Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique
December 18th, 2019
Ce protocole décrit la microdissection de capture de laser pour l'isolement du cartilage et de l'os des sections congelées fraîches de l'embryon de souris. Le cartilage et l'os peuvent être rapidement visualisés par la coloration violette de cresyl et rassemblés précisément pour produire l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.
L’hétérogénéité des structures squelettiques est un obstacle à l’étude de l’expression des gènes dans le développement du cartilage et des os. Ce protocole fournit une méthode pour l’isolement précis des tissus adjacents mais différents. Nous optimisons la microdissection de capture laser pour le cartilage et l’os à l’aide de taches violettes cresyl pour visualiser ces tissus pour une collecte précise en maintenant une intégrité élevée de l’ARN pour une analyse ultérieure.
D’autres tissus peuvent être isolés si la violette cresyl fournit une distinction suffisante du tissu cible et que la qualité de l’ARN reste élevée après notre méthode de traitement. Ces tissus comprennent les sutures craniofaciales et le cerveau. Cryosectioning est la compétence la plus exigeante dans ce protocole.
Assurez-vous que le tissu est disséqué et intégré rapidement pour maintenir la plus haute intégrité de l’ARN. Pour commencer cette procédure, disséquer l’embryon ou le tissu d’intérêt. Intégrir l’échantillon dans un moule d’intégration jetable avec un composé optimal de température de coupe, et ajuster l’orientation de l’échantillon avec une pointe ou une aiguille.
Congeler rapidement les échantillons dans un bain de glace sèche et de méthyle-2 butène. Ensuite, préparez un contenant lidded avec de la glace sèche en plaçant une feuille de papier d’aluminium sur la glace sèche pour l’entreposage temporaire des glissières d’échantillon de dissection pendant la cryosection. Transférer le spécimen frais congelé dans le seau de glace sèche.
Placez une couche de composé optimal de température de coupe sur un porte-spécimen cryostat, et placez immédiatement le spécimen sur le dessus du composé optimal de température de coupe avec une pression douce. Lorsque le composé optimal de température de coupe est complètement congelé, attachez le support avec le spécimen dans le bras de coupe cryostat. Laisser l’échantillon dans le cryostat pendant 15 minutes pour l’équilibrer à la température de coupe.
Ensuite, sectionnez le tissu à une épaisseur de 12 micromètres et recueillez les tranches sur les diapositives de la membrane PEN. Aligner les sections consécutives sur la membrane. Une fois la glissade terminée, laissez sécher les sections pendant quelques minutes, puis transférez la glissade sur le papier d’aluminium dans le contenant de glace sèche jusqu’à ce que toutes les glissières requises soient recueillies.
Rangez les glissières à moins 80 degrés Celsius dans une boîte à diapositives. Pour commencer, préparez trois tubes de centrifugeuse de 15 millilitres étiquetés. Ajouter 45 millilitres de 80 % d’éthanol à chaque tube.
Placer trois tubes sur la glace. Placez un tube contenant 45 millilitres d’éthanol à 95 % et un tube contenant 100 % d’éthanol sur la glace. Ensuite, ajoutez 45 millilitres de xylène à un tube centrifugeuse de 50 millilitres à température ambiante.
Décongeler brièvement une membrane PEN en la plaçant contre une main gantée et la laver deux fois pendant 30 secondes dans chacun des tubes contenant 80 % d’éthanol avec agitation pour enlever le composé optimal de température de coupe. Ensuite, mentez la glissière sur une feuille de papier d’aluminium. Pipette 8 millilitres de 1% de violette crésyle et 50% d’éthanol sur la lame et la tache pendant 30 secondes.
Lavez la lame dans le troisième tube contenant 80 % d’éthanol pendant 30 secondes. Déshydratez la glissière en la passant à travers le tube contenant 95% d’éthanol pendant 30 secondes, le tube contenant 100% d’éthanol pendant 30 secondes, et enfin, le tube contenant du xylène pendant 30 secondes. Après cela, placez les glissières sur un essuie-glace délicat pendant cinq minutes pour laisser le xylène s’écouler et laisser sécher les sections.
Tout d’abord, allumez le microscope à microdissection de capture laser, le laser et l’ordinateur. Connectez-vous à l’ordinateur et démarrez le logiciel. Lorsque la lumière verte est allumée, appuyez sur le bouton rouge pour activer le laser.
Lorsque la lumière devient rouge, le laser est prêt à l’emploi. Insérez le bouchon d’un tube PCR de 5 millilitres dans le collecteur. Pipette 50 microlitres de tampon d’extraction dans le bouchon et insérer le dispositif de collecte dans le microscope.
Dans la fenêtre de l’appareil collecteur de modification, cliquez sur le bouton passer au point de référence pour déplacer le collecteur vers le point de référence. Ajustez l’accent pour afficher clairement le point de référence. Ensuite, cliquez sur le bouton de déchargement gauche dans la barre d’outils pour abaisser le support de diapositives.
Placez la glissière dans le support avec la section de tissu orientée vers le bas, et insérez le support de nouveau dans la scène. Cliquez sur continuer dans la fenêtre de l’échantillon de modification. Pour configurer les paramètres laser, sélectionnez l’option de contrôle du menu laser ou cliquez sur l’icône laser.
Ajustez les paramètres suivants comme vous le souhaitez, la puissance, qui est la puissance du laser, l’ouverture, qui est la largeur du laser, et la vitesse, qui est la vitesse de coupe en mode tirage et coupe. Commencez par un objectif 5X pour trouver les domaines d’intérêt, et passez à l’objectif qui montre le mieux le domaine d’intérêt. Choisissez le tube pour la collection en cliquant sur la marque au collecteur, puis choisissez déplacer et couper ou dessiner et couper.
Une fois la coupe terminée, le tissu cible avec membrane PEN tombera dans le capuchon du tube de collecte par gravité. Répétez ce processus de sélection et de coupe pour tirer plusieurs domaines d’intérêt si nécessaire. Après cela, déchargez le collecteur et fermez soigneusement le tube PCR.
Déposer les tissus microdissectés sur la glace sèche. Décongeler brièvement les tissus microdissectés à température ambiante, puis les centrifuger brièvement, et incuber les échantillons à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, faites tourner le tampon de lyse vers le bas dans le tube PCR de 5 millilitres.
Effectuer le traitement de la DNase et l’extraction de l’ARN à l’aide d’une trousse d’isolation de l’ARN, suivant les instructions du fabricant. Dans cette étude, une microdissection optimisée de capture de laser du cartilage et de l’os est exécutée, soulignant l’utilisation de la coloration de violette de cresyl dans une procédure rapide pour visualiser le cartilage et l’os pour la collecte précise de tissu tout en maintenant l’intégrité élevée d’ARN pour l’analyse suivante. L’observation des diapositives montre que tous les cartilages examinés sont des magenta tachés, et tous les tissus minéralisés sont tachés de brun ou de noir.
Le cartilage et l’os sont facilement distingués des autres tissus aux emplacements anatomiques multiples. Le cartilage de Meckel, le cartilage condylar, et les régions mandibulaires d’os sont choisis et isolés par microdissection de capture de laser. Pour obtenir suffisamment d’ARN pour le séquençage, tirez 10 régions du cartilage de Meckel, 10 régions de cartilage condylar, ou quatre régions de l’os mandibulaire dans trois tubes individuels de collecte respectivement.
L’ARN est ensuite extrait, et l’ARN total est analysé à l’aide d’un bioanalyseur. Ce protocole de microdissection de capture laser est utilisé sur divers tissus à différents stades de développement, et les mesures du nombre d’intégrité de l’ARN indiquent une qualité d’ARN élevée. L’analyse différentielle de l’expression des gènes est ensuite effectuée.
Il y a 4006 gènes significativement et différemment exprimés entre l’os mandibulaire et le cartilage de Meckel. Les gènes spécifiques aux ostéoblastes ou aux ostéocytes sont plus fortement exprimés dans l’os mandibulaire tandis que les gènes spécifiques aux chondrocytes sont plus fortement exprimés dans le cartilage de Meckel. En outre, les marqueurs ostéoclastes sont plus fortement exprimés dans l’os mandibulaire, indiquant l’isolement réussi des tissus ciblés.
Après cette procédure, l’analyse de l’expression des gènes, y compris qPCR et ARN-seq, peut être effectuée. Ces méthodes peuvent analyser l’expression génétique du transcriptome dans des tissus ou des régions d’intérêt spécifiques dans les tissus hétérogènes.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode de microdissection par capture laser pour isoler le cartilage et l'os à partir de sections fraîchement congelées d'embryons de souris. En utilisant une coloration au violet de crésyl, les tissus sont visualisés et collectés afin d'assurer un ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Transcriptomique
Contexte
- L'hétérogénéité des structures squelettiques complique les études d'expression génique dans le cartilage et l'os en développement.
- L'isolement précis des tissus adjacents est crucial pour une analyse précise.
- La coloration au violet de crésyl aide à visualiser les tissus pour la collecte.
- Une intégrité élevée de l'ARN est maintenue pour les analyses ultérieures.
Objectif de l'étude
- Optimiser la microdissection par capture laser pour le cartilage et l'os.
- Fournir une méthode fiable pour isoler différents tissus.
- Assurer un ARN de haute qualité pour les études transcriptomiques.
Méthodes utilisées
- Technique de microdissection par capture laser.
- Coloration au violet de crésyl pour la visualisation des tissus.
- Collecte de cartilage et d'os à partir d'embryons de souris.
- Évaluation de la qualité de l'ARN après le traitement.
Résultats principaux
- Isolation réussie du cartilage et de l'os avec une intégrité élevée de l'ARN.
- Potentiel pour isoler d'autres tissus comme les sutures craniofaciales et le cerveau.
- Efficacité démontrée de la coloration au violet de crésyl dans la distinction des tissus.
- Mise en évidence des défis de la cryosection dans le protocole.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour isoler les tissus squelettiques.
- Le maintien de l'intégrité de l'ARN est crucial pour l'analyse transcriptomique.
- D'autres applications peuvent s'étendre à d'autres types de tissus.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection enables precise isolation of heterogeneous skeletal tissues, addressing a key challenge in target validation for developmental biology and skeletal disease research. By maintaining high RNA integrity from microdissected cartilage and bone, the method supports reliable transcriptomic analysis for mechanistic de-risking of therapeutic targets. This capability enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to specific cell populations within developing tissues.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure populations of chondrocytes and osteoblasts for gene expression profiling.
- Operational Value: Reduces biological noise from heterogeneous tissues, improving target specificity and pathway clarification.
- Predictive Value: Supports differential expression analysis between adjacent tissues, aiding in target prioritization and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality RNA from laser-captured tissues suitable for qPCR and RNA-seq, enabling reproducible molecular readouts.
- Operational Value: Standardizes tissue isolation workflow, supporting assay readiness and scalability across developmental stages.
- Translational Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by ensuring RNA integrity and tissue purity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems by isolating developing cartilage and bone at defined embryonic stages (e.g., E16.5).
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation through consistent tissue processing and RNA quality metrics.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target engagement via marker gene expression (e.g., osteoblast, chondrocyte, osteoclast genes).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly for skeletal targets where spatial resolution is critical for accurate gene expression profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating specific cell types (e.g., Meckel’s cartilage vs. mandibular bone) to clarify pathway activity and de-risk targets.
- Screening: Enables assay development through reliable RNA yield and integrity, facilitating compound screening in purified tissue contexts.
- Analytics: Delivers quantitative gene expression outputs (e.g., differential expression of 4,006 genes) that allow cross-condition comparison and target scoring.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing stage-specific embryonic tissues that model human skeletal development and disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating multiple tissues (e.g., cartilage, bone, sutures, brain) when staining provides sufficient contrast.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through spatially resolved transcriptomics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via rapid processing and minimal aqueous exposure to preserve RNA.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clear molecular distinctions between adjacent tissues, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on target expression profiles in purified skeletal compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and laser capture microdissection instrumentation.
- Dependent on cryostat, LCM system, and reagents for staining, dehydration, and RNA extraction.
- Necessitates standardization across teams for tissue orientation, staining timing, and dehydration steps.
- Must account for tissue-specific staining efficacy; cresyl violet may not distinguish all tissue types equally.
- Limited by RNA degradation risk if aqueous exposure is prolonged during processing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:04
Preparation of Fresh Frozen Specimen
1:28
Cryosectioning for Laser Capture Microdissection
2:45
Sample Preparation for LCM
4:14
Laser Capture Microdissection
6:25
Lysis of Microdissected Tissues and RNA Isolation
6:54
Results: Analysis of Laser Capture Microdissected Tissue
8:49
Conclusion
