Intégration des approches bioinformatiques et des validations expérimentales pour comprendre le rôle de la signalisation de l'entaille dans le cancer de l'ovaire

La bioinformatique est un moyen utile d’extraire des informations à partir d’ensembles de données. L’expérimentation est tout aussi importante pour la validation. Nous combinons les deux approches pour étudier le rôle de la signalisation cran dans le cancer de l’ovaire.

Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent utiliser l’information des bases de données bioinformatiques pour planifier leur orientation de recherche avant de mener une expérience. Avec les données bioinformatiques accumulées sur les maladies humaines, les scientifiques ne sont plus les yeux bandés. L’expérimentation peut être effectuée pour valider des résultats spécifiques, ce qui peut conduire à des thérapies améliorées ou le diagnostic de maladies.

Pour une analyse méta-A de l’association d’un gène d’intérêt avec un type spécifique de cancer, créez un compte avec une adresse e-mail affiliée à des universitaires pour accéder à la base de données PRECOG et entrez l’adresse e-mail et le mot de passe associés au compte dans le terminal de connexion. Cliquez sur Afficher les détails et saisir le gène d’intérêt dans la barre de recherche. Ensuite, utilisez la barre de défilement pour obtenir le score Z de survie pour le type spécifique de cancer d’intérêt.

Pour étudier l’association entre les niveaux d’expression génétique et les stades du cancer de l’ovaire, accédez à la page Web du CSIOVDB et entrez le nom du gène d’intérêt dans la barre de recherche. Cliquez ensuite sur l’onglet Survie. Pour évaluer les données d’expression génétique dans divers tissus, normaux et tumoraux, accédez au portail GENT et cliquez sur l’onglet Recherche.

Dans la section mots clés, sélectionnez le symbole génétique pour les termes du menu dropdown, entrez le symbole du gène d’intérêt et sélectionnez Tissu pour l’option type. Cliquez sur le bouton Recherche. Des graphiques sommaires de l’expression des gènes dans les tissus normaux et tumoraux de différents types de cancer, basés sur les plateformes U133A et U122 Plus 2, seront affichés.

Cliquez ensuite sur le lien Téléchargement de données de résultat pour accéder aux informations détaillées sur les valeurs d’expression génétique, les types de tissus et les sources de données. Pour rechercher des altérations génétiques et des réseaux de signalisation, ouvrez la page Web du portail CBIO et utilisez la requête sur la page de destination, cliquez sur les organes ou les tissus d’intérêt dans la section Études sélectionnées, sélectionnez l’étude particulière d’intérêt et cliquez sur Requête par gène. Dans la section Sélectionner les profils génomiques, sélectionnez les mutations, les modifications putatives du numéro de copie du GISTIC ou l’option d’expression de l’ARNm.

Sélectionnez les données correspondantes du menu Sélectionner le patient/jeu de cas et entrez les symboles du gène cible dans la boîte de requêtes de Enter Genes. Cliquez sur le bouton Soumettre la requête et ouvrez l’onglet Réseau pour récupérer le réseau génétique désiré. Cliquez ensuite sur l’onglet Fichier et sélectionnez Enregistrer comme image PNG pour télécharger des images réseau.

Pour créer des mouches avec NICD ou NICD et mam surexpression, préparer les stocks de mouches appropriés, et appliquer la technique temporelle et régionale de ciblage de l’expression génétique pour contrôler l’expression du gène spatiotemporal, selon les protocoles standard. Augmenter les mouches à 18 degrés Celsius jusqu’à l’âge adulte, avant de passer à 29 degrés Celsius avec de la levure pendant 48 heures. À la fin de l’incubation de 29 degrés Celsius, ajouter trois millilitres de PBS à un plat de collecte d’embryons et anesthésier la culture de la mouche avec un tampon de dioxyde de carbone.

Utilisez un microscope disséquant pour identifier une mouche femelle anesthésiée et utilisez une paire de forceps disséquants pour saisir soigneusement le thorax inférieur de la mouche. Submergez la mouche dans le PBS dans le plat de collecte d’embryons, et utilisez une deuxième paire de forceps pour pincer le bas-ventre, tirant doucement pour libérer les organes internes. Localiser et détacher la paire d’ovaires du corps de la mouche, et briser la gaine musculaire, située à l’extrémité postérieure des ovaires, pour séparer les ovarials.

Placez ensuite les ovaires isolés dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre, contenant 500 microlitres de PBS sur la glace. Lorsque tous les ovaires ont été prélevés, remplacez le PBS par 500 microlitres de formaldéhyde à 4 %, et placez le tube sur un nutator pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, jeter le fixatif et laver les ovaires avec trois rinçages de 15 minutes dans un millilitre de PBT par lavage.

Après le dernier lavage, étiqueter les ovaires de 150 microlitres de 10 microgrammes par millilitre dapi pendant 10-15 minutes sur le nutator. À la fin de l’incubation, laver les ovaires une fois pendant 10 minutes avec un millilitre de PBT, suivi de deux lavages de 10 minutes dans PBS. Après le deuxième lavage, retirer tous les 300 derniers microlitres de PBS, sauf les 300 derniers, et utiliser une pointe de pipette de 200 microlitres pour triterate les ovaires à plusieurs reprises pour libérer les chambres d’oeufs.

Ensuite, sédimentez doucement le tissu ovarien par une rotation rapide dans une microcentrifugeuse, et retirez autant de PBS que possible sans déranger la pastille d’ovaire. À l’aide d’une pointe de pipette de 1000 microlitres, transférez environ trois gouttes de solution de montage au tube, et utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres avec environ 0,33 millimètres coupés de l’extrémité pour transférer l’ensemble des 120 microlitres de solution de montage contenant des ovaires sur une lame de microscope en verre. Placez délicatement un verre à bout de couverture sur la solution de montage et scellez les bords avec du vernis à ongles transparent.

Ensuite, utilisez un microscope confocal à un grossissement 10x avec une ouverture de 0,8 pour acquérir des images des ovaires tachés et montés. En utilisant le portail PRECOG comme démontré, les scores Z de NOTCH2, NOTCH3 et MAML1 dans le cancer de l’ovaire peuvent être obtenus. Les valeurs négatives de Z-score indiquent la survie globale pauvre des patients présentant des niveaux élevés d’expression des trois gènes.

L’utilisation de la base de données CSIOVD pour confirmer ces résultats indique en outre qu’une forte expression de NOTCH2, NOTCH3 et MAML1 est corrélée avec une mauvaise survie globale et sans maladie. D’autres tests de permutation suggèrent que NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont fortement exprimés dans les tissus tumoraux. Sur la base de ces trois gènes de base, un réseau de signalisation peut être créé pour fournir les 50 gènes voisins les plus fréquemment modifiés qui sont également dans la même voie avec les taux de mutation les plus élevés.

D’intérêt, la surexpression du gène NOTCH équivalent à Drosophila, le NICD, seul, n’induit pas de tumeurs à Drosophila. Considérant que la surexpression de NICD et mam ensemble induit des tumeurs chez les mouches des fruits, comme en témoigne la présence de couches épithéliales multiples et les cellules accumulées. D’autres validations d’expérimentation peuvent ouvrir la voie à l’identification de nouvelles cibles potentielles de pharmacothérapie, de biomarqueurs de maladies et de traitements personnalisés.