Le traitement d’IL-22 a également augmenté la mort cellulaire dans les enteroids indiquée par la coloration d’iodure de propidium dans le rouge. Il-22 a augmenté les cellules mortes de 4,9% à 16,2%, telles qu’analysées par cytométrie de flux. Au cours de la crypte de progrès d’isolement juste secousse est nécessaire après avoir ajouté tampon pour s’assurer que suffisamment de cryptes sont secoués vers le bas.Nous vous conseillons d’inspecter le contenu au microscope. Après cette procédure, nous pouvons également quantifier les types d’épithéliales différenciées et les entéroïdes en utilisant spécifiquement Cette méthode aidera les chercheurs à étudier la différenciation épithéliale intestinale chez les entéroïdes. Après son développement, cette question ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la gastroentérologie pour explorer les questions développementales ou pathologiques dans la coupe.

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