A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

La plupart des recherches avec des liposomes reposent sur des techniques audacieuses qui supposent intrinsèquement que tous les liposomes sont identiques. En étudiant les liposomes simples, des inhomogènes significatifs peuvent être observés. La technique liposome unique présentée ici nous permet d’étudier des centaines de liposomes simultanément et de détecter les inhomogènes dans leur taille et leur composition.

La méthode peut facilement être ajustée pour étudier d’autres systèmes à un seul niveau de liposome tels que les interactions protéinées membranaires. Tout ce dont vous avez besoin, c’est du composé que vous étudiez pour être étiqueté fluorescentement. Avec cette vidéo, nous fournissons aux chercheurs l’outil sur la façon dont ils peuvent effectuer des études liposome unique.

Nous espérons qu’il est clair que l’analyse peut facilement être modifiée pour étudier un éventail d’autres sujets scientifiques. Pour commencer, mélanger les stocks de lipides préparés 138 microlitres de POPC et 120 microlitres de cholestérol dans un flacon de verre frais. Ajoutez ensuite 500 microlitres chacun de deux lipides étiquetés fluorescents et 50 microlitres de DSPE-PEG-biotine.

Desserrer le couvercle du flacon de verre et casser le flacon dans de l’azote liquide pendant une à deux minutes. Lyophiliser le mélange de lipides congelés toute la nuit dans un séchoir à congélation. Le matin, ajouter un millilitre de tampon D-sorbitol de 200 millimlaires aux lipides secs.

Chauffer le mélange à 45 degrés Celsius et l’exposer à l’agitation magnétique pendant au moins une heure. Congelez ensuite la suspension lipidique en trempant le flacon dans de l’azote liquide et attendez que la suspension soit complètement gelée. Ensuite, trempez la suspension congelée dans un bain chauffant à 55 degrés Celsius jusqu’à ce que le mélange soit complètement décongelé.

Exposez le mélange à un total de 11 cycles de gel-dégel. Après cela, à l’aide d’un kit d’extrusion mini, extruder la suspension liposome une fois à travers un filtre en polycarbonate de 800 nanomètres. Mélanger 1 200 microlitres de BSA et 120 microlitres de biotine BSA.

Ajouter 300 microlitres du mélange à chaque puits dans une glissade de huit puits et incuber la lame pendant 20 minutes à température ambiante. Inclinez légèrement la glissière et du bord de chaque puits aspirez le milieu. Ajouter immédiatement 300 microlitres de tampon HEPES dans chaque puits pour les laver.

Lavez chaque puits huit fois au total. Ajouter 250 microlitres de streptavidine et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Répétez les huit lavages comme décrit précédemment.

Placez la lame sur le microscope et ajustez le joystick du microscope pour vous concentrer sur la surface de la chambre. Cela peut facilement être fait en utilisant le signal de réflexion laser accrue de l’interface tampon en verre comme un guide. Dans un tube de microcentrifugeuse, ajouter 10 microlitres du bouillon liposome dilué contenant 20 lipides totaux micromolaires.

Transférer 100 microlitres de tampon de la chambre au tube de microcentrifugeuse, mélanger correctement et transférer les 110 microlitres dans la chambre. Mettez la chambre sous le microscope et utilisez un microscope rudimentaire capable de détecter le signal des fluorophores liposome pour observer les liposomes immobilisés à la surface. Installez le microscope tel que décrit dans le manuscrit.

Pour image à la fois le DOPE ATTO488 et DOPE ATTO655 fluorophores dans les liposomes, l’image de multiples canaux. Assurez-vous que chaque canal est photographié séquentiellement pour éviter les excitations croisées. Par exemple, prenez d’abord une image en excitant à 488 nanomètres et l’émission de lecture à 495 à 590 nanomètres.

Par la suite, changer les paramètres et prendre une autre image en excitant à 633 nanomètres, mais l’émission de lecture seulement à 660 à 710 nanomètres. Analyser. Dans le menu image, choisissez la couleur et utilisez la fonction de canal de fusion pour créer un composite des deux canaux. Observez si les liposomes photographiés dans deux canaux différents affichent une bonne co-localisation ou si la dérive visible s’est produite.

Pour détecter les particules, ouvrez le menu plugins, choisissez ComDet et cliquez sur détecter les particules. Dans ComDet, vérifiez que les paramètres sont corrects et appuyez sur OK. Après avoir exécuter l’analyse, deux fenêtres popup avec des résultats et des résumés montrent. Le tableau des résultats contient le rapport d’intensité entre les deux canaux.

Exporter les résultats du tableau de données contenant les données de co-localisation. Adapter l’histogramme de rapport d’intensité avec une fonction gaussienne et extraire l’écart moyen et standard. L’écart moyen et type peut être utilisé pour calculer le degré d’inhomogeneity.

Préparer une formulation liposome qui a été extrudé plusieurs fois à travers un filtre de 50 nanomètres. Calibrer la taille des liposomes en comparant l’intensité de fluorescence aux données de taille de DLS. Avec les mêmes réglages de microscope expérimental qu’auparavant, imagez les liposomes d’étalonnage.

Tracez un histogramme carré d’intensité de racine de l’intensité de fluorescence des liposomes d’étalonnage. Adaptez l’histogramme avec une distribution normale de notation et extrayez l’intensité moyenne de fluorescence des liposomes d’étalonnage comme moyenne géométrique. Pour déterminer la relation entre l’intensité de la racine carrée et la taille liposome, calculer le facteur de correction en divisant le diamètre liposome moyen obtenu à partir des mesures dynamiques de diffusion de la lumière avec la moyenne géométrique de l’intensité de la racine carrée.

Calculer les valeurs carrées d’intensité des racines pour les liposomes dans l’expérience d’inhomogeneity compositionnelle et convertir ces deux diamètres en se multipliant avec le facteur de correction. Tracer la valeur du rapport d’intensité en fonction du diamètre pour les liposomes d’inhomogeneity compositionnelle, atteignant ainsi l’inhomogeneity en fonction de la taille liposome pour une population de liposomes s’étendant d’environ 50 nanomètres à 800 nanomètres. Dans ce protocole, l’immobilisation réussie de surface des liposomes était immédiatement apparente sur l’addition de la solution liposome à la chambre indiquée par les taches limitées d’intensité de diffraction.

Il est recommandé d’immobiliser suffisamment de liposomes pour atteindre une densité de 300 à 400 liposomes par image. Une densité plus faible rend l’analyse des données plus longue tandis qu’une densité plus élevée rend difficile la distinction des liposomes simples. Si l’ensemble du champ de vision n’est pas au point, la plaque d’échantillonnage peut être inclinée.

En outre, si les liposomes semblent grands et flous, cela indique que le tampon dans la chambre pourrait s’être évaporé et la surface asséchée. Les histogrammes de rapport d’intensité révèlent typiquement une distribution gaussienne autour d’une valeur moyenne de rapport. Si de fortes déviations par rapport à une distribution gaussienne sont observées, il indique un problème de sensibilité à la détection suggérant qu’un sous-ensemble de liposomes montrant un signal plus faible ont été exclus.

Après ajustement de l’histogramme de rapport d’intensité avec une fonction gaussienne, un degré de valeur d’inhomogeneity de 0.23 a été traduit à 32% de la population différant de plus de 23% du rapport molaire moyen de l’ensemble. La quantification de l’incertitude expérimentale s’est trouvée à 0,1. Le test ne sera jamais mieux que les matériaux que vous utilisez si de haute qualité liposomes unilaminar sont essentiels.

Ainsi, lorsque vous les préparez, ne coupez pas les coins ronds tels que laisser de côté les cycles gel-dégel. De mauvaises images entraîneront une grande incertitude expérimentale et vous feront surestimer l’inhomogeneity afin de prendre le temps d’acquérir de bonnes images au point. Ce que l’analyse fait essentiellement est d’étudier la densité de surface de l’étiquette fluorescente.

Si cette étiquette fluorescente est sur un lipide percolé, alors cet essai peut être utilisé pour tester la qualité liposomes pour l’administration de médicaments. La configuration a été appliquée pour étudier comment les peptides se lient aux membranes et détectent la courbure. Cela a donné aux chercheurs des idées uniques sur les indices moléculaires qui régissent la façon dont les peptides sont triés à l’intérieur des cellules.