Name: Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du Centre germinal pendant l’infection virale de la grippe A chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez les protocoles d'évaluation des cellules T folliculaires et des réponses des centres germinaux chez la souris infectée par le virus de la grippe A. Ces méthodes permettent d'étudier les mécanismes immunitaires associés aux cellules Tfh.

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Nous remercions le personnel de l’installation de cytométrie de débit, de l’installation ABSL2 et de l’installation animale SPF de l’Institut Pasteur de Shanghai pour leur aide technique et leurs conseils. Ces travaux ont été soutenus par les subventions suivantes : Programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des sciences (XDB29030103), Programme national de R-D de la Chine (2016YFA0502202), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison de rôles spécialisés dans la fourniture d’aide à la cellule B pour la génération d’anticorps à haute affinité, les cellules tfh ont fait l’objet d’études approfondies dans les mécanismes de différenciation et de manipulation afin de fournir de nouvelles stratégies pour la conception du vaccin. L’infection par le virus grippal induit des réponses vigoureuses des cellules Tfh et GC B, ce qui est un modèle approprié pour ce domaine de recherche. Dans cet article, nous avons décrit des protocoles de l’infection de ...

Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études ont été axées sur le sous-ensemble de cellules CD4+ T nouvellement identifié, sous-ensemble de cellules Tfh, pour ses rôles essentiels dans le développement du centre germinal (GC) B. Le lymphome à cellules B 6 (Bcl6), qui est principalement considéré comme un répresseur génétique, est le facteur déterminant de la lignée des cellules tfh pour la preuve que l’expression ectopique de Bcl6 est suffisante pour conduire la différenciation de Tfh tandis que l’insuffisance de Bcl6 entraîne la disparition de la différenciation tfh1,2,3. Contrairement à d’autres sous-ensembles CD4+ T helper effectuant leur fonction effectrice par migration vers les sites de l’inflammation, les cellules Tfh fournissent l’aide de la cellule B principalement dans la zone folliculaire de la cellule B de la rate et du ganglion lymphatique. Les molécules co-stimulantes ICOS et CD40L jouent un rôle important dans l’interaction entre les cellules Tfh et GC B. Au cours de la différenciation tfh, l’ICOS transmet les signaux nécessaires des cellules B cognées et agit également comme un récepteur recevant des signaux de migration des cellules B du spectateur pour la localisation de la zone cellulaire B4,5. CD40L est un médiateur des signaux des cellules tfh pour la prolifération des cellules B et la survie6. Un autre facteur jouant le même rôle que CD40L est la cytokine IL21, qui est principalement sécrété par les cellules tfh. IL21 régule directement le développement et la production d’anticorps à haute affinité par les cellules GC B, mais son rôle dans la différenciation de Tfhest encore controversé 7,8. Pd-1 et CXCR5, qui sont maintenant les plus fréquemment utilisés dans l’identification des cellules tfh dans l’analyse de cytométrie de flux, jouent également un rôle important dans la différenciation et la fonction de ce sous-ensemble. CXCR5 est le récepteur de la chimiokine folliculaire à cellules B et médie la localisation des cellules tfh dans les follicules cellulaires B9. PD-1 est maintenant identifié non seulement pour avoir la fonction de guidage folliculaire, mais aussi transmettre des signaux critiques dans le processus de maturation d’affinité des cellules GC B10. Sur la base de ces résultats, l’évaluation de l’expression de ces molécules pourrait essentiellement refléter la maturation et la fonction des cellules tfh.
Gc est une structure microanatomique transitoire induite dans les organes lymphoïdes secondaires et fortement dépendante des cellules de Tfh, étant ainsi une lecture parfaite pour évaluer la réponse de Tfh. Dans GC, après réception des signaux 2010 par des cytokines et des molécules co-stimulantes, les cellules B sont soumises à la commutation de classe et à l’hypermutation somatique pour générer des anticorps à haute affinité11. La commutation différentielle de classe d’anticorps se produit dans le créneau différentiel de cytokine, dans lequel IL4 et IL21 induisent le commutation de classe IgG1 tandis que IFNγ induit le commutation de classe IgG212. Les cellules plasmatiques sont les producteurs d’anticorps sécrétés et sont des cellules différenciées en phase terminale. Comme les cellules Tfh, le développement de cellules B dans GC est associé à l’expression dynamique de nombreuses molécules significatives. Selon l’étude actuelle, les cellules GC B peuvent être identifiées comme B220+PNA+Fas+ ou B220+GL7 + Fas+celluleset cellules plasmatiques, par rapport à leurs précurseurs, l’expression downregulate de B220 et upregulate CD138 expression13. Qui plus est, ces deux caractéristiques peuvent être détectées dans l’analyse de cytométrie de flux et d’immunofluorescence, étant ainsi l’évaluation appropriée de la réponse de GC.
Des réponses cellulaires et humoristiques robustes sont induites dans l’infection par le virus de la grippe, les cellules Tfh et Th1 dominant la réponse des cellules CD4+ T14,ce qui en fait un modèle parfait pour l’étude de différenciation des cellules Tfh. La grippe A/Porto Rico/8/34 H1N1(PR8), qui est une souche couramment utilisée adaptée à la souris, est fréquemment utilisée dans cetteétude 14,15,16. Ici, nous décrivons quelques protocoles de base de l’essai tfh étude pertinente dans l’infection par le virus de la grippe: 1) l’inoculation intranasale du virus PR8; 2) cellules tfh spécifiques aux antigènes, cellules GC B et plasma et détection IL21 avec cytométrie d’écoulement; 3) visualisation histologique de GC ; 4) détection du titer d’anticorps antigène-spécifique dans le sérum avec ELISA. Ces protocoles fournissent les techniques nécessaires aux nouveaux chercheurs dans l’étude associée à Tfh.

<table><tbody><tr><td>Immunomarquage <fort> des cellules Tfh, des cellules Tfh spécifiques de NP et du formaldéhyde Bcl-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 %</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32</td><td>souris Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugué-IAbNP311-325 CMH classe II tétramère</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td></td><td>Biolegend 358504</td><td>clone :7D1</td></tr><tr><td>Biotin-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>clone : SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>clone : GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>clone : IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>clone : IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>clone :MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>clone :7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>clone :29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptavidin BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>Coloration intracellulaire de IL21</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 % formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>humain FCc IL-21 récepteur</td><td>R& D System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ionomycine</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Aqua Kit de coloration des cellules mortes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC B et coloration des cellules plasmatiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>clone :RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>clone :281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>clone :Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>clone :11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>Dosage du titre d’anticorps spécifiques de l’HA avec ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ig anti-souris de chèvre (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti souris de chèvre (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti souris IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti souris IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti souris IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substrate Reagent Set</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biotinylée PNA</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>dilute Alexa Fluor 488-streptavidin</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>sérum de chèvre normal</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration Pro-long gold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>Kit de blocage STREPTAVIDIN/BIOTINE</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du centre germinal pendant l’infection virale de la grippe a chez la souris

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Les cellules T Follicular Helper (Tfh) sont un sous-ensemble indépendant de cellules CD4+ T spécialisé dans le développement du centre germinal (GC) et la génération d’anticorps à haute affinité. Dans l’infection par le virus de la grippe, des réponses robustes des cellules Tfh et GC B sont induites pour faciliter l’éradication efficace du virus, ce qui confère un modèle de souris qualifié pour l’étude associée à Tfh. Dans cet article, nous avons décrit des protocoles dans la détection de la réponse immunitaire tfh-associée de base pendant l’infection de virus de grippe chez les souris. Ces protocoles comprennent : l’inoculation intranasale du virus grippal; coloration et analyse de cytométrie d’écoulement des cellules polyclonales et antigène-spécifiques de Tfh, des cellules de GC B et des cellules de plasma ; détection de l’immunofluorescence des PG; test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) de l’anticorps spécifique au virus de la grippe dans le sérum. Ces analyses quantifient essentiellement la différenciation et la fonction des cellules tfh dans l’infection par le virus de la grippe, fournissant ainsi une aide pour des études dans l’élucidation du mécanisme de différenciation et de la stratégie de manipulation.

Caractérisation de la morbidité des souris dans l’infection par le virus de la grippe Après l’infection par le virus de la grippe, les souris sont moins actives et anorexiques en raison d’une maladie, qui se reflète par une perte de poids grave, un symptôme couramment utilisé pour surveiller la morbidité dela souris 19. Comme le montre la figure 1a, les souris infectées par le virus PR8 ont commencé à perdre du poids le jour 6, on...

Cet article décrit les protocoles d’évaluation de la réponse de Tfh et de GC B dans le modèle murin de l’infection par le virus de la grippe.

Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du Centre germinal pendant l’infection virale de la grippe A chez la souris

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Les lymphocytes T auxiliaires folliculaires sont des sous-ensembles de lymphocytes T CD4 nouvellement identifiés qui fournissent de l’aide aux lymphocytes B dans la production animale de haute affinité. La démonstration de l’identification des cellules Tfh dans une infection par le virus de la grippe aidera les nouveaux chercheurs à comprendre comment effectuer les techniques nécessaires aux études associées à Tfh. Parce qu’un titre viral inapproprié peut entraîner une mortalité ou une réponse immunitaire trop faible, nous conseillons de déterminer le titre avant de réaliser une expérience.Pour l’inoculation du virus PR8 de souris C57 noires 6 mâles âgées de huit semaines. Dans des conditions de biosécurité de niveau 2, décongelez un stock de virus PR8 stocké à moins 80 degrés Celsius sur de la glace. Vortex le virus pour obtenir une solution homogène.Diluer le virus à deux unités de plate-forme par microlitre de PBS dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre et confirmer l’absence de réponse au pincement des orteils chez les animaux anesthésiés. Vortex le virus à nouveau. Chargez une pointe de pipette de 20 microlitres avec 10 microlitres de virus.Ajoutez soigneusement des gouttes de virus dans un naris d’un maximum de trois animaux sous sédation avant de répéter l’inoculation de l’autre côté. Ensuite, placez toutes les souris en décubitus sternal dans des cages chaudes avec surveillance jusqu’à ce qu’elles se rétablissent complètement, et pesez chaque souris quotidiennement pendant 10 jours. À la fin de l’expérience, placez les souris dans une hotte à flux laminaire de niveau de biosécurité 2 et fixez le premier animal à une planche de dissection en mousse absorbante recouverte de papier.Utilisez des ciseaux de dissection pour couper la peau le long de la ligne médiane abdominale, en étirant la peau avec une pince à épiler et en épinglant la peau sur la planche de dissection. Ouvrez le péritoine pour recueillir la rate et placez la rate dans un filtre de 70 micromètres avec une parabole de 6 centimètres contenant 5 millilitres de DMEM complétés par 1 % de FBS. Divisez le diaphragme et les côtes jusqu’au thymus et fixez la côte sur le côté pour exposer la cavité thoracique.Bougez les poumons et le cœur pour localiser le ganglion lymphatique médiastinal près de la face ventrale de la trachée. Ensuite, placez le ganglion lymphatique dans sa propre passoire dans une deuxième boîte de 6 centimètres contenant 5 millilitres de fluide et utilisez des pistons de seringue de 3 millilitres pour écraser doucement les deux tissus à travers le maillage des deux crépines. Rincez chaque passoire avec 1 millilitre de DMEM frais plus FBS et transférez les suspensions cellulaires dans des tubes à centrifuger individuels de 15 millilitres.Récupérez les cellules par centrifugation et remettez soigneusement les granulés en suspension dans 1 millilitre de DMEM frais plus FBS par tube. Ajoutez ensuite quatre millilitres supplémentaires de fluide à la suspension de cellules de rate et placez les deux tubes sur de la glace. Pour colorer les cellules pour l’expression de CXCR5, retournez le tube plusieurs fois pour mélanger et transférez 2 fois 10 à 6 cellules par échantillon dans des tubes FACS individuels.Ajoutez 2 millilitres de tampon de coloration dans chaque tube et mélangez les cellules par vortex. Granulez les cellules par centrifugation et jetez les surnageants. Tapotez doucement chaque tube sur du papier absorbant deux fois et effleurez doucement les deux fonds pour remettre en suspension les cellules dans le surnageant résiduel.Bloquez la liaison non spécifique avec 0,2 microlitre de bloc de récepteur Fc par tube et effleurez doucement le tube pour mélanger avant de placer les tubes sur de la glace pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 0,3 microlitre de biotine anti-souris CXCR5 dans chaque tube et mélangez en tapotant doucement. Placez les tubes sur de la glace pendant une heure en effleurant doucement à 30 minutes.A la fin de l’incubation, ajouter 2 millilitres de tampon de coloration dans les tubes et vortex pour mélanger avant de sédimenter les cellules par centrifugation. Jetez le surnageant et effleurez pour remettre les cellules en suspension dans le tampon résiduel. Ensuite, placez les tubes sur de la glace et étiquetez les cellules avec des anticorps contre le marqueur de surface d’intérêt, comme indiqué dans le tableau qui vient d’être démontré.À la fin de l’incubation, laver les cellules avec 2 millilitres de tampon de coloration et remettre en suspension chaque pastille dans 400 microlitres de tampon de coloration fraîche pour analyse par cytométrie en flux. Les souris infectées par le virus PR8 commencent à perdre du poids le sixième jour, atteignant la perte la plus élevée le huitième jour et revenant aux niveaux de poids initiaux le 10e jour. Comme prévu, aucune perte de poids n’a été observée chez les souris témoins traitées par PBS.L’infection virale entraîne également une forte expansion des lymphocytes dans le ganglion lymphatique drainant. Comme l’a observé l’analyse par cytométrie en flux, la différenciation des cellules auxiliaires folliculaires T s’initialise au cinquième jour et atteint un pic au 10e jour après l’infection, avec un nombre robuste de cellules auxiliaires folliculaires T induites chez les souris infectées par le virus de la grippe par rapport aux animaux témoins. De plus, dans les ganglions lymphatiques médiastinaux et la rate, le nombre de lymphocytes T CD4 positifs spécifiques de l’antigène de la grippe est induit de manière significative par rapport à ceux observés chez les souris témoins avec des populations accrues de cellules CXCR5 positives-1 chez les animaux PR8.De plus, la coloration intracellulaire de l’IL-21 révèle que l’infection par PR8 induit une production significativement plus élevée de cette cytokine en réponse à l’infection virale. La coloration immunofluorescente indique la présence d’une réaction induite du centre germinatif chez les souris infectées par PR8, et l’ELISA démontre la génération d’anticorps spécifiques du virus de la grippe chez les animaux infectés par le virus. Il est important d’effectuer la coloration CXCR5 sur de la glace pendant une heure, car la qualité de la tache sera affectée par la température et le temps de coloration.Bien que nous ayons démontré la coloration CXR5 et IL-21, d’autres marqueurs de surface, facteurs de transcription et cytokines peuvent être évalués par cette méthode pour fournir une multitude de données sur la différenciation et la fonction de Tfh.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d'essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

in vitro des lymphocytes T et une coloration intracellulaire des cytokines – ont été utilisées pour mesurer la capacité de présentation de l jove_content’antigène des cellules dendritiques et les réponses des lymphocytes T spécifiques de l&gt;'antigène à une infection mutante par le virus du Nil occidental chez la souris.

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Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du Centre germinal pendant l’infection virale de la grippe A chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du Centre germinal pendant l’infection virale de la grippe A chez la souris

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