Protocoles de bioimpression 3D de Gelatin Methacryloyl Hydrogel Bioinks

Les bioniques à base d’hydrogel GelMA deviennent très populaires dans la bioimpression 3D. Toutefois, la faible viscosité limite son imprimabilité. Ici, nous partageons des stratégies pour l’impression de GelMA dans notre laboratoire avec d’autres chercheurs.

Dans cette vidéo, nous utilisons pleinement les propriétés particulières de ce biomatériau et proposons plusieurs méthodes d’impression pour différentes structures 3D qui pourraient contribuer à d’autres applications biomédicales. Pour prendre les dommages aux organes par exemple les implications sont potentiels d’être utilisés dans la thérapie correspondante en injectant l’intégration ou le traçage des structures imprimées GelMA. Il ne serait pas facile de dissoudre totalement le GelMA lyophilisé en peu de temps.

Pour accélérer le processus de dissolution, un mélangeur vortex pourrait être utilisé. Chaque biomatériau utilisera des propriétés spéciales intimes de GelMA. J’ai suggéré un nouveau chemer devrait bien prendre une errance de ce qui est le conditionnement critique lors de l’impression.

Les détails de l’opération déterminent le succès des procédures d’impression. C’est pourquoi nous choisissons une démonstration visuelle à partager avec d’autres chercheurs. Pour fabriquer des microsphère, commencez par relier les deux électrodes métalliques à des poteaux au sol et positifs.

Placez la plaque métallique reliée à la haute tension sous l’électrode de l’anneau et une boîte de Pétri avec de l’huile de silicium sur la plaque métallique comme récepteur de gouttelette. Préparez la bio-encre en dissolvant gelma lyophilisé et LAP et DPBS filtrer à travers 0,22 filtre micromètre pour la stérilité, puis le chauffer dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Détachez les cellules MDA-MB-231 avec trois millilitres de trypsine de 0,25 pour cent et de solution EDTA de 0,02 pour cent pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.

Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et les centrifuger à 100 fois G pendant cinq minutes. Retirez le supernatant et mélangez les cellules avec un millilitre de bio-encre préparée en pipetting lentement de haut en bas en s’assurant d’éviter les bulles d’air. Aspirer un millilitre du mélange bio-encre et cellulaire dans une seringue stérile de trois millilitres.

Alimentez la bio-encre par la force de l’air comprimé et mettez la seringue sur l’appareil. Allumez la puissance à haute tension et réglez la tension comme zéro à quatre kilovolts. Allumez simultanément la lumière de longueur d’onde de 405 nanomètres pour relier les gouttelettes GelMA en cinq millilitres d’huile de silicium.

Décanter la boîte de Petri pour se débarrasser de la majeure partie de l’huile de silicium et utiliser une cuillère pour transférer le reste de l’huile et des microsphère dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres. Ajouter cinq millilitres de DPBS et secouer le mélange centrifugeuse le tube à 100 fois G et enlever le supernatant. Transférez les microsphériques dans une boîte de Pétri avec DMEM et culturez-les à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant trois jours.

Après trois jours jeter le milieu et laver les microspheres avec DPBS. Fixez-les avec deux millilitres de quatre pour cent de PFA pendant 30 minutes à température ambiante, puis jetez le PFA et répétez le lavage. Perméabiliser les cellules avec deux millilitres de 0,5 pour cent de surfactant non ionique pendant cinq minutes à température ambiante jeter le surfactant et laver les microsphériques avec DPBS.

Ensuite, tacher les cellules avec TRITC-phalloidin pendant 30 minutes, puis DAPI pendant 10 minutes dans l’obscurité jeter les colorants et laver les sphères avec DPBS après chaque coloration. Imagez les microsphériques à l’aide d’un microscope à fluorescence confocale. Dissoudre la poudre stérilisée d’alginate de sodium dans l’eau déionisée à un rapport poids/volume de deux pour cent.

Préparez la solution stérile de bio-encre comme précédemment décrit puis chauffez l’alginate de bio-encre et de sodium dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Trypsinize et centrifugeuses bMSCs selon la procédure précédemment décrite pour les cellules MDA-MB 231 puis enlever le fluide supernatant et resuspendre la pastille cellulaire avec 2 millilitres de la Bio-encre GelMA. Aspirer deux millilitres du mélange de cellules bio-encre dans une seringue de 10 millilitres et deux millilitres du mélange d’alginate de sodium dans une autre seringue.

Alimentez les solutions avec deux pompes à seringues bio-encre à 50 micromètres par minute et alginate de sodium à 350 micromètres par minute. Allumez la lumière de longueur d’onde de 405 nanomètres pour irradier le tube transparent et relier les fibres GelMA. Utilisez une boîte de Pétri pour recevoir les fibres et les recueillir à l’aide d’une cuillère.

Transférer les fibres dans un plat avec DMEM/F12 et les culture pendant trois jours à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après avoir observé les cellules suivent les instructions précédemment décrites pour observer les fibres sous un microscope confocal de fluorescence. Dissoudre gelma lyophilisé et LAP et DPBS et ajouter magenta pigment comestible dans la solution pour améliorer la précision de l’impression.

Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 micromètre pour la stérilité et la chauffer dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Construisez les modèles 3D avec un logiciel CAO et importez les documents du modèle vers le logiciel supérieur du bioimprimeur DLP appliqué. Ajouter dix millilitres de bio-encre préparée à l’auge du bioimprimeur.

Définissez les paramètres d’impression en fonction des instructions manuscrites puis commencez à imprimer. Une fois terminée, retirez la structure imprimée du bioimprimeur et plongez-la dans le DPBS dans une boîte de Pétri. Détachez et pelleter les cellules MDA-MB 231 comme décrit précédemment.

Resuspendez-les avec deux millilitres de DMEM et ajoutez la suspension à la structure imprimée. Culture des cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant trois jours, puis préparer les structures pour l’observation avec un microscope à fluorescence confocal comme décrit précédemment. Préparez un poids de 10 pour cent au volume GelMA et 0,5 pour cent de poids à la solution LAP volume, puis filtrez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre.

Stériliser la poudre de gélatine sous la lumière UV pendant 30 minutes et l’ajouter à la solution GelMA LAP à un rapport poids/volume de 5 %. Chauffer le mélange dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Remplissez les moules avec la bio-encre préparée et placez-les dans un réfrigérateur de quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Utilisez une lame pour enlever les feuilles d’hydrogel partiellement reliées aux moules. Mélanger les feuilles d’hydrogel moulées 2D et les lier avec gelma en irradiant à 405 nanomètres pendant une minute. Les HUVECs de détachement et de granulés mélangent les cellules avec deux millilitres de DMEM et injectent la suspension dans le microcanal avec la buse et la seringue.

Pendant les trois prochaines heures, retournez la puce à l’envers toutes les 15 minutes pour obtenir des sièges cellulaires uniformes et complets. Culture des copeaux dans une boîte de Pétri pendant trois jours en DMEM à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone, puis les préparer à l’observation morphologique. Lorsque les gouttelettes GelMA sont tombées dans l’huile de silicone qui les recevait, elles ont conservé une forme sphéroïde standard sans queue.

Les cellules encapsulées qui subissent la force du champ électrique à haute tension ont maintenu leur capacité de propagation, ce qui a permis de vérifier la biocompatibilité de la méthode de fabrication assistée par électro. Une imprimante bio DLP a été choisie pour fabriquer des structures GelMA aux formes plus complexes telles que l’oreille du nez et la chambre multi. HUVECs ensemencés attachés aux matériaux GelMA et répartis à la surface des structures de GelMA croisées démontrant que cette application présente un potentiel d’ingénierie tissulaire.

Une stratégie de liaison croisée à deux reprises a été utilisée pour fabriquer des puces microfluidiques à base de GelMA. Des copeaux avec divers microcanaux ont été construits en concevant différents moules sur demande et les HUVECs ont été ensemencés dans les canaux et attachés à la paroi du canal formant la forme macroscopique du récipient. La source à haute tension est appliquée lors de la fabrication de microspheres.

Les chercheurs doivent examiner le circuit avant et ne pas toucher les millibars exposés protégeant les opérateurs ou ne font pas les cellules d’un dommage par court-circuit. La base d’eau ultrasonique pourrait être un autre choix pour accélérer la vitesse méritante. Certainement cette contribution a résumé les méthodes de bioimpression 3D de GelMA dans notre laboratoire.

Les chercheurs pourraient se référer à la vidéo et améliorer ou élargir les stratégies d’impression afin de répondre à d’autres exigences biomédicales.