Name: Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Découvrez un protocole non invasif utilisant le laser Nd:YAG pour détacher les cellules endothéliales cornéennes de la membrane de Descemet. Ce modèle ex vivo sur yeux porcins permet d'étudier les stades précoces de la kératopathie bulleuse.

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Nous remercions Christine 'ron et Jan A. M. Sochurek pour leur aide à l’expérimentation.

Toutes les procédures impliquant des tissus animaux suivent les lignes directrices du Comité local de soins aux animaux et d’éthique.
1. Préparation de la culture d’organe et du traitement au laser
<ol><li>Obtenez des yeux porcins fraîchement enuclésés de l’abattoir local. Gardez-les au frais (4 oC) dans le milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec un glucose élevé, complété par de la L-glutamine, du pyruvate de sodium, de la pénicilline/streptomycine (1 %), et du sérum porcin (10 %), dorénavant appelé moyen complet.</li>
	<li>Enlever les tissus extracellulaires avec des ciseaux et tremper les yeux dans 5% de solution ophtalmique povidone-iode pendant 5 min avant de les placer dans le phosphate stérilisé tamponné saline (PBS) jusqu’à l’utilisation.</li>
	<li>Écran des yeux pour les principales pathologies du segment antérieur, telles que les cicatrices cornéennes, l’oedème, et d’autres opacities avec un dispositif de tomographie de cohérence optique spectral-domaine (Tableau des matériaux).</li>
	<li>Placez les yeux devant une unité de lampe fendue équipée d’un laser Nd:YAG(Tableau des matériaux), qui a une longueur d’onde de 1 064 nm et un diamètre focal de 10 m dans l’air. REMARQUE : Pour un positionnement optimal, un appareil de détention imprimé en 3D est utilisé, qui a été conçu pour tenir l’œil ferme, sans mettre trop de pression sur elle(figure 1).</li>
	<li>Utilisez un grossissement de 12x et dévier l’éclairage pour visualiser les couches cornéennes individuelles.</li>
	<li>Réglez l’énergie de l’impulsion (p. ex. 1,6 mJ) et le point de focalisation (p. ex., 0,16 mm) pour l’ablation sélective des cellules endothéliales.</li>
	<li>Placez une parcentese claire de cornée près du limbus et injectez viscoélastique(tableau des matériaux) pour stabiliser la chambre antérieure.</li>
	<li>Accisez la cornée centrale traitée au laser à l’aide d’une tréphine de 8 mm.</li>
	<li>Placer la cornée excisée dans un puits d’une plaque de 12 puits avec le site endothélial orienté vers le haut et incuber le spécimen en 3 ml de plein milieu à 37 oC pendant 3 jours. REMARQUE : Des agents cytoprotecteurs potentiels peuvent être ajoutés au milieu pendant cette étape.</li>
</ol>2. Préparation à l’histologie
<ol><li>Préparer le tampon de Sorensen avec un pH de 7,4 contenant 19,6 mL de 133 mM KH2PO4 et 80,4 mL de 133 mM Na2HPO4.</li>
	<li>Retirer le milieu du puits contenant de la cornée et fixer le tissu pendant 20 min à température ambiante (RT) à l’aide de paraformaldéhyde sans méthanol (4 %) dans le tampon de Sorensen.</li>
	<li>Placez le tissu dans 20% de saccharose dans PBS jusqu’à ce que le tissu coule (1 h) et puis dans 30% de saccharose dans PBS pendant la nuit à RT. Veillez à éviter tout contact avec les bulles et l’interface de surface de l’air. Incorporer le tissu dans le composé optimal de température de coupe (OCT) et stocker à -80 oC.</li>
	<li>Couper les sections de 10 m d’épaisseur à l’aide d’un cryostat à -27 oC. REMARQUE : Une brosse à cheveux de chameau est utile pour aider à guider la section émergente au-dessus de la lame de couteau.</li>
	<li>Transférer la section sur une diapositive de microscope en touchant la glissière au tissu dans un délai de 1 min suivant sa coupe pour éviter le séchage du tissu. Conservez les toboggans à -80 oC.</li>
</ol>3. Coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H et E)
<ol><li>Sections sèches à l’air pendant plusieurs minutes pour éliminer l’humidité.</li>
	<li>Tache avec 0,1% d’hématoxyline Mayers filtrée pendant 10 min dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Dans un bocal Coplin, rincez-le dans la course fraîche ddH2O pendant 5 min et trempez dans 0,5% d’éosin 10x.</li>
	<li>Plongez dans ddH2O jusqu’à ce que l’éosine cesse de stries, puis plongez dans 50% (10x) ainsi que 70% (10x) EtOH.</li>
	<li>Équilibre dans 95% EtOH (30 s) et 100% EtOH (60 s) avant de tremper dans le xylène à plusieurs reprises.</li>
	<li>Enfin monter et coverlip le spécimen avant de prendre des images à l’aide d’un microscope léger.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les résultats de cette étude pilote indiquent qu’un laser Nd:YAG peut être utilisé pour abler sélectivement les cellules endothéliales cornéennes lorsque des paramètres appropriés pour la dose d’énergie et la position de point de focalisation sont choisis.
Comme la fonction endothéliale est importante pour la transparence cornéenne et la sauvegarde de la cornée contre l’oedème stromal, les modèles de dysfonctionnement endothélial jouent un rôle important dans le développement de médicaments an...

La transparence de la cornée est essentielle pour la transmission de la lumière à la rétine et ses photorécepteurs1. À cet égard, un état relatif de déshydratation est essentiel pour garder les fibres de collagène dans le stroma cornéen correctement aligné. Cette homéostasie est maintenue par des cellules endothéliales cornéennes (CEC) situées sur la membrane du Descemet (DM)2. L’endothélium est la couche cornéenne la plus intime. Il a une barrière importante et la fonction de pompe, qui est cruciale pour la transparence cornéenne3. Contrairement à l’épithélium, l’endothélium n’est pas en mesure de se renouvelersoi-même 4. Par conséquent, tout dommage cellulaire causé par la maladie ou le traumatisme stimule les cellules endothéliales restantes à agrandir et à migrer, à couvrir les défauts résultants et à maintenir la fonctionnalité cornéenne5. Cependant, si la densité de la CEC tombe en dessous d’un seuil critique, la décompensation de l’endothélium conduit à un œdème, entraînant une vision floue et l’inconfort ou même une douleur sévère4. En dépit de la disponibilité des drogues pour soulager des symptômes, actuellement le seul traitement définitif dans ces cas est la transplantation cornéenne, qui peut être exécutée sous la forme d’une greffe pleine épaisseur ou d’une transplantation endothéliale lamellaire. Cette dernière procédure est disponible sous forme de kératomie endothéliale membrane de Descemet (DMEK) ainsi que de la kératothéplastie endothéliale automatisée de Descemet (DSAEK)6. Cependant, la protection du maintien de la CEC et l’amélioration de leur survie pourraient être une cible alternative, qui a besoin d’un modèle de maladie adéquat pour tester les médicaments thérapeutiques potentiels.
Les modèles actuels de la maladie de perte de CEC se concentrent sur la destruction de l’endothélium par l’injection d’agents toxiques (p. ex., chlorure de benzalkonium) dans la chambre antérieure ou par abrasion mécanique des cellules utilisant une technique invasive de descemétorhexis7,8. Bien que ces modèles soient bien établis, des inconvénients tels que la réponse inflammatoire générale et les dommages collatéraux imprécis existent. Par conséquent, ces modèles sont plus susceptibles de représenter les derniers stades de la maladie, lorsque les options chirurgicales mentionnées ci-dessus sont inévitables.
Avec les progrès dans les stratégies de traitement cellulaire tels que les cellules souches et la thérapie génique, l’application de ces thérapies cellulaires pourrait être utile dans les premiers stades de la perte de CEC9. Par la suite, nous avons besoin d’un modèle qui représente ces premiers stades de la maladie de façon plus adéquate. À cet égard, les modèles de culture cellulaire se sont améliorés au cours de la dernière décennie, mais sont encore limités dans leur validité, que les cellules in vitro ne peuvent pas venir près de reproduire les interactions complexes qui se produisent entre les différents types de cellules dans la cornée10. Par conséquent, les modèles de maladies ex vivo et in vivo sont toujours en forte demande et l’amélioration des modèles existants est d’un intérêt primordial.
La chirurgie intraoculaire non invasive par photodisruption à l’aide d’un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) est devenue une procédure de routine pour les ophtalmologistes du monde entier depuis son introduction à la fin des années 197011. La photodissoupstion repose sur l’absorption de la lumière non linéaire conduisant à la formation de plasma, à la génération d’ondes de choc acoustiques et à la création de bulles de cvitation, chaque fois que le site d’application est situé dans un environnement liquide12. En général, ces processus contribuent à l’effet prévu de la coupe précise des tissus. Cependant, ils peuvent également être la source de dommages collatéraux inutiles limitant l’enfermement local de la chirurgie au laser13.
La prédiction des effets mécaniques résultants s’est considérablement améliorée grâce à la caractérisation de la propagation de l’onde de choc et du cours de cvitation. Notre objectif est de cibler la CEC avec le moins de dommages possible aux tissus environnants afin de fournir un modèle de maladie expérimentale non invasif et assisté par laser pour les premiers stades de la perte de la CEC. À cette fin, il est nécessaire de déterminer les énergies et les positions optimales des impulsions du laser.

<table><tbody><tr><td>BARRON VACUUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyenne - élevée glucose</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>Support oculaire</td><td>Self</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd :YAG</td> laser<td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>Sérum porcin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>Tomographe à cohérence optique dans le domaine spectral</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis</td> Plaque de culture tissulaire <td></td></tr><tr><td>12 puits</td><td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à deux photons</td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>Viscoélastique</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers ont été utilisés pour effectuer la chirurgie intraoculaire non invasive, comme la capsulotomie depuis plusieurs décennies maintenant. L’effet incisif repose sur la dégradation optique au laser. Des ondes de choc acoustiques et des bulles de cavitation sont générées, provoquant une rupture tissulaire. La taille des bulles et les amplitudes de pression varient en fonction de l’énergie des impulsions et de la position du point focal. Dans cette étude, des yeux porcins enucléés ont été placés devant un laser Nd:YAG disponible dans le commerce. Des énergies variables d’impulsion ainsi que différentes positions des taches focales postérieures à la cornée ont été testées. Les lésions résultantes ont été évaluées par microscopie et histologie à deux photon pour déterminer les meilleurs paramètres pour un détachement exclusif des cellules endothéliales cornéennes (CEC) avec des dommages collatéraux minimaux. Les avantages de cette méthode sont l’ablation précise de la CEC, la réduction des dommages collatéraux, et surtout le traitement sans contact.

À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons traité les yeux avec un laser Nd:YAG, évaluant différentes énergies d’impulsion (1,0 à 4,6 mJ) et les positions des points focaux (distance de la surface postérieure de la cornée : 0,0 à 0,2 mm) pour trouver les paramètres optimaux. Plusieurs répliques (n - 3) ont été évaluées pour chaque constellation des paramètres laser (12 x 21).
En plus du protocole mentionné ci-dessus, le spécimen a été analysé avec un microscope à deux photon avant fixa...

Ici, nous présentons un protocole pour détacher les cellules endothéliales cornéennes (CEC) de la membrane de Descemet (DM) à l’aide d’un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser comme modèle de maladie ex vivo pour la kératompathie bullous (BK).

Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Les modèles actuels de maladie pour la perte cornéenne de cellules endothéliales se concentrent sur la destruction de l’endothélium et représentent plus probablement les étapes finales de la maladie quand la transplantation cornéenne est inévitable. De nouveaux traitements utilisant des cellules souches ou une thérapie génique, cependant, sont maintenant disponibles qui pourraient être plus utiles pour les premiers stades de la maladie, dont les modèles font défaut. La chirurgie intraoculaire non invasive par photodisruption à l’aide d’un laser Nd:YAG est devenue une procédure de routine pour les ophtalmologistes.Après avoir obtenu des yeux de porc fraîchement édulés de l’abattoir local, placez les échantillons dans un milieu plein de quatre degrés Celsius. Utilisez des ciseaux pour enlever les tissus extracellulaires et tremper les yeux dans 5% povidone solution ophtalmique d’iode pendant cinq minutes. Ensuite, placez les échantillons désinfectés dans du PBS stérile à température ambiante.À l’aide d’un dispositif spectral de tomographie optique de cohérence de domaine, filtrez les yeux pour les pathologies antérieures principales de segment telles que la cicatrisation cornéenne, l’oedème, et d’autres opacities. Après le criblage, placez les yeux devant une lampe à glissement équipée d’un laser Nd:YAG avec une longueur d’onde de 1 064 nanomètres et un diamètre de tache focale de 10 micromètres dans l’air. Sélectionnez le grossissement 12X et déviez l’éclairage pour visualiser les différentes couches cornéennes.Après avoir défini l’énergie pulsée et point de focalisation vers les paramètres appropriés pour l’ablation sélective des cellules endothéliales cornéeles, appliquer plusieurs coups de laser sur le tissu. Puis, sous un microscope disséquant, placer une paracentesis de cornée claire près du limbus et injecter viscoélastique pour stabiliser la chambre antérieure. Ensuite, utilisez une tréphine de huit millimètres pour exciser la cornée centrale traitée au laser et placer la cornée isolée dans un puits d’un côté endothélial de plaque de 12 puits vers le haut.Lorsque toutes les cornées ont été récoltées, ajouter trois millimètres de plein milieu à chaque puits d’échantillon et incuber les spécimens jusqu’à trois jours à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, remplacer le milieu de chaque puits par du paraformaldéhyde sans méthanol dans le tampon de Sorensen pour une incubation de 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, placer les échantillons fixes dans 20 % de saccharose dans le PBS pendant environ une heure jusqu’à ce que les cornées coulent.Transférer les échantillons dans 30% saccharose en PBS pendant la nuit avant d’intégrer les tissus dans la température optimale de coupe pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Utilisez un cryostat réglé à moins 27 degrés Celsius pour obtenir des sections de 10 micromètres d’épaisseur des tissus congelés recueillant chaque section sur une lame de microscope dans la minute qui a été acquise. Rangez ensuite les glissières à moins 80 degrés Celsius jusqu’à coloration.Pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine, séchez l’air des sections gelées pendant plusieurs minutes pour éliminer l’humidité avant de tacher avec de l’hématoxyline filtrée de 0,1 % mayer pendant 10 minutes dans un tube de 50 millilitres. À la fin de l’incubation, rincer les glissières à l’eau distillée double pendant cinq minutes dans une cuvette. Ensuite, trempez les diapositives dans 0,5% d’éosine 10 fois, suivie d’une croûte de trempette dans de l’eau distillée double jusqu’à ce que l’éosine cesse de strier.Tremper les glissières rincées 10 fois dans 50% d’éthanol et 10 fois dans 70% d’éthanol. Après la dernière baisse de 70 % d’éthanol, équilibrer les sections à 95 % d’éthanol pendant 30 secondes, puis 60 secondes dans 100 % d’éthanol avant plusieurs immersions dans le xylène. Montez ensuite les spécimens avec des coverslip avant d’obtenir des images sur un microscope léger.Deux images de microscopie photon et légère doivent être évaluées indépendamment car il n’y a pas de dommages, trop de dommages ou une quantité correcte de dommages. Sur la base de ces évaluations, une carte thermique peut ensuite être calculée pour sélectionner la bonne constellation de paramètres laser pour l’ablation sélective des cellules endothéliales cornéeles avec un minimum de dommages au tissu environnant. L’analyse précédente a déterminé que le point focal du laser doit être d’au moins 0,15 millimètre derrière l’endothélium cornéen pour l’énergie légumineuse la plus basse testée.Pour les énergies pulsées supérieures à 2,9 millijoules, la plus longue distance focale testée est encore trop proche de l’endothélium. Divers agents cytoprotecteurs peuvent être testés pendant que les spécimens excisés sont en culture. S’ils sont couronnés de succès, ils peuvent être ajoutés à la solution d’irrigation pour le traitement.

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Cette vidéo présente une procédure non invasive assistée par laser pour endommager sélectivement les cellules endothéliales cornéennes de l’œil porcin. Le modèle ex vivo développé des lésions des cellules endothéliales peut être utilisé pour étudier les maladies de l’endothélium cornéen.

Ablation sélective assistée par laser des cellules endothéliales cornéennes porcines : une technique pour induire des lésions endothéliales cornéennes porcines focalisées pour des études ex vivo

Néovascularisation (NV) de la cornée peut compliquer multiples pathologies visuelles. Utilisant un modèle de lésion alcalin brûlage dirigé, un niveau quantifiable de la SA de la cornée peut être produite pour l'étude mécaniste de la SA de la cornée et l'évaluation des thérapies potentielles pour les troubles néovasculaire.

Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

Une procédure entièrement laser est proposée dans la greffe endothéliale. La technique chirurgicale est basée sur l’utilisation d’un laser femtoseconde pour préparer le tissu donneur. La technique de soudage au laser est ensuite utilisée pour fixer l’endothélium donneur dans la bonne position.

Un «All-laser&quot; Endothelial Transplant

Ici, nous présentons le protocole de néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) de souris, un modèle expérimental qui recrée les caractéristiques vasculaires de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) néovasculaire. Une fois maîtrisé, il peut induire de manière fiable et efficace la CNV en tant que système modèle pour tester diverses mesures expérimentales.

Un modèle de souris pour induite par laser néovascularisation choroïdienne

Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d'endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l' endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.

In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

L'article suivant fournit, une technique reproductible facile de créer efficacement un modèle de souris durable de la carence en cellules souches limbiques (LSCD). Ce modèle animal est utile pour tester et comparer l'efficacité des traitements pour les maladies de cellules souches limbiques.

Une procédure mécanique simple pour créer Limbal Carence de cellules souches dans la souris

Nous présentons ici l’utilité de longitudinal en vivo imagerie dans le suivi des modifications morphologiques de la néovascularisation choroïdienne induite par laser chez les souris.

In Vivo Imagerie multimodale et analyse du modèle de néovascularisation choroïdienne souris induite par Laser

Ici, un protocole étape par étape pour la préparation et la culture des boutons cornéens fendus porcins est présenté. Comme ce modèle de culture d'organes organo-typiquement cultivé montre des taux de mortalité cellulaire dans les 15 jours, comparables aux cornées de donneurs humains, il représente le premier modèle permettant la culture à long terme de cornées non humaines sans ajouter de dextran toxique.

Un modèle de culture d'orgue endothéliale de porc cornée utilisant des boutons cornéens fendus

Le Stripping Only de Descemet est une procédure expérimentale dans laquelle les patients atteints de guttase cornéenne centrale résultant d’une dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs ont la membrane de Descemet dépouillée pour que les cellules périphériques régénèrent la couche endothéliale. Nous présentons une nouvelle méthodologie simulant le DSO dans les cornées humaines dystrophiques ex vivo avec une guérison accélérée stimulée par eFGF1 (NM141).

Un modèle de culture d’organes cornéens humains du décapage de Descemet uniquement avec une guérison accélérée stimulée par le facteur de croissance des fibroblastes 1

Ce protocole décrit une méthode permettant d’induire une lésion alcaline cornéenne et limbique précise et reproductible dans un modèle murin. Le protocole est avantageux car il permet une lésion uniformément répartie sur la cornée et le limbe de la souris, très incurvés.

Induction de lésions alcalines cornéennes et limbiques à l’aide d’une technique de poinçonnage-tréphine dans un modèle murin

Nous proposons ici trois méthodes différentes pour endommager les fibres sensorielles qui innervent la cornée. Ces méthodes facilitent l’étude de la régénération axonale chez la souris. Ces trois méthodes, adaptables à d’autres modèles animaux, sont idéales pour l’étude de la physiologie et de la régénération de l’innervation cornéenne.

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Découvrez un protocole non invasif utilisant le laser Nd:YAG pour détacher les cellules endothéliales cornéennes de la membrane de Descemet. Ce modèle ex vivo sur yeux porcins permet d'étudier les stades précoces de la kératopathie bulleuse.

Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

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