Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

Les modèles actuels de maladie pour la perte cornéenne de cellules endothéliales se concentrent sur la destruction de l’endothélium et représentent plus probablement les étapes finales de la maladie quand la transplantation cornéenne est inévitable. De nouveaux traitements utilisant des cellules souches ou une thérapie génique, cependant, sont maintenant disponibles qui pourraient être plus utiles pour les premiers stades de la maladie, dont les modèles font défaut. La chirurgie intraoculaire non invasive par photodisruption à l’aide d’un laser Nd:YAG est devenue une procédure de routine pour les ophtalmologistes.

Après avoir obtenu des yeux de porc fraîchement édulés de l’abattoir local, placez les échantillons dans un milieu plein de quatre degrés Celsius. Utilisez des ciseaux pour enlever les tissus extracellulaires et tremper les yeux dans 5% povidone solution ophtalmique d’iode pendant cinq minutes. Ensuite, placez les échantillons désinfectés dans du PBS stérile à température ambiante.

À l’aide d’un dispositif spectral de tomographie optique de cohérence de domaine, filtrez les yeux pour les pathologies antérieures principales de segment telles que la cicatrisation cornéenne, l’oedème, et d’autres opacities. Après le criblage, placez les yeux devant une lampe à glissement équipée d’un laser Nd:YAG avec une longueur d’onde de 1 064 nanomètres et un diamètre de tache focale de 10 micromètres dans l’air. Sélectionnez le grossissement 12X et déviez l’éclairage pour visualiser les différentes couches cornéennes.

Après avoir défini l’énergie pulsée et point de focalisation vers les paramètres appropriés pour l’ablation sélective des cellules endothéliales cornéeles, appliquer plusieurs coups de laser sur le tissu. Puis, sous un microscope disséquant, placer une paracentesis de cornée claire près du limbus et injecter viscoélastique pour stabiliser la chambre antérieure. Ensuite, utilisez une tréphine de huit millimètres pour exciser la cornée centrale traitée au laser et placer la cornée isolée dans un puits d’un côté endothélial de plaque de 12 puits vers le haut.

Lorsque toutes les cornées ont été récoltées, ajouter trois millimètres de plein milieu à chaque puits d’échantillon et incuber les spécimens jusqu’à trois jours à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, remplacer le milieu de chaque puits par du paraformaldéhyde sans méthanol dans le tampon de Sorensen pour une incubation de 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, placer les échantillons fixes dans 20 % de saccharose dans le PBS pendant environ une heure jusqu’à ce que les cornées coulent.

Transférer les échantillons dans 30% saccharose en PBS pendant la nuit avant d’intégrer les tissus dans la température optimale de coupe pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Utilisez un cryostat réglé à moins 27 degrés Celsius pour obtenir des sections de 10 micromètres d’épaisseur des tissus congelés recueillant chaque section sur une lame de microscope dans la minute qui a été acquise. Rangez ensuite les glissières à moins 80 degrés Celsius jusqu’à coloration.

Pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine, séchez l’air des sections gelées pendant plusieurs minutes pour éliminer l’humidité avant de tacher avec de l’hématoxyline filtrée de 0,1 % mayer pendant 10 minutes dans un tube de 50 millilitres. À la fin de l’incubation, rincer les glissières à l’eau distillée double pendant cinq minutes dans une cuvette. Ensuite, trempez les diapositives dans 0,5% d’éosine 10 fois, suivie d’une croûte de trempette dans de l’eau distillée double jusqu’à ce que l’éosine cesse de strier.

Tremper les glissières rincées 10 fois dans 50% d’éthanol et 10 fois dans 70% d’éthanol. Après la dernière baisse de 70 % d’éthanol, équilibrer les sections à 95 % d’éthanol pendant 30 secondes, puis 60 secondes dans 100 % d’éthanol avant plusieurs immersions dans le xylène. Montez ensuite les spécimens avec des coverslip avant d’obtenir des images sur un microscope léger.

Deux images de microscopie photon et légère doivent être évaluées indépendamment car il n’y a pas de dommages, trop de dommages ou une quantité correcte de dommages. Sur la base de ces évaluations, une carte thermique peut ensuite être calculée pour sélectionner la bonne constellation de paramètres laser pour l’ablation sélective des cellules endothéliales cornéeles avec un minimum de dommages au tissu environnant. L’analyse précédente a déterminé que le point focal du laser doit être d’au moins 0,15 millimètre derrière l’endothélium cornéen pour l’énergie légumineuse la plus basse testée.

Pour les énergies pulsées supérieures à 2,9 millijoules, la plus longue distance focale testée est encore trop proche de l’endothélium. Divers agents cytoprotecteurs peuvent être testés pendant que les spécimens excisés sont en culture. S’ils sont couronnés de succès, ils peuvent être ajoutés à la solution d’irrigation pour le traitement.