Quantification de l’adhérence des cellules tumorales dans les cryosections des ganglions lymphatiques

Les sites les plus fréquents pour la métastase sont les ganglions lymphatiques originaux. Somatids peut être utilisé pour détecter l’affinité adhésive entre les sections des ganglions lymphatiques des cellules tumorales in vitro. Un avantage de cette technique est que les sections fraîches de ganglion lymphatique fournissent une complexité naturelle du tissu original, qui ne serait pas possible de recréer en utilisant des protéines purifiées.

Cette méthode pourrait être utile pour les études d’oncologie moléculaire qui cherchent à identifier les gènes ou les thérapies qui interfèrent avec l’adhérence des cellules tumorales aux organes cibles métastatiques, comme les ganglions lymphatiques. Pour récolter les ganglions lymphatiques dans les trente minutes qui ont été sacrifiées, placez le rat Wistar adulte dans une couchée dorsale sur une planche de dissection propre à température ambiante et vaporisez la fourrure d’alcool isopropyle à 70 %. À l’aide d’instruments stérilisés, soulevez la peau abdominale et faites une incision médiale de la peau pour exposer les viscères abdominaux.

Extraire l’intestin jusqu’à ce que les ganglions lymphatiques thoraciques et abdominaux deviennent visibles. À l’aide de ciseaux à pointe émoussée, exciser soigneusement les ganglions lymphatiques sans blesser l’artère mésentérique supérieure sous-jacente, et placer le ganglion lymphatique dans un tube de 15 mL contenant 5 mL de PBS stérile. Lorsque tous les ganglions lymphatiques ont été récoltés, placez un ganglion lymphatique par cryomold face vers le bas sur la base de chaque moule et ajoutez juste assez de milieu optimal de température de coupe pour couvrir les tissus.

Après le gel instantané, utilisez un cryostat pour acquérir des sections de 5 à 8 micromètres d’épaisseur à 22 degrés Celsius et recueillir les sections sur des diapositives de microscope en verre. Cryosections de bonne qualité à partir de tranches consécutives du même ganglion lymphatique sont essentiels pour minimiser les différences entre les tranches, et de faciliter les taux d’adhérence cellulaire cohérente. Pour l’étiquetage des cellules tumorales, récolter les cellules d’intérêt à partir d’une culture cellulaire correctement mise en scène et re-suspendre les cellules à un 1 x 10 à la concentration de 6 cellules par mL et milieu sans sérum.

Transférer 1 mL de cellules dans un nouveau tube conique de 15 mL et étiqueter les cellules avec 2 microgrammes par mL DiI (C18) pendant dix minutes à 37 degrés Celsius, avec une agitation douce à cinq minutes pour éviter la sédimentation cellulaire. À la fin de l’incubation, pelleter les cellules par centrifugation et laver les cellules étiquetées deux fois avec 10 mL de milieu frais sans sérum pour éliminer tout excès de colorant. Après le deuxième lavage, suspendre à nouveau les cellules à un 1 x 10 aux 6 cellules par mL de milieu sans sérum, complétées par une concentration d’albumine de sérum bovine de 0,1 %.

Procéder des cellules tumorales étiquetées sur les sections de tissu des ganglions lymphatiques récoltés, laver délicatement les sections deux fois dans PBS, suivie d’une réhydratation en PBS frais pendant quinze minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, bloquer toute liaison non spécifique avec de l’albumine sérique bovine à 2,5 % pendant trente minutes à 37 degrés Celsius, avant d’utiliser un coton-tige pour sécher les glissières. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner une barrière autour de chaque section et ajouter 100 microlitres de cellules étiquetées sur chaque ganglion lymphatique encerclé.

Après une à deux heures à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée, enlever toutes les cellules de non-observance avec quatre lavages doux dans PBS et fixer les cellules de fluorescence adhérentes restantes avec 3,7% de formaldéhyde dans PBS pendant quinze minutes à température ambiante. Pour quantifier l’indice adhésif, utilisez l’objectif 10x sur un microscope à fluorescence pour obtenir des images TIFF individuelles de chaque section dans les champs fluorescents lumineux et rouges. Ensuite, nommez et enregistrez systématiquement les images avant d’ouvrir les images aux Fidji.

Après avoir mis l’échelle, utilisez l’outil polygonal pour sélectionner la région d’intérêt à quantifier. Sélectionnez pour quantifier la zone des ganglions lymphatiques. Les données seront exprimées en millimètres carrés.

Ensuite, sélectionnez Plugins, Analyser, Cell Counter et cliquez sur la photo pour être quantifié. Cliquez sur Initialiser et sélectionner Counter Type. Ensuite, cliquez sur les cellules de la photo.

L’indice d’adhérence des ganglions lymphatiques sera exprimé en tant que nombre de cellules tumorales adhérentes par zone couverte de ganglion lymphatique. Pour para paranaliser la photo suivante, ouvrez la photo suivante et répétez la quantification comme démontré. Comme on l’a observé, la morphologie des cellules adhérentes est arrondie dans la forme, et les cellules sont hétérogènement dispersées dans le ganglion lymphatique d’intérêt.

L’indice d’adhérence des ganglions lymphatiques est deux à trois fois plus élevé dans les lignées négatives de cellules cancéreuses du sein NDRG4, comparativement à celui mesuré pour les cellules positives NDRG4 correspondantes. Cette procédure peut être adaptée pour aider les taux d’adhérence dans d’autres tissus cibles métastatiques, comme le cerveau ou les poumons, pour évaluer les sites préférentiels secondaires d’adhérence pour les cellules tumorales inséminées. N’oubliez pas que les tissus frais et congelés doivent être considérés comme biodangereux et doivent être manipulés en utilisant les précautions appropriées en matière de biosécurité.