Séquençage de petits ARN non codants à partir de tissus fixeds et d'exosomes dérivés du sérum provenant de patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration

Avec l’utilisation de ce protocole les chercheurs peuvent identifier l’exome nouveau ou le vésicule extracellulaire basé et microcellulaire basé sur le tissu pour le cancer de la prostate avancé. Isoler l’ARN des tissus F-F-B et des vésicules extracellulaires est souvent difficile, car la plupart d’entre eux sont dédés ou sont en quantité limitée Cette particule élaborera sur différentes méthodes pour optimiser les entrées R-N-A et les bibliothèques C-D-N-A pour gèner les données gratuites et de haute qualité les plus spécifiques pour le séquençage de prochaine génération. Le séquençage de prochaine génération offre la plate-forme la plus complète pour comprendre l’altération de molécule dans la tumeur qui sous-tendent la progression de tumeur cette particule est optimisée avec l’échantillon clinique de cancer de la prostate, et peut fournir de nouvelles perspicacités dans la biologie fondamentale du cancer de la prostate agressif avancé.

L’optimisation des bibliothèques C-D-N-A à partir de matériel à faible entrée est une étape cruciale pour une course de séquençage réussie, il est donc très important de générer des bibliothèques C-D-N-A de haute qualité pour obtenir des résultats précis. Après avoir effectué la micro dissection des tissus comme précédemment fait procéder à isoler le sérum dérivé E-V’s Thaw rangées d’échantillons de sérum patient à quatre degrés Celsius. Transférer 110 micro litres d’échantillon de sérum décongelé dans un tube et tourner à deux mille fois G pendant trente minutes.

Élisez le super naden pour l’isolement e-V ou exosome ultérieur et jetez la pastille de debree. À 30 microlètes de sérum exosome réaccélément d’isolement au super natent. Un l’incuber quatre degrés Celsius pendant trente minutes.

Tourner à dix mille fois G pendant dix minutes. Élisez soigneusement le super nadent E-V sans déranger la pastille dans un tube séparé de 1,5 millilitre et stockez moins 80 degrés Celsius pour une analyse future. Puis suspendre à nouveau la pastille E-V dans 70 micro litres de P-B-S préparés dans de l’eau sans nucléase.

Après avoir isolé le R-N-A total des tissus micro disséqués, et purifié E-V utilisant des kits commerciaux exécutent la préparation de bibliothèque dans cinq micro litres d’un nanogramme normalisé de quarante par micro litre R-N-A échantillon à un micro litre de trois adaptateur principal. Préchauffer le cycleur thermique à 70 degrés Celsius et incuber l’échantillon pendant deux minutes. Transférez immédiatement les échantillons sur la glace.

Dans un tube séparé mélanger deux micro litres de tampon de ligature, un micro litre d’inhibiteur RNase et un micro litre de T4 ARN ligase deux, un mutant de suppression. Mélanger la literie à tarte bye de haut en bas. Ajoutez ensuite quatre micro litres du mélange au tube avec l’adaptateur principal R-N-A 3 sur glace.

Préchauffer le cycleur thermique à 28 degrés Celsius. Et placez le tube dans le cycleur thermique pour incuber pendant une heure. Après cela, ajouter un micro litre de solution d’arrêt dans le tube tout en gardant l’échantillon sur le cycleur thermique.

Incuber à 28 degrés Celsius pendant encore 15 minutes. Retirez immédiatement le tube et gardez-le sur la glace. Dans un tube séparé ajouter un microlitre de cinq adaptateur principal.

Transfert vers un cycleur thermique préchauffé à 70 degrés Celsius. Et incuber pendant deux minutes. Placez immédiatement le tube sur la glace pour éviter le réannealage des adaptateurs.

Ajouter un micro litre de dix millimole A-T-P au tube de D natured cinq adaptateur principal. Mélanger la tourbe à tarte bye et ajouter un micro litre de ligase T4 R-N-A au mélange. Mélanger la tourbe à tarte au revoir.

Transférez trois microlitres de ce mélange au tube contenant les trois principaux adaptateurs ligatés R-N-A. Placez le tube sur le cycleur thermique qui a été préchauffé à 28 degrés Celsius et incubez pendant une heure. Après cela, transférez immédiatement le tube sur la glace et procédez plus loin avec les échantillons ou stockez à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.

Pour effectuer R-T-P-C-R, utilisez six micro ligers de chaque adaptateur ligaté R-N-A et ajoutez un micro liger d’amorce R-N-A R-T. Transférer le tube sur le cycleur thermique préchauffé à 70 degrés Celsius et incuber pendant deux minutes. Transférer le tube sur la glace.

Dans un tube séparé mélanger deux micro litres de 5X, tampon brin, 5 micro litres de 12,5 milimoler DNTP, un micro litre de 100 milimolar DTT, un micro litre de R-N-A inhibiteur, et un micro litre de transcriptase inverse. Ajouter cinq microlitres de ce mélange à l’ARN ligaté adaptateur et le transférer au cycleur thermique qui a été préchauffé à 50 degrés Celsius pour incuber pendant une heure. Après une heure de transfert de l’adaptateur ligated ADN gratuit immédiatement à la glace.

Dans un tube séparé, mélanger 25 microlitres de mélange PCR, deux micro litres d’amorce PCR ARN, deux micro litres d’indice d’amorce PCR ARN, et 8,5 microlitres de l’eau libre de l’ARN. Ajouter 37,5 microlitres de ce mélange à 12,5 microlitres de l’adaptateur ligated CDNA. Transférer le tube sur le cycleur thermique qui a été préchauffé à 98 degrés Celsius.

Programmez le cycleur thermique comme suggéré dans le protocole du fabricant avec le numéro de cycle modifié à 15. Après l’achèvement, gardez l’échantillon à quatre degrés Celsius. Procéder ou stocker à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.

Pour purifier l’ADN complémentaire ligaté, ajoutez dix microlitres du colorant de chargement d’ADN à chaque échantillon d’ADN gratuit. Et à dix microlitres de la dernière haute résolution et l’ARN personnalisé dernier. Exécutez 30 microlitres de chaque échantillon dans deux voies distinctes adjacentes l’une à l’autre dans le gel polyacrylamide TBE de six pour cent.

Avec l’ARN personnalisé dernier et à haute résolution dernière, l’espace intermédiaire entre les deux échantillons différents. Faire fonctionner le gel dans un tampon X TBE à 145 volts pendant environ 30 à 40 minutes. Gardez une trace de l’avant bleu inférieur du colorant de chargement.

Arrêtez l’électrophorèse lorsqu’elle s’approche du fond du gel. Transférer le gel dans un tampon X TBE avec 5 microgrammes par millimètre ethidium bromure. Visualisez le gel dans un transilluminateur et coupez le gel précisément entre la paire de base de 145 et 160 marqueurs de paire de base et légèrement au-dessus du marqueur de paire de base de 145 pour éviter la contamination avec le dimère d’adaptateur.

Une étape critique est la purification ligated CDNA qui se fait en coupant le gel précisément que les dimers adaptateur courir très perdre à la marque désirée. Transférer les morceaux de gel dans des tubes de rupture d’ADN conservés dans des tubes de collecte de deux millimètres. Tourner à 20 000 fois G pendant deux minutes.

Et ajouter trois cents micro litres d’eau sans RNase et lui permettre de tourner doucement sur un rocker pendant la nuit à température ambiante. Pour effectuer les précipitations d’ADN le lendemain transférer le contenu du tube à 5 tubes filtrants microns. Tournez 600 fois G pendant strictement dix secondes.

Ajoutez ensuite deux microlitres de glycogène trente microlitres de trois acétate de sodium molaire, 1X peinture à granulés, et 975 microlitres de 100 pour cent d’éthanol à l’ADN éluqué. Tournez à 17 000 fois G à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Jetez le surnatant et ajoutez 75 pour cent d’éthanol pour laver la pastille.

Après avoir tourné à 17 mille fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes jeter le supernatant et incuber les tubes à 37 degrés Celsius sur un bloc thermique complètement évaporer l’éthanol. Suspendre à nouveau la pastille avec 12 microlitres de chlorure de tricider de 10 millimolaires à PH 8,5. Effectuez ensuite un contrôle de la qualité de la bibliothèque en diluant dix fois l’ADN purifié et gratuit et en utilisant un microlitre du CDNA dilué pour fonctionner sur un bioanalyseur.

Assurez-vous que la taille gratuite du produit d’ADN correspond à la gamme du petit ARN dans l’électrophétogramme entre 136 et 160 paires de base. Calculez la morosité totale pour chaque échantillon. Normaliser chaque échantillon à 2 nanomolaires à l’aide de l’hydrochlorure tris à PH 8,5.

Tenez les bibliothèques en mélangeant des volumes égaux de chaque échantillon de deux nanomolaires dans un seul tube PCR de deux cents microlitres. Dénoature et séquence suivant les étapes décrites dans le manuscrit. Dans cette étude, la bibliothèque a été préparée après l’isolement de l’ARN et une vérification de la qualité a été effectuée.

La taille du produit pour adaptateur ligated micro Rnase correspondait à environ 136 à 160 paires de base pour chaque échantillon. Les sections mises en évidence montre la gamme du gel qui a été précisément excisée pour la petite bibliothèque d’ARN de préparation. Ce chiffre montre l’électrophorèse gel et les électrophétogrammes pour la bibliothèque d’ADN gratuit purifié.

Micro dissected tissu FFPE et sérum dérivé EV. Les mesures représentatives d’une petite course de séquençage de l’ARN démontrent la densité prévue du cluster, le score Q, le pourcentage de filtre de passage de cluster, et les taux estimatifs de rendement et d’erreur pour les tissus FFP micro disséqués et les EV dérivés du sérum. Le score Q dans les deux échantillons a montré une valeur supérieure à trois indiquant 99,9 pour cent de l’exactitude des appels de base.

Et les taux d’erreur étaient tous inférieurs à un. Chaque étape de la préparation de la bibliothèque doit être soigneusement exécutée et les tubes doivent être immédiatement transférés sur la glace après chaque incubation. Une étape critique dans le protocole est de couper le gel précisément pour s’assurer que vous avez un adaptateur dimer bibliothèque CDNA libre et pure.

Générer une bibliothèque CDNA nécessite une optimisation pour une course de séquençage de haute qualité. Comprendre ce protocole aidera les téléspectateurs à extrapoler ces détails minuscules à d’autres préprations de bibliothèque de séquençage à partir d’échantillons sources limitées suggèrent sérum et vésicules extracellulaires. Cette technique nous a aidés à identifier de nouvelles micronases qui sont associées à l’agressivité tumorale et à la résistance de thérapie dans les patients métastatiques de cancer de la prostate.

Ces techniques peuvent extrapoler à d’autres types de maladies qui peuvent aider à la découverte de nouveaux biomarqueurs. Comme cette technique utilise des matériaux biologiques tels que des échantillons de sérum et de tissus dérivés de la striation, il faut prendre les précautions appropriées. En outre, le bromure d’éthidium est un carcinogène connu et doit être manipulé très soigneusement en utilisant ce protocole.