Name: Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Apprenez la microscopie intravitale des vénules post-capillaires du muscle crémaster chez la souris. Cette technique permet de visualiser les interactions leucocyte-endothélium et d'étudier le recrutement leucocytaire dans les modèles d'inflammation et de sepsis.

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Cette étude a été soutenue par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche (BMBF) 01GL1746E dans le cadre du Consortium PRIMAL. Les auteurs reconnaissent Britta Heckmann et Silvia Pezer pour leur assistance technique habile.

Des animaux ont été logés dans des conditions contrôlées et spécifiques exemptes d’agents pathogènes à l’IBF (Interfakultàre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par la CISR locale et le Regierungspraesidium Karlsruhe, Bade-Wurtemberg, Allemagne.
1. Administration d’anesthésie
<ol><li>Anesthésiez la souris par injection intraperitoneal (c.-à-d.) de 125 mg/kg de kétamine et de 12,5 mg/kg de xylazine.</li>
	<li>Placer et fixer la souris dans une position couchée dorsale sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris (36,5-38 oC). Utilisez une suture stérile non absorbable (6/0) pour enrouler une boucle simple autour des dents frontales et ruban adhésif les extrémités de jointure de la suture à la garniture de chauffage. Cette fixation vise à garder la bouche ouverte afin d’éviter les perturbations de la respiration.</li>
	<li>Vérifiez la souris pour la profondeur appropriée de l’anesthésie par pincement interdigital d’ateil (retrait ne doit pas être vu).</li>
	<li>Une fois qu’une anesthésie suffisante est atteinte procéder à la préparation chirurgicale. Confirmer à plusieurs reprises l’anesthésie le long de l’expérience en cours tous les 30 min. Réutilisez les médicaments décrits ci-dessus si nécessaire.</li>
	<li>Solution de sel physiologique d’équilibre (PSS, composition : 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS04, 2.0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) avec 5% DE CO2/95% N2 pendant 15 minutes. Bulle continue PSS avec 5% de CO2/95% N2 tout au long de l’expérience et de garder à 37 oC.</li>
</ol>2. Préparation chirurgicale de la trachée et de l’artère carotide (facultatif)
<ol><li>Disséquer la peau de la région du cou en tirant doucement la peau avec des pincettes dans la ligne médiane. Utilisez des ciseaux pour appliquer une coupe circulaire de 1 à 2 cm de diamètre pour donner suffisamment d’espace pour la préparation chirurgicale.</li>
	<li>Disséquez soigneusement les tissus musculaires, graisseux et conjonctifs environnants à l’aide de pinces à épiles.</li>
	<li>Faire une coupe transversale (1,3 mm) dans la trachée à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux et introduire un tube de polyéthylène (I.D x O.D. 0.034" x 0.050") à l’intérieur de l’extrémité caudale de la trachée pour sécuriser les voies respiratoires supérieures.</li>
	<li>Fixer le tube situé dans la trachée par une seule suture circulaire de noeud (6/0 USP).</li>
	<li>Localiser l’artère carotide le long du côté droit de la trachée et disséquer le tissu environnant de la paroi de l’artère carotide. Alternativement, la jugulaire ou aussi la veine de queue pourrait être employée pour l’accès d’i.v. Essayez d’éviter les blessures au nerf vagal, car il est situé de près.</li>
	<li>Passer deux morceaux de suture (6/0) sous l’artère carotide. Placez la première suture crânienne proximal, près de la bifurcation des artères carotides et attachez-la définitivement. La deuxième suture sera située à environ 5-8 mm distal de la première et plus tard être utilisé pour sécuriser le tube dans l’artère carotide. Ne l’attachez pas encore.</li>
	<li>Préparer un tube de polyéthylène (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") d’une longueur de 30 cm en pliant la partie de fin à une aiguille de seringue de 1 mL remplie de saline (0,9% NaCl). Le rinçage rigoureux est important pour prévenir l’embolisation de l’air pendant la préparation.</li>
	<li>Utilisez un clip de navire de 7 mm pour serrer l’artère carotide de la deuxième suture.</li>
	<li>Effectuer une petite coupe transversale (0,5 mm) dans l’artère carotide et introduire le tube de polyéthylène stérile. Fixez le tube dans l’artère à l’aide de la deuxième suture préparée auparavant.</li>
	<li>Retirez le clip du navire et appliquez doucement un peu de tension sur la seringue reliée au tube de polyéthylène. Ce cathéter carotide peut maintenant être utilisé pour administrer des médicaments ou prélever des échantillons de sang si nécessaire, même la surveillance de la pression artérielle ou le pouls est possible avec les dispositifs respectifs.</li>
</ol>3. Préparation chirurgicale du muscle de cremaster
<ol><li>Transférer la souris sur le coussin chauffant (avec le coussin chauffant) dans le cadre en plastique sur mesure tenant la scène pour une microscopie ultérieure. Orientez la souris avec son scrotum face à l’étape du microscope.<ol>
<li>Réévaluer la profondeur de l’anesthésie avant de procéder; ré-administrer un quart à la demi-dose d’anesthésie si nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Localiser le scrotum, le tenant à sa partie la plus distale à l’aide de pincettes, tirez-le doucement et coupez une section circulaire de peau scrotale d’environ 5 mm de diamètre. Assurez-vous de ne pas nuire aux structures sous-jacentes telles que le muscle cremaster. Assurez-vous de garder le tissu ouvert bien hydraté avec une solution saline.</li>
	<li>Disséquez le tissu conjonctif lâche à l’aide de deux pincettes et localisez les deux testicules.</li>
	<li>Tenez un testicule distally et commencez doucement à le retirer, en enlevant le tissu conjonctif environnant étape par étape.</li>
	<li>Une fois que le testicule est extériorisé, épinglez son extrémité distale à l’anneau en caoutchouc entourant la scène. Lors de l’extériorisation, hydrater le tissu avec une solution saline pendant tout le processus.</li>
	<li>
Étape critique : Enlevez soigneusement le tissu conjonctif sans nuire au muscle de cremaster sous-jacent. L’excès de tissu conjonctif peut obstruer la vision dans la microscopie ultérieure et peut produire des images floues.</li>
	<li>Épingler la partie la plus détale des testicules vers le bas et ouvrir le muscle de cremaster par une petite coupe transversale (environ 1 mm), suivie d’une incision longitudinale de l’extrémité très distale à l’extrémité proximal. En conséquence, le muscle cremaster devrait s’ouvrir sphériquement. Le vaisseau macroscopiquement visible ne doit pas être coupé, car cela peut avoir un impact sur l’hémodynamique.</li>
	<li>Étendre soigneusement le muscle sur le stade de verre et l’épingler à l’anneau en caoutchouc. Assurez-vous de ne pas toucher ou nuire à la région centrale, car la microscopie sera effectuée ici. Attention : L’excès d’étirement peut obstruer le flux sanguin.</li>
	<li>Épinglez les testicules restants de côté pour donner accès à la région d’intérêt. Assurez-vous d’humidifier avec PSS à plusieurs reprises pour éviter le séchage. Le muscle monté est maintenant prêt pour la microscopie.</li>
</ol>4. Microscopie intravitale
<ol><li>Placez le muscle de cremaster monté dans le microscope droit et effectuez la microscopie à l’aide d’un objectif 40x.</li>
	<li>Acquérir des données et exporter à l’aide d’une spectrographie d’imagerie à haut débit.</li>
	<li>Effectuez des enregistrements sous superfusion continue avec PSS17préchauffé (35-37 oC). Appliquer la superfusion par un petit tube qui a été scotché à l’objectif droit du microscope pour permettre un dégoulinement continu de PSS à côté de l’objectif vers le bas sur le tissu musculaire.</li>
	<li>Identifiez les venusles post-capillaires (confluence de deux petits vaisseaux) et mesurez la microcirculation sur les venusles d’un diamètre de 20-40 m.</li>
	<li>Enregistrez des images haute résolution de la microcirculation du muscle cremaster dans une plage temporelle de 30 s. Comme il peut y avoir une légère contraction et la relaxation du tissu musculaire pendant l’enregistrement, assurez-vous d’ajuster continuellement la mise au point. En général, la souris a tendance à afficher une circulation stable pendant environ 2 heures. Il est possible d’acquérir plusieurs enregistrements de différents navires de différentes régions. Un ou les deux testicules peuvent être utilisés par la suite. REMARQUE : Comme il s’agit d’un modèle d’inflammation, les moyens communs d’induction sont : l’application systémique ou l’injection scrotale locale des médiateurs pro-inflammatoires aussi bien que la superfusion avec par exemple N-Formylmethionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP). N La stimulation locale de TNF-MD est couramment utilisée pour déclencher le recrutement de leucocytes ; LPS-induit endotoxemia est un modèle de l’inflammation systémique grave SIRS.</li>
</ol>5. Visualisation de Leukocyte
REMARQUE : Les leucocytes adhérents et roulants peuvent facilement être vus sans autre visualisation. Pour déterminer la vitesse de la ligne centrale des leucocytes en mouvement libre, effectuez des taches différentielles.
<ol><li>Si des souris étiquetées eGFP sont utilisées, analysez-les directement par microscopie à fluorescence.</li>
	<li>Pour les souches de souris non étiquetées par eGFP, utilisez la coloration de rhodamine.<ol>
<li>Administrer la rhodamine 6G à 0,2 mg/kg de poids corporel. Des doses répétées peuvent être nécessaires pour atteindre des intensités de coloration suffisantes. Assurez-vous de conserver de petits volumes, car de plus grands volumes peuvent affecter les paramètres hémodynamiques.</li>
		<li>Pour la coloration instantanée des leucocytes, administrer la tache par l’artère carotide. Si la dissection carotide d’artère n’a pas été exécutée, la coloration suffisante peut être réalisée par application d’i.p. utilisant la même dose18. Comme alternative au cathétérisme carotide, tout autre cathétérisme veineux peut être effectué. REMARQUE : Gardez à l’esprit que la coloration de rhodamine, contrairement à l’étiquetage eGFP, montre la carie temporelle de l’intensité de fluorescence ainsi qu’un maximum global de coloration d’environ 80% des leucocytes à des concentrations plus élevées.</li>
		<li>Visualisez les leucocytes tachés de rhodamine en mouvement libre par microscopie fluorescence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Fin de l’expérience
REMARQUE : Le temps total estimé pour exécuter ce protocole devrait être de 90 à 150 minutes.
<ol><li>Mettre fin à l’expérience avec l’euthanasie par dislocation cervicale.</li>
	<li>Pour d’autres analyses, telles que la transmigration, fixer le muscle cremaster en PFA tout en restant étiré sur la scène et taché pour l’histologie au besoin.</li>
</ol>7. Analyse hors ligne
<ol><li>Analyser les paramètres suivants comme des comptes simples lors de la lecture vidéo.<ol>
<li>Calculer le flux roulant [nombre/min] : nombre de cellules roulantes passant une ligne imaginaire/min</li>
		<li>Calculer l’adhérence [nombre/mm2]:nombre de cellules adhésives à la paroi du navire dans le champ de vision de 30 s/surface vasculaire [mm2].</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer les paramètres hémodynamiques et microvasculaires suivants sont mesurés à l’aide d’ImageJ.<ol>
<li>Calculer le diamètre du navire [m] comme diamètre de la paroi interne.</li>
		<li>Calculer la longueur du navire [m] comme longueur de ligne centrale du navire.</li>
		<li>Calculez la <img alt="Symbole du micromètre par seconde [μm/s] pour la mesure de la vitesse dans les équations scientifiques." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> vitesse de la ligne centrale obtenue à partir de l’analyse vidéo image à cadre des leucocytes en mouvement libre dans la ligne centrale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez les équations suivantes comme estimation.<ol>
<li>Calculer la surface vasculaire en [mm2]:longueur du navire [m] x diamètre du navire [m] x x x 10-6.</li>
		<li>Calculez le <img alt="Analyse d’équilibre statique ; Symbole ΣFx=0 ; l’illustration de concepts ; l’enseignement de la physique." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> taux de cisaillement mural : 4,9 x (8 x vitesse de ligne centrale <img alt="Symbole du micromètre par seconde [μm/s] pour la mesure de la vitesse dans les équations scientifiques." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> x 0,625/diamètre du navire [m]).</li>
		<li>Calculer la vitesse <img alt="Symbole du micromètre par seconde [μm/s] pour la mesure de la vitesse dans les équations scientifiques." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> moyenne de flux <img alt="Symbole du micromètre par seconde [μm/s] pour la mesure de la vitesse dans les équations scientifiques." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> sanguin : vitesse de ligne centrale x 0.625.</li>
		<li>Calculer le <img alt="Équation décrivant la mesure du taux en unités de nombre par minute pour l’analyse de données expérimentales." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> flux total de leucocytes : compte <img alt="Mesure de la concentration en unités de nombre par microlitre [nombre/μL], utilisée dans les calculs de laboratoire." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> de <img alt="Symbole du micromètre par seconde [μm/s] pour la mesure de la vitesse dans les équations scientifiques." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> leucocyte systémique x (vitesse moyenne <img alt="Formule de calcul du diamètre vasculaire, schéma pour la mesure et l’analyse microvasculaires." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> de flux sanguin x 60/1000) x x .</li>
		<li>Calculez la fraction de flux roulant [%] : flux roulant/flux total de leucocyte x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

IVM comme méthode a été largement utilisé pour étudier différents types de cellules dans différents organes et a été largement décrit et discuté19. L’objectif principal de cette étude est de fournir une approche efficace pour mettre en place et effectuer IVM dans le muscle cremaster. La pratique de la méthode produira des résultats fiables et reproductibles. Ainsi, la planification et la normalisation sont des facteurs clés pour maîtriser la technique. Par-dessus tout, la technique est très dépend...

La microscopie intravitale (IVM) est un outil couramment appliqué dans le domaine de la biologie du leucocyte. Le recrutement de leukocyte suit une cascade d’événements bien définis initiés par la capture de leucocyte, le roulement et l’adhésion au mur endothélial, et enfin la transmigration et l’extravasation des leucocytes au site réel de l’inflammation1. Chaque étape est médiatisée et contrôlée par diverses chimiothéines (p. ex., IL-8/CXCL8), les récepteurs (p. ex., LFA-1, Mac-1) et les molécules correspondantes d’adhérence cellulaire endothéliale (p. ex., ICAM-1, VCAM-1 et E-Selectin)2,,3. L’interaction de différents sites de régulation, les facteurs de contrôle et les médiateurs de la cascade de recrutement de leucocytes comme le récepteur des produits finaux avancés de glycation (RAGE), la molécule d’adhérence intercellulaire 1 (ICAM-1), C-X-C motif ligand (CXCL)1/2 et leur récepteur CXCR2 ont été découverts en utilisant IVM4,5,6,7,8,9.
La méthode de la MIV a été décrite pour de nombreux organes et tissus différents tels que l’intestin10, la peau11, les ganglions lymphatiques12, le sac de jaune embryonnaire13 et d’autres. Cependant, la méthode la plus largement étudiée de la MIV est le modèle de cremaster, décrit pour la première fois chez les rats14. Bien qu’elle soit encore utilisée chez les rats15,la méthode est aujourd’hui principalement appliquée chez la souris en raison de la forte abondance de différentes lignées transgéniques. Notre groupe a récemment mis en évidence le rôle potentiel de cremaster IVM dans le domaine des muscolopathies inflammatoires comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) étudiant les souris mdx dystrophine-déficientes16. En raison de sa composition fine de fibre entrelacée et facilement accessible, le muscle de cremaster représente le muscle candidat idéal pour être étudié dans son ensemble de montage utilisant la microscopie légère ou fluorescente. Le recrutement et l’extravasation de Leukocyte ont principalement lieu dans les venules post-capillaires, qui peuvent facilement être identifiés sur une couche musculaire continue dans le muscle de cremaster.
L’avantage de l’imagerie in vivo par rapport à d’autres essais in vitro est son contexte biologique dans un organisme vivant. Dans le même temps, la délimitation des contributions spécifiques aux cellules à l’analyse altérée du leucocyte peut nécessiter des modèles in vitro supplémentaires comme les chambres de débit ou les essais endothéliaux. La combinaison de plusieurs méthodes donnera des données les plus convaincantes. Les scientifiques doivent être conscients des limites du modèle de crémaster car toute manipulation chirurgicale conduira à une augmentation du trafic et du recrutement de leucocytes. Par conséquent, le recrutement de base est difficile à estimer avec cette méthode. Malgré son application large, IVM du cremaster peut être difficile et une configuration nouvelle peut prendre du temps et des ressources à établir. Nous fournissons maintenant un protocole facile qui aidera à éviter certaines des erreurs courantes dans IVM. En outre, les limitations seront discutées et des méthodes complémentaires seront mises en évidence le cas échéant.
L’IVM du cremaster représente une approche idéale à mettre en œuvre dans le domaine des études inflammatoires et infectieuses. Plus précisément, le modèle de cremaster peut être d’un grand intérêt pour les scientifiques qui étudient la biologie du muscle squelettique dans le contexte de la maladie inflammatoire.

<table><tbody><tr><td><fort>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketanest S</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>PZN : 08509909</td><td>anesthésie. Générique / Nom IUPAC : kétamine</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>N° d’article : 1205&nbsp ;</td><td>anesthésie. Nom générique / IUPAC : xylazine (sous forme d’hidrochlorure)</td></tr><tr><td>Solution saline</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp ;</td><td>PZN 02737756</td><td>préparation chirurgicale. Générique / Nom IUPAC : chlorure de sodium</td></tr><tr><td>Seringue aiguille Omnican F</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp ;</td><td>REF 9161502</td><td>préparation chirurgicale</td></tr><tr><td>Suture 6/0 USP</td><td>Resorba</td><td>REF 4217</td><td>préparation chirurgicale</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène #10&nbsp ;</td><td>BD GmbH</td><td>Fournisseur n° 427401</td><td>préparation chirurgicale</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène #90&nbsp ;</td><td>BD GmbH</td><td>Fournisseur n° 427421</td><td>préparation chirurgicale</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>Numéro CAS 989-38-8&nbsp ;</td><td>coloration leucocytaire. Nom générique / IUPAC : éthyle 2-[3-(éthylamino)-6-éthylimino-2,7-diméthylxanthène-9-yl]benzoate</td></tr><tr><td><fort>Équipement de configuration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope vertical&nbsp ;</td><td>Olympe&nbsp ;</td><td>BX51W1</td><td>microscopie</td></tr><tr><td>40 fois objectif&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>Achroplan 40 & times ; /0.80 W</td><td>microscopie</td></tr><tr><td>ImSpector logiciel</td><td>Lavision Biotec GmbH</td><td>version 4.0.469</td><td>logiciel</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, États-Unis</td><td>version 1.51j8</td><td>logiciel</td></tr></tbody></table>

infiltration de leukocyte de cremaster muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

La microscopie intravitale (IVM) est largement utilisée pour surveiller les processus physiologiques et pathophysiologiques dans la cascade de recrutement de leucocytes in vivo. Le protocole actuel représente une méthode pratique et reproductible pour visualiser l’interaction endothélium leucocyte menant au recrutement de leucocytes dans le tissu dérivé du muscle squelettique dans l’organisme intact de la souris. Le modèle s’applique à tous les domaines de recherche qui mettent l’accent sur l’activation des granulocytes et leur rôle dans la maladie.
Nous fournissons un protocole étape par étape pour guider à travers la méthode et pour mettre en évidence les pièges potentiels et les difficultés techniques. Le protocole couvre les aspects suivants : réglages expérimentaux et matériel requis, anesthésie de la souris, dissection du muscle cremaster ainsi que cannulation trachéale et carotide, enregistrements IVM et analyse hors ligne. Les formats de données comme les leucocytes adhérents, le flux roulant (RF) et la fraction de flux roulant (RFF) sont expliqués en détail et les applications appropriées sont discutées. Les résultats représentatifs des souris de mdx déficientes de dystrophine sont fournis dans la section des résultats.
IVM est un outil puissant pour évaluer le recrutement de leucocytes dans un cadre in vivo; cependant, la délimitation par exemple la fonction endothéliale et leucocyte peut nécessiter une combinaison avec des configurations ex vivo comme des expériences de chambre de flux. En outre, le contexte génétique des animaux d’intérêt peut grandement influencer le recrutement de base, nécessitant un réglage individuel du protocole fourni. Malgré ses limites, IVM peut servir de plate-forme pour traduire facilement les résultats in vitro en un organisme vertébré vivant.

IVM selon le protocole fourni donnera un aperçu unique de la cascade de recrutement de leucocytes dans le muscle squelettique. La section des résultats se concentrera sur les résultats typiques obtenus par IVM et mettra en évidence les problèmes potentiels qui peuvent rencontrer.
La configuration expérimentale de la microscopie intravitale est décrite dans la figure 1. La préparation du muscle de cremaster et l’ablation du tissu conjonctif sont cruciales pour obte...

Ici, nous montrons comment effectuer la microscopie intravitale sur les venules post-capillaires du muscle de cremaster de souris. Communément appliqués à différents modèles d’inflammation et de septicémie, en particulier ceux induits par les chimiothérapeutiques et les cytokines, nous soulignons sa pertinence dans l’étude des muscolopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte.

Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Cette méthode pratique et reproductible peut être utilisée pour visualiser les interactions en léucocytes endothélium qui conduisent au recrutement de leucocytes au sein d’une souris intacte. Cette technique présente également un outil puissant pour la surveillance des processus physiologiques et pathophysiologiques dans la cascade de recrutement de leucocytes in vivo. La méthode peut être appliquée dans différents modèles inflammatoires et septiques.Par exemple, nous avons récemment souligné sa pertinence dans l’étude des musculopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte. Notre suggestion à d’autres scientifiques qui envisagent d’utiliser cette technique est d’obtenir autant d’expérience pratique que possible que la méthode est très sensible à des écarts mineurs. Simon Kranig, clinicien et scientifique principal de mon laboratoire, démontrera l’intervention.Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez l’animal expérimental anesthésié, fixez la souris dans une position dorsale couchée sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius et utilisez une suture stérile non absorbable 6-0 pour enrouler une boucle simple autour des dents frontales. Collez les extrémités de jointure de la suture à la garniture chauffante et utilisez des pinces à épiler pour soulever doucement la peau à la ligne médiane. Ensuite, faites une incision circulaire d’un à deux centimètres de diamètre sur le cou et le thorax supérieur et utilisez des pinces à épiler pour disséquer soigneusement les tissus musculaires, graisseux et conjonctifs environnants.Placer une suture sous la trachée. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe transversale d’environ 1,3 millimètre dans la trachée et introduire un tube de polyéthylène dans l’extrémité caudale de la trachée pour fixer les voies respiratoires supérieures. Fixez le tube situé avec une seule suture circulaire de noeud et localisez l’artère carotide le long du côté droit de la trachée.Disséquer le tissu environnant de la paroi de l’artère carotide et passer deux morceaux de suture sous l’artère. Attachez la première suture crânienne proximale à la bifurcation des artères carotides et placez la deuxième suture environ cinq à huit millimètres distal de la première suture sans attacher. Ensuite, fixez un morceau de tube de polyéthylène de 30 centimètres à une aiguille de seringue d’un millilitre remplie de solution saline et utilisez un clip de récipient de sept millimètres pour serrer l’artère carotide distally à la deuxième suture.Faire une coupe transversale d’environ 0,5 millimètre dans l’artère carotide et introduire le tube stérile de polyéthylène dans l’artère. Fixez le tube avec la deuxième suture et retirez l’agrafe du récipient. Puis déprimez doucement le piston de seringue pour rincer la solution saline dans le récipient.Pour préparer le muscle cremaster, transférez la souris dans un cadre de microscope en plastique sur mesure avec le scrotum face à l’étape du microscope et saisissez soigneusement le scrotum à son extrémité la plus distale avec des pincettes. En tirant doucement sur le scrotum, retirez une section circulaire d’environ cinq millimètres de diamètre de la peau scrotale en gardant le tissu ouvert bien hydraté avec de la solution saline. Utilisez deux pinces à épiler pour disséquer le tissu conjonctif lâche et localiser les deux testicules.Saisissez un testicien distally et doucement commencer à retirer le tissu reproducteur en enlevant tous les tissus conjonctifs environnants étape par étape. Une fois que le testicules a été extériorisé, épingler l’extrémité distale du tissu à l’anneau de caoutchouc entourant le stade et hydrater le tissu avec salin. Ensuite, retirez soigneusement le tissu conjonctif sans nuire au muscle cremaster sous-jacent.Il est essentiel d’enlever tout le tissu conjonctif qui se traduirait par des images floues sans nuire au muscle cremaster sous-jacent. Lorsque tout le tissu a été enlevé, faire une incision transversale d’un millimètre pour ouvrir le muscle cremaster avant de faire une incision longitudinale de l’extrémité très distale à l’extrémité proximale du tissu. Le muscle doit s’ouvrir sphériquement.Étendre soigneusement le muscle sur le stade de verre et épingler le muscle à l’anneau de caoutchouc en prenant soin de ne pas toucher ou nuire à la région centrale du tissu. Épinglez ensuite les testicules restants sur le côté pour donner accès à la région d’intérêt et hydrater le tissu avec pss. Pour la visualisation intravitale de la vascularisation musculaire, placez le muscle cremaster monté dans le microscope droit et sélectionnez l’objectif 40X.Effectuez les enregistrements sous superfusion continue avec 35 à 37 degrés Celsius PSS à travers un morceau de petit tube qui a été enregistré à l’objectif droit du microscope pour permettre le goutte d’eau continue de PSS à côté de l’objectif vers le bas sur le muscle et les tissus. Identifier les venules post-capillaires. Mesurer la microcirculation sur des venules d’un diamètre de 20 à 40 micromètres.Enregistrez ensuite des images haute résolution de la microcirculation du muscle cremaster sur une période de 30 secondes en ajustant continuellement la mise au point en raison de légers changements dans la contraction et la relaxation du tissu musculaire. L’excès de tissu conjonctif peut conduire à des images microscopiques floues. Dans cette image microscopique représentative, les venules post-capillaires qui devraient avoir entre 20 et 40 micromètres de diamètre peuvent être identifiés par la confluence de deux petits vaisseaux.Les leucocytes adhérents et roulants peuvent être visualisés tandis que les leucocytes circulants ne peuvent être suivis que dans la relecture au ralenti des vidéos enregistrées. Une multitude de paramètres peuvent affecter le recrutement de leucocytes in vivo comprenant la sortie cardiaque, le diamètre du vaisseau, la vitesse de l’axe, le taux de cisaillement de la paroi et le nombre de leucocytes circulants. Notez que la vitesse de la ligne centrale est influencée par la sortie cardiaque, la résistance vasculaire périphérique et le volume intravasal.Par exemple, un grand volume de rhodamine ou d’autres substances expérimentales administrées par l’intermédiaire du cathéter carotide augmente la vitesse de la ligne centrale post-capillaire et inhibe la capture et le roulement des leucocytes. Au contraire, l’insuffisance cardiaque, l’anesthésie profonde, ou l’hypothermie peuvent diminuer le flux post-capillaire. Pour déterminer la vitesse de la ligne centrale, des leucocytes fluorescents circulant librement peuvent être utilisés ou les leucocytes doivent être tégés avec des réaccents fluorescents comme la rhodamine.Notez que les souches de type sauvage peuvent montrer une variance physiologique. Par exemple, les souris C57BL/6 démontrent clairement amélioré le roulement, l’adhérence et la transmigration des leucocytes par rapport aux animaux C57BL/10ScSn. Les étapes de planification et de normalisation sont importantes pour maîtriser la technique en particulier lors de la préparation du muscle cremaster pour la microscopie.D’autres méthodes de visualisation du recrutement des leucocytes peuvent être menées pour fournir des informations supplémentaires et aider à disséquer la contribution individuelle des leucocytes et des cellules endothéliales à la cascade de recrutement. Cette technique fournit une plate-forme pour l’évaluation préclinique des méditants pharmacologiques et des nouvelles substances modulatrices immunitaires.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une préparation tissulaire est décrit pour la visualisation et la manipulation expérimentale de la microcirculation de vie. Dans les souris mâles anesthésiés, les minces, très vascularisé crémaster muscle est préparé pour la microscopie intravitale pour étudier les réseaux microvasculaires, y compris les artérioles, capillaires et veinules. Cette préparation est facilement adaptable pour les rats et les hamsters.

La préparation de la souris crémaster pour l&#39;imagerie intravitale de la microcirculation

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

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Numérique intravitale microscopie à épifluorescence des veinules post-capillaires de la microcirculation crémastérien est une méthode pratique pour obtenir un aperçu de leucocytes-endothélial...

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Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Microscopie intravitale de la microcirculation souris crémaster M. offre un service unique et bien normalisé modèle in vivo pour l'analyse de la moelle osseuse migration de cellules souches périphériques.

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Cette application simplifiée de la microscopie intravitale des veines du mésentère chez la souris peut être utilisée dans différents modèles d’inflammation pour observer les interactions leucocytes-endothéliales et plaquettes-leucocytes.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

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Ici, nous décrivons une approche de microscopie de feuille lumineuse pour visualiser l'infiltration de leucocytes CD45 + cardiaque dans un modèle murin de myocardite fulminante aseptique, qui est induite par le traitement intratrachéal de la toxine diphtérique des souris CD11c.DTR.

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Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

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Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

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L’imagerie in vivo des articulations est une technique précieuse pour découvrir le comportement migratoire des leucocytes et la dynamique moléculaire des articulations enflammées. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’imagerie in vivo des articulations à l’aide d’un modèle murin de l’arthrite induite par le collagène de type II (ACI).

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Apprenez la microscopie intravitale des vénules post-capillaires du muscle crémaster chez la souris. Cette technique permet de visualiser les interactions leucocyte-endothélium et d'étudier le recrutement leucocytaire dans les modèles d'inflammation et de sepsis.

Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale

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