Name: Protocoles de bioimpression 3D de Gelatin Methacryloyl Hydrogel Bioinks (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez les protocoles de bioimpression 3D de GelMA pour l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. Cette méthode améliore la printabilité des hydrogels pour des applications biomédicales avancées.

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Ce travail a été parrainé par le National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000), la National Nature Science Foundation of China (No.U1609207, 81827804), le Science Fund for Creative Research Groups of the National Natural Science Fondation de la Chine (No. 51821093).

1. Culture cellulaire
<ol><li>Préparer le milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) et 1 % de pénicilline/streptomycine, utilisé pour la culture des lignées humaines de cellules cancéreuses du sein (MDA-MB-231) et des lignées de cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC).</li>
	<li>Préparer le DMEM avec de la L-glutamine (DMEM/F-12), complétée par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine, utilisée pour la culture des lignées de cellules souches mésenchymales de moelle osseuse (BMSC).</li>
	<li>Définir l'environnement de culture à 37 oC et 5 % de CO2. Culture MDA-MB-231, HUVEC, et BMSC, et passer les cellules dans un rapport 1:2 lorsque la confluence de 90% est atteint.</li>
</ol>2. Fabrication de microsphères GelMA
<ol><li>Imprimez l'appareil comme figure 1A avec de l'acide polylactique (APL) sur une imprimante de modélisation de dépôt fusionnée (FDM). Placez deux électrodes d'anneau en métal dans l'appareil.</li>
	<li>Connectez les deux électrodes d'anneau métallique avec le sol et les poteaux positifs, respectivement. Placez la plaque métallique reliée à la haute tension sous l'électrode de l'anneau et placez un plat Petri avec de l'huile de silicium sur la plaque métallique comme récepteur de gouttelettes.</li>
	<li>Dissoudre le GelMA lyophilisé (5 % w/v) et le phényl au lithium-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP, 0,5 % w/v) dans la saline tamponnée en phosphate (DPBS) de Dulbecco sous forme de bioink (10 mL). Filtrer le bioink à travers un filtre de 0,22 m pour la stérilité et le chauffer dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Détachez les cellules MDA-MB-231 avec 3 ml de trypsine de 0,25 % à 0,02 % pour 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules dans un tube centrifugeur de 15 ml à 100 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.</li>
	<li>Retirez le supernatant. Mélanger le granule de cellules avec 1 ml de bioink préparé en le piétiner lentement pour empêcher la production de bulles.</li>
	<li>Placer 1 ml de bioink (MDA-MB-231) dans une seringue stérile de 3 ml. Nourrir le bioink par la force de l'air comprimé (0,5 kPa). Mettez la seringue sur l'appareil. REMARQUE : L'environnement d'impression doit être strictement contrôlé à une température de 30 oC et une humidité de 50 %.</li>
	<li>Allumez la puissance à haute tension et fixez la tension en tant que 0-4 kV. Simultanément, allumez la lumière de longueur d'onde de 405 nm pour croiser les gouttelettes de GelMA dans 5 ml d'huile de silicium.</li>
	<li>Verser la plus grande partie de l'huile de silicium en décantant le plat Petri. Transférer l'huile de silicium restante et les microsphères GelMA dans un tube centrifuge de 15 ml à l'aide d'une cuillère.</li>
	<li>Ajouter 5 ml de DPBS et secouer le mélange uniformément. Centrifuger le tube à 100 x g pendant 5 min et retirer le liquide supernatant.</li>
	<li>Répétez l'étape 2.9 3x.</li>
	<li>Sortez les microsphères GelMA avec une cuillère et faites-les la culture dans DMEM dans un plat Petri à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 3 jours.</li>
	<li>Jeter le milieu et laver les microsphères avec DPBS. Fixer avec 2 ml de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % pendant 30 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Jetez le PFA et lavez les microsphères avec DPBS. Perméabilize avec 2 ml de 0,5% de surfactant nonionic (c.-à-d., Triton X-100) pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Jeter le surfactant nonionic et laver les microsphères avec DPBS. Tachez-les avec 2 ml de tétramethylrhodamine (TRITC) phalloïdin pendant 30 min dans l'obscurité à RT.</li>
	<li>Jeter le TRITC et laver les microsphères avec DPBS. Taisez-les avec 2 ml de 4-, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pendant 10 min dans l'obscurité à RT.</li>
	<li>Jetez le DAPI et lavez les microsphères avec DPBS. Capturez la morphologie à l'isation au microscope à fluorescence confocale.</li>
</ol>3. Fabrication de fibres GelMA
<ol><li>Préparer une buse coaxiale comme le montre la figure 2A. Fixer une buse intérieure (25 G, OD 510 m, ID et 250 m) et une buse extérieure (18 G, OD et 1200 m, ID 900 m) avec soudure. Connectez un tube de verre (longueur de 50 mm, diamètre intérieur de 1,2 mm) à l'extrémité de la buse coaxiale.</li>
	<li>Dissoudre la poudre d'alginate de sodium (Na-Alg) qui est stérilisée sous la lumière ultraviolette (UV) pendant 30 min dans l'eau déionisée à 2% (w/v).</li>
	<li>Préparer une solution stérile de bioink après l'étape 2.3. Chauffer le bioink GelMA et la solution Na-Alg dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Détachez les cellules de BMSCs avec 3 ml de 0,25% trypsine-0,02% solution EDTA pendant 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules dans un tube centrifugeur de 15 ml à 100 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.</li>
	<li>Retirez le liquide supernatant. Mélanger le granule de cellules avec 2 ml de bioink GelMA préparé en le pipetting lentement pour empêcher la production de bulles.</li>
	<li>Placer 2 ml de bioink (BMSCs) dans une seringue de 10 ml. Placer 2 ml de solution Na-Alg dans une autre seringue (10 ml). Nourrissez-les avec deux pompes à seringues, respectivement (ici, bioink à 50 m/min et solution Na-Alg à 350 m/min). REMARQUE : L'environnement d'impression doit être strictement contrôlé à une température de 30 oC et une humidité de 50 %.</li>
	<li>Allumez la lumière de longueur d'onde de 405 nm pour irradier le tube transparent pour croiser les fibres de GelMA. Utilisez un plat Petri avec DPBS pour recevoir les fibres.</li>
	<li>Sortez les fibres GelMA avec une cuillère de DPBS et la culture pendant 3 jours dans le DMEM /F-12 préparé en 37 oC et 5% CO2.</li>
	<li>Suivez les étapes 2.12-2.16 pour préparer les fibres de GelMA pour l'observation morphologique avec un microscope à fluorescence confocale.</li>
</ol>4. Fabrication de structures complexes 3D GelMA
REMARQUE : La figure 3A montre l'esquisse de fabrication des structures complexes 3D GelMA.
<ol><li>Essuyez le bioimprimeur DLP (Figure 3E) avec 75% d'alcool et exposez-le à l'irradiation UV pendant 30 min pour la stérilité.</li>
	<li>Dissoudre le GelMA lyophilisé (10 % w/v) et le LAP (0,5 % w/v) dans DPBS. Ajouter le pigment comestible magenta dans la solution (3% v/v) pour améliorer la précision de l'impression.</li>
	<li>Filtrer la solution à l'intérieur d'un filtre de 0,22 m pour la stérilité et la chauffer dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Construisez les modèles 3D avec un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD). Importer les documents du modèle au logiciel supérieur (EFL) du bioimprimeur DLP appliqué.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de bioink préparé dans l'auge du bioimprimeur DLP.</li>
	<li>Définiz les paramètres d'impression dans le logiciel supérieur comme suit : intensité lumineuse de 12 mW/cm2,durée d'irradiation de 30 s, et hauteur de tranche de 100 m. Commencez à imprimer.</li>
	<li>Retirez la structure imprimée du bioimprimeur et plongez-la dans dPBS dans un plat Petri.</li>
	<li>Détachez les cellules MDA-MB-231s avec 3 ml de 0,25% trypsine-0,02% solution EDTA pendant 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules à 100 x g pendant 5 min dans un tube de 15 ml pour obtenir une pastille cellulaire.</li>
	<li>Retirer le liquide supernatant et mélanger la pastille cellulaire avec 2 ml de DMEM.</li>
	<li>Ajouter 100 l de suspension cellulaire sur les structures imprimées. Culture eux pendant 3 jours dans le DMEM préparé à 37 oC et 5% CO2.</li>
	<li>Suivez les étapes 2.12-2.16 pour préparer les structures 3D complexes pour l'observation morphologique avec un microscope à fluorescence confocale.</li>
</ol>5. Fabrication de puces microfluidiques à base de GelMA
REMARQUE : La figure 4A montre l'esquisse de fabrication de la puce microfluidique à base de GelMA.
<ol><li>Dissoudre le GelMA lyophilisé 10% (w/v) et LAP (0.5% w/v) dans DPBS. Filtrer la solution GelMA à l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 m pour la stérilité.</li>
	<li>Stérilisez la poudre de gélatine sous la lumière UV pendant 30 min et ajoutez-la à la solution GelMA-LAP préparée à l'étape 5.1 à une concentration finale de gélatine de 5 % (w/v). Chauffer le mélange dans un bain d'eau de 37 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Concevoir un groupe de moules (Figure 4B,C) avec un logiciel CAO et les fabriquer avec de la résine photopolymère sur une imprimante DLP.</li>
	<li>Remplir les moules entièrement avec le bioink préparé.</li>
	<li>Mettre les moules dans un réfrigérateur de 4 oC pour croiser la gélatine pendant 30 min.</li>
	<li>Retirez les moules et démoulez avec une lame les feuilles d'hydrogel partiellement (physiquement) croisées des moules.</li>
	<li>Combinez les deux feuilles d'hydrogel désmolées et liez-les à l'aide de GelMA en irradiant à 405 nm pendant 1 min.</li>
	<li>Détachez les cellules HUVECs avec 3 ml de 0,25% trypsine-0,02% solution EDTA pendant 3 min à 37 oC. Centrifugeuses cellules dans un tube centrifugede de 15 ml pour obtenir une pastille cellulaire à 100 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le liquide supernatant et mélanger la pastille cellulaire avec 2 ml de DMEM.</li>
	<li>Remplissez complètement le microcanal en injectant la suspension cellulaire avec une buse et une seringue.</li>
	<li>Retournez la puce à l'envers toutes les 15 minutes pendant les 3 prochaines heures pour obtenir un ensemencement cellulaire uniforme et complet. Culture les croustilles dans le plat Petri pendant 3 jours dans le DMEM préparé à 37 oC et 5% CO2.</li>
	<li>Suivez les étapes 2.12-2.16 pour préparer les puces microfluidiques pour l'observation morphologique avec un microscope à fluorescence confocale.</li>
</ol>

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<li>Sugimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+bio-blood-vessels+constructed+using+a+tissue-specific+bioink+and+3D+coaxial+cell+printing+technique%3A+a+novel+therapy+for+ischemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease.</a> Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Cet article décrit plusieurs stratégies pour fabriquer des structures 3D de GelMA, à savoir des microsphères de GelMA, des fibres de GelMA, des structures complexes de GelMA, et des puces microfluidiques GelMA-basées. GelMA a une capacité prometteuse de biocompatibilité et de formation et est largement utilisé dans le domaine de la biofabrication. Les structures de microsphère conviennent à la libération contrôlée de drogue, à la culture de tissu, et à l'injection dans des organismes pour la thérapie plus loin<sup class=...

Hydrogels sont considérés comme un matériau approprié dans le domaine de la biofabrication1,2,3,4. Parmi eux, la gélatine methacryloyl (GelMA) est devenue l'un des biomatériaux les plus polyvalents, initialement proposé en 2000 par Van Den Bulcke et al.,5. GelMA est synthétisé par la réaction directe de la gélatine avec l'anhydride methacrylique (MA). La gélatine, qui est hydrolysée par le collagène de mammifère, est composée de motifs cibles de matrice de metalloproteinase (MMP). Ainsi, les modèles de tissus tridimensionnels in vitro (3D) établis par GelMA peuvent idéalement imiter les interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) in vivo. En outre, les séquences d'acide arginine-glycine-aspartique (RGD), qui sont absentes dans certains autres hydrogels tels que les alginates, restent sur les chaînes moléculaires de GelMA. Cela permet de réaliser l'attachement des cellules encapsulées à l'intérieur des réseaux hydrogel6. En outre, la capacité de formation de GelMA est prometteuse. Les groupes de methacrylamide sur les chaînes moléculaires de GelMA réagissent avec le photoinitiateur dans des conditions de réaction douces et forment des liaisons covalentes lors de l'exposition à l'irradiation légère. Par conséquent, les structures imprimées peuvent être rapidement reliées entre elles pour maintenir les formes conçues d'une manière simple.
Sur la base de ces propriétés, une série de champs utilisent GelMA pour effectuer diverses applications, telles que l'ingénierie tissulaire, l'analyse cytologique de base, le dépistage des médicaments et la biodétection. En conséquence, diverses stratégies de fabrication ont également été démontrées7,8,9,10,11,12,13,14. Cependant, il est encore difficile de réaliser la bioimpression 3D basée sur GelMA, qui est due à ses propriétés fondamentales. Le GelMA est un matériau sensible à la température. Pendant le processus d'impression, la température de l'atmosphère d'impression doit être strictement contrôlée afin de maintenir l'état physique du bioink. En outre, la viscosité de GelMA est généralement plus faible que d'autres hydrogels communs (c.-à-d., alginate, chitosan, acide hyaluronique, etc.). Cependant, d'autres obstacles sont rencontrés lors de la construction d'architectures 3D avec ce matériau15.
Cet article résume plusieurs approches pour la bioimpression 3D de GelMA proposée par notre laboratoire et décrit les échantillons imprimés (c.-à-d., la synthèse des microsphères GelMA, des fibres DeGelMA, des structures complexes GelMA et des puces microfluidiques à base de GelMA). Chaque méthode a des fonctions spécialisées et peut être adoptée dans des situations différentes avec des exigences différentes. Les microsphères GelMA sont générées par un module électro-assisté, qui forme une force électrique externe supplémentaire pour réduire la taille des gouttelettes. En termes de fibres GelMA, ils sont extrudés par une buse coaxiale bioimpression à l'aide d'alginate visqueux de sodium. En outre, l'établissement de structures 3D complexes est réalisé avec un bioimprimeur numérique de traitement de lumière (DLP). Enfin, une stratégie de liaison croisée à deux reprises est proposée pour construire des puces microfluidiques à base de GelMA, combinant l'hydrogel GelMA et les puces microfluidiques traditionnelles. On croit que ce protocole est un résumé significatif des stratégies de bioimpression GelMA utilisées dans notre laboratoire et peut inspirer d'autres chercheurs dans des domaines relatifs.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu ; Membrane filtrante</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-(4-amidinophényl)-6-chlorhydrate d’indolecarbamidine (DAPI)</td><td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-imprimante 3D</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumière de longueur d’onde 405nm</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>buse coaxiale</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à fluorescence</td><td>OLYMPUS FV3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bio-imprimante</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imprimante DLP</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco avec L-glutamine (DMEM/F-12)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFL Software</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gélatine</td><td>Sigma-Aldrich, Shanghai, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gélatine méthacryloyle (GelMA)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>énergie haute tension</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr> lithium <tr><td>phényl-2, 4, 6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alginate de sodium (Na-Alg)</td><td>Sigma-Aldrich, Shanghai, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRITC phalloidin</td><td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Co., Ltd., Shanghai, Chine</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocoles de bioimpression 3d de gelatin methacryloyl hydrogel bioinks

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) est devenu un biomatériau populaire dans le domaine de la bioimpression. La dérivation de ce matériau est la gélatine, qui est hydrolysée à partir de collagène de mammifère. Ainsi, les séquences d'acide arginine-glycine-aspartique (RGD) et les motifs cibles de la matrice metalloproteinase (MMP) restent sur les chaînes moléculaires, qui aident à atteindre l'attachement cellulaire et la dégradation. En outre, les propriétés de formation de GelMA sont polyvalentes. Les groupes de methacrylamide permettent à un matériau de se croiser rapidement sous l'irradiation de la lumière en présence d'un photoinitiateur. Par conséquent, il est très logique d'établir des méthodes appropriées pour synthétiser les structures tridimensionnelles (3D) avec ce matériau prometteur. Cependant, sa faible viscosité limite l'imprimabilité de GelMA. Présentés ici sont des méthodes pour effectuer la bioimpression 3D des hydrogels GelMA, à savoir la fabrication de microsphères GelMA, fibres GelMA, structures complexes GelMA, et gelMA à base de puces microfluidiques. Les structures résultantes et la biocompatibilité des matériaux ainsi que les méthodes d'impression sont discutées. On croit que ce protocole peut servir de pont entre les biomatériaux précédemment appliqués et GelMA ainsi que de contribuer à l'établissement d'architectures 3D basées sur GelMA pour des applications biomédicales.

Lors de la fabrication des microsphères GelMA, les gouttelettes de GelMA ont été séparées par la force de champ électrique externe. Lorsque les gouttelettes sont tombées dans l'huile de silicium qui recevait, elles sont demeurées de forme sphéroïde standard sans queues. C'est parce que les gouttelettes GelMA étaient dans une phase aqueuse, tandis que l'huile de silicium était dans une phase d'huile. La tension de surface qui s'est formée entre les deux phases a causé les gouttelettes de GelMA pour maintenir une forme sph...

Présenté ici est une méthode pour la bioimpression 3D de la gélatine methacryloyl.

Protocoles de bioimpression 3D de Gelatin Methacryloyl Hydrogel Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Les bioniques à base d’hydrogel GelMA deviennent très populaires dans la bioimpression 3D. Toutefois, la faible viscosité limite son imprimabilité. Ici, nous partageons des stratégies pour l’impression de GelMA dans notre laboratoire avec d’autres chercheurs.Dans cette vidéo, nous utilisons pleinement les propriétés particulières de ce biomatériau et proposons plusieurs méthodes d’impression pour différentes structures 3D qui pourraient contribuer à d’autres applications biomédicales. Pour prendre les dommages aux organes par exemple les implications sont potentiels d’être utilisés dans la thérapie correspondante en injectant l’intégration ou le traçage des structures imprimées GelMA. Il ne serait pas facile de dissoudre totalement le GelMA lyophilisé en peu de temps.Pour accélérer le processus de dissolution, un mélangeur vortex pourrait être utilisé. Chaque biomatériau utilisera des propriétés spéciales intimes de GelMA. J’ai suggéré un nouveau chemer devrait bien prendre une errance de ce qui est le conditionnement critique lors de l’impression.Les détails de l’opération déterminent le succès des procédures d’impression. C’est pourquoi nous choisissons une démonstration visuelle à partager avec d’autres chercheurs. Pour fabriquer des microsphère, commencez par relier les deux électrodes métalliques à des poteaux au sol et positifs.Placez la plaque métallique reliée à la haute tension sous l’électrode de l’anneau et une boîte de Pétri avec de l’huile de silicium sur la plaque métallique comme récepteur de gouttelette. Préparez la bio-encre en dissolvant gelma lyophilisé et LAP et DPBS filtrer à travers 0,22 filtre micromètre pour la stérilité, puis le chauffer dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Détachez les cellules MDA-MB-231 avec trois millilitres de trypsine de 0,25 pour cent et de solution EDTA de 0,02 pour cent pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et les centrifuger à 100 fois G pendant cinq minutes. Retirez le supernatant et mélangez les cellules avec un millilitre de bio-encre préparée en pipetting lentement de haut en bas en s’assurant d’éviter les bulles d’air. Aspirer un millilitre du mélange bio-encre et cellulaire dans une seringue stérile de trois millilitres.Alimentez la bio-encre par la force de l’air comprimé et mettez la seringue sur l’appareil. Allumez la puissance à haute tension et réglez la tension comme zéro à quatre kilovolts. Allumez simultanément la lumière de longueur d’onde de 405 nanomètres pour relier les gouttelettes GelMA en cinq millilitres d’huile de silicium.Décanter la boîte de Petri pour se débarrasser de la majeure partie de l’huile de silicium et utiliser une cuillère pour transférer le reste de l’huile et des microsphère dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres. Ajouter cinq millilitres de DPBS et secouer le mélange centrifugeuse le tube à 100 fois G et enlever le supernatant. Transférez les microsphériques dans une boîte de Pétri avec DMEM et culturez-les à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant trois jours.Après trois jours jeter le milieu et laver les microspheres avec DPBS. Fixez-les avec deux millilitres de quatre pour cent de PFA pendant 30 minutes à température ambiante, puis jetez le PFA et répétez le lavage. Perméabiliser les cellules avec deux millilitres de 0,5 pour cent de surfactant non ionique pendant cinq minutes à température ambiante jeter le surfactant et laver les microsphériques avec DPBS.Ensuite, tacher les cellules avec TRITC-phalloidin pendant 30 minutes, puis DAPI pendant 10 minutes dans l’obscurité jeter les colorants et laver les sphères avec DPBS après chaque coloration. Imagez les microsphériques à l’aide d’un microscope à fluorescence confocale. Dissoudre la poudre stérilisée d’alginate de sodium dans l’eau déionisée à un rapport poids/volume de deux pour cent.Préparez la solution stérile de bio-encre comme précédemment décrit puis chauffez l’alginate de bio-encre et de sodium dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Trypsinize et centrifugeuses bMSCs selon la procédure précédemment décrite pour les cellules MDA-MB 231 puis enlever le fluide supernatant et resuspendre la pastille cellulaire avec 2 millilitres de la Bio-encre GelMA. Aspirer deux millilitres du mélange de cellules bio-encre dans une seringue de 10 millilitres et deux millilitres du mélange d’alginate de sodium dans une autre seringue.Alimentez les solutions avec deux pompes à seringues bio-encre à 50 micromètres par minute et alginate de sodium à 350 micromètres par minute. Allumez la lumière de longueur d’onde de 405 nanomètres pour irradier le tube transparent et relier les fibres GelMA. Utilisez une boîte de Pétri pour recevoir les fibres et les recueillir à l’aide d’une cuillère.Transférer les fibres dans un plat avec DMEM/F12 et les culture pendant trois jours à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après avoir observé les cellules suivent les instructions précédemment décrites pour observer les fibres sous un microscope confocal de fluorescence. Dissoudre gelma lyophilisé et LAP et DPBS et ajouter magenta pigment comestible dans la solution pour améliorer la précision de l’impression.Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 micromètre pour la stérilité et la chauffer dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Construisez les modèles 3D avec un logiciel CAO et importez les documents du modèle vers le logiciel supérieur du bioimprimeur DLP appliqué. Ajouter dix millilitres de bio-encre préparée à l’auge du bioimprimeur.Définissez les paramètres d’impression en fonction des instructions manuscrites puis commencez à imprimer. Une fois terminée, retirez la structure imprimée du bioimprimeur et plongez-la dans le DPBS dans une boîte de Pétri. Détachez et pelleter les cellules MDA-MB 231 comme décrit précédemment.Resuspendez-les avec deux millilitres de DMEM et ajoutez la suspension à la structure imprimée. Culture des cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant trois jours, puis préparer les structures pour l’observation avec un microscope à fluorescence confocal comme décrit précédemment. Préparez un poids de 10 pour cent au volume GelMA et 0,5 pour cent de poids à la solution LAP volume, puis filtrez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre.Stériliser la poudre de gélatine sous la lumière UV pendant 30 minutes et l’ajouter à la solution GelMA LAP à un rapport poids/volume de 5 %. Chauffer le mélange dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Remplissez les moules avec la bio-encre préparée et placez-les dans un réfrigérateur de quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Utilisez une lame pour enlever les feuilles d’hydrogel partiellement reliées aux moules. Mélanger les feuilles d’hydrogel moulées 2D et les lier avec gelma en irradiant à 405 nanomètres pendant une minute. Les HUVECs de détachement et de granulés mélangent les cellules avec deux millilitres de DMEM et injectent la suspension dans le microcanal avec la buse et la seringue.Pendant les trois prochaines heures, retournez la puce à l’envers toutes les 15 minutes pour obtenir des sièges cellulaires uniformes et complets. Culture des copeaux dans une boîte de Pétri pendant trois jours en DMEM à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone, puis les préparer à l’observation morphologique. Lorsque les gouttelettes GelMA sont tombées dans l’huile de silicone qui les recevait, elles ont conservé une forme sphéroïde standard sans queue.Les cellules encapsulées qui subissent la force du champ électrique à haute tension ont maintenu leur capacité de propagation, ce qui a permis de vérifier la biocompatibilité de la méthode de fabrication assistée par électro. Une imprimante bio DLP a été choisie pour fabriquer des structures GelMA aux formes plus complexes telles que l’oreille du nez et la chambre multi. HUVECs ensemencés attachés aux matériaux GelMA et répartis à la surface des structures de GelMA croisées démontrant que cette application présente un potentiel d’ingénierie tissulaire.Une stratégie de liaison croisée à deux reprises a été utilisée pour fabriquer des puces microfluidiques à base de GelMA. Des copeaux avec divers microcanaux ont été construits en concevant différents moules sur demande et les HUVECs ont été ensemencés dans les canaux et attachés à la paroi du canal formant la forme macroscopique du récipient. La source à haute tension est appliquée lors de la fabrication de microspheres.Les chercheurs doivent examiner le circuit avant et ne pas toucher les millibars exposés protégeant les opérateurs ou ne font pas les cellules d’un dommage par court-circuit. La base d’eau ultrasonique pourrait être un autre choix pour accélérer la vitesse méritante. Certainement cette contribution a résumé les méthodes de bioimpression 3D de GelMA dans notre laboratoire.Les chercheurs pourraient se référer à la vidéo et améliorer ou élargir les stratégies d’impression afin de répondre à d’autres exigences biomédicales.

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