Name: Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Apprenez la fusion cellulaire pour étudier la structure et la fonction cellulaires en créant des cellules hybrides. Cette méthode utilise la microscopie à fluorescence pour suivre les organelles et analyser leur homéostasie.

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Ce travail a été financé par une bourse Wellcome Trust Henry Wellcome à R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numéro 100090/12/Z). Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions Ashok Venkitaraman et Paul Français pour les conseils et les conseils essentiels sur le projet. Nous remercions Chiara Cossetti et Gabriela Grondys-Kotarba du Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry pour leur excellent soutien. Nous remercions Liam Cassiday, Thomas Miller et Gianmarco Contino d'avoir relu le manuscrit.

1. Étiquetage différentiel des cellules fluorescentes
<ol><li>Marquage génétique avec CRISPR Cas9<ol>
<li>Utilisez l'édition du génome CRISPR Cas9 pour étiqueter la racine (ou d'autres gènes d'intérêt) avec les protéines fluorescentes meGFP ou mScarlet-I dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines. REMARQUE: Les protocoles détaillés pour l'édition du génome sont couverts ailleurs24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Étiquetage de teinture fluorescent<ol>
<li>Cultivez des cellules cancéreuses humaines Cal51 dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), de L-glutamine et de 100 g/mL de pénicilline/streptomycine à 37 oC et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. REMARQUE: Il est important de s'assurer que les cellules sont régulièrement vérifiées pour l'absence de contamination par le mycoplasme et pour l'identité de la lignée cellulaire. N'utilisez pas de cellules qui ont été largement passages dans la culture (passages de 15). Les cellules doivent être en bonne santé et croître de façon exponentielle. Évitez la sous-confluence ou la sur-confluence.</li>
		<li>Seed chaque type de cellule (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I et les cellules Cal51 non étiquetées parentales) de sorte que 6 x 106 cellules sont présentes le lendemain pour chaque échantillon, à une confluence de 70 à 90%. REMARQUE: Il s'agit d'environ un flacon de culture tissulaire T75 ou un plat de 10 cm par type de cellule. Les cellules parentales non étiquetées sont nécessaires comme un contrôle négatif plus tard dans le protocole. Ce protocole permet la production de 20 000 cellules fusionnées, mais ce nombre pourrait être augmenté grâce à l'extension du protocole avec un nombre accru de lots.</li>
		<li>Le lendemain, prémoudre DMEM, trypsine et 1x saline tamponnée de phosphate (PBS) en les plaçant dans un bain d'eau à 37 oC.</li>
		<li>Laver les cellules rootletin-meGFP et rootletin-mScarlet-I 2x dans le PBS en versant ou en s'apitant sur le milieu et en remplaçant par 10 mL de PBS.</li>
		<li>Étiqueter les cellules Cal51 rootletin-meGFP en ajoutant 500 nM de colorant violet (Table of Materials) en PBS pendant 1 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Étiquette Cal51 rootletin-mScarlet-I cellules en ajoutant 200 nM de colorant à cellules rouges lointaines (Tableau des matériaux) en PBS pour 1 min à RT. REMARQUE: Gardez les échantillons à l'abri de la lumière dans la mesure du possible après la coloration fluorescente, afin d'éviter le blanchiment de la fluorescence.</li>
		<li>Arrêter les réactions d'étiquetage de teinture en ajoutant 10 ml de DMEM pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez les cellules Cal51 parentales non étiquetées de l'incubateur (à partir de l'étape 1.2.2). REMARQUE: Ces cellules seront utilisées plus tard comme contrôles négatifs non étiquetés (étape 3.3.2).</li>
		<li>Laver toutes les cellules une fois en versant le milieu de croissance et en remplaçant par 10 ml de PBS.</li>
		<li>Verser le PBS et incuber pendant 5 min dans des conditions de culture avec 1 ml de 1x trypsine préréchauffée.</li>
		<li>Transférer les cellules dans un tube conique en plastique de 15 ml et une centrifugeuse à 1000 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez soigneusement et jetez la trypsine de la pastille cellulaire à l'utilisation d'une pipette.</li>
		<li>Resuspendre délicatement les granulés de cellules violets et rouges en 1 ml de PBS.</li>
		<li>Resuspendre délicatement le granule de cellule parental (non fluorescent) dans 1 ml de DMEM et retourner à l'incubateur. REMARQUE: Cet échantillon ne subira pas de fusion cellule-cellule, mais sera utilisé plus tard pendant la cytométrie du débit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fusion cellule-cellule
<ol><li>Mélanger 3 x 106 cellules violettes étiquetées avec 3 x 106 cellules étiquetées rouges dans un tube de 15 ml en tapissant doucement 0,5 ml de chaque type de cellule à l'aide d'une pipette de 1 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules non mélangées restantes de l'étape 2.1 à 1000 x g pendant 5 min, puis verser pbS, resuspendre le granule dans 1 ml de DMEM et revenir à l'incubateur. REMARQUE: Ces échantillons non mélangés non étiquetés restants seront utilisés plus tard comme contrôles négatifs et de compensation à la section 3 du protocole.</li>
	<li>Centrifuger les cellules mélangées à partir de l'étape 2.1 à 1000 x g pendant 5 min et aspirer soigneusement PBS à l'aide d'une pipette de 1 ml.</li>
	<li>Ajouter 0,7 ml de solution PEG de 50 % 1450 dans le sens déroulant de la pastille cellulaire (étape 2.3) à l'aide d'une pipette de 1 ml sur une période de 30 s.</li>
	<li>Laisser agir 3,5 min à RT. REMARQUE: Le temps d'incubation avec PEG peut être optimisé en fonction du type de cellule, bien que notez que le temps d'incubation plus long augmente la toxicité cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de DMEM sans sérum dans le sens de la baisse pendant 30 s et laisser dans l'incubateur pendant 10 min.</li>
	<li>Faites tourner à 1 000 x g pendant 5 min, jetez le supernatant et suspendez doucement dans 1 ml de milieu complet (DMEM contenant du FBS). REMARQUE: Passez directement à l'article 3. Il y a toxicité associée à l'exposition de PEG suivie de cytométrie de flux et d'imagerie, ainsi maintiennent des cellules dans des conditions de culture autant que possible en procédant rapidement entre les étapes.</li>
</ol>3. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir les cellules fused
<ol><li>Préparer toutes les cellules à la cytométrie du débit en tapant doucement chaque échantillon séparément à travers un filtre de 70 m dans un tube FACS. REMARQUE: Quatre échantillons sont nécessaires : cellules fusionnées, globules rouges étiquetés isolés, cellules violettes étiquetées simples, cellules parentales non étiquetées. Une fois retirées du capuchon stérile de culture des tissus, les cellules ont la capacité d'être infectées, afin de minimiser le temps d'exposition des échantillons à un environnement non stérile à partir d'ici. Les cellules sont triées dans un milieu DMEM complet.</li>
	<li>Utilisez un cytomètre capable de tri à cellule unique.<ol>
<li>Configurez le trieur cellulaire pour une sorte aseptique. Effectuer le contrôle de la qualité de l'instrument selon la recommandation du fabricant.</li>
		<li>Dessinez une parcelle de diffusion vers l'avant par rapport à la dispersion latérale et un complot de discrimination doublet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Créez des portes pour identifier les cellules fusionnées.<ol>
<li>Excitez les colorants fluorescents à des longueurs d'onde de 405 nm et 635 nm. Détecter à 450 nm et 660 nm (longueurs d'onde violettes et rouges, respectivement). Terrain loin rouge contre longueurs d'onde violettes.</li>
		<li>Exécutez des cellules parentales non étiquetées à travers le cytomètre et enregistrez l'intensité de fluorescence. REMARQUE: Les valeurs au-dessus de cette ligne de base définissent la positivité pour la coloration des colorants.</li>
		<li>Exécuter des cellules violettes étiquetées simples à travers le cytomètre. Confirmez qu'il n'y a pas de débordement de violette dans le canal rouge lointain.</li>
		<li>Exécutez des globules rouges étiquetés isolés à travers le cytomètre et confirmez qu'il n'y a pas de débordement de rouge lointain dans le canal violet. REMARQUE: Pour les données représentatives présentées, les cellules ont été triées à 20 psi sur un trieur équipé d'une buse de 100 m.</li>
		<li>Exécutez brièvement l'échantillon de fusion pour confirmer que les cellules fusionnées sont visibles avec les portes créées à l'étape 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aligner le flux de tri de façon centralisée dans un plat d'imagerie à 8 puits.</li>
	<li>Les cellules fusionnées de tri FACS, présentes sous forme de cellules violettes positives doubles et d'étiquettes rouges lointaines directement dans un plat d'imagerie de 8 puits contenant 100 l de milieu de croissance. REMARQUE: Le nombre maximum recommandé de cellules est de 50 000 euros par plat de 8 puits. Assurer la santé des cellules pendant le tri. La confluence cellulaire peut influencer la santé cellulaire, alors gardez les cellules entre 20 et 90 % de confluence après le tri en triant un nombre approprié de cellules pour le plat d'imagerie. Chaque gouttelette triée contient environ 3 nL de liquide de gaine. Assurez-vous que le liquide de gaine ne dilue pas de façon significative le milieu de croissance pendant le tri.</li>
	<li>Directement après le tri, ramener les cellules à l'incubateur et laisser pour la nuit. REMARQUE: Les cellules adhérentes réadhéreront progressivement à la couverture pendant cette période, à partir du tri, et donc leur morphologie changera au fil du temps si elle est prise directement au microscope.</li>
</ol>4. Staining immunofluorescent et imagerie des fusions de cellules-cellules
REMARQUE: Les cellules futilisées peuvent être représentées en direct ou après fixation et d'autres taches fluorescentes (ou les deux), selon les expériences et les mesures requises.
<ol><li>Imagerie cellulaire en direct<ol>
<li>Remplacer le milieu de croissance par un milieu d'imagerie sans phenol rouge(tableau des matériaux)et passer directement à l'imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixation et coloration<ol>
<li>Préparer le paraformaldéhyde frais de 4 % (PFA) dans PBS.</li>
		<li>Fixez les cellules en les incuber dans 100 'L de 4% PFA pendant 15 min à RT. Enlevez PFA après 15 min. MISE EN GARDE: PFA est toxique lorsqu'il est inhalé de sorte que cette étape doit être effectuée dans un capot de fumée avec un équipement de protection individuelle approprié. REMARQUE: Après fixation, l'expérience peut être interrompue et redémarrée plus tard si nécessaire. Entreposer l'échantillon à 4 oC, à l'abri de la lumière, au besoin.</li>
		<li>Laver les cellules 3x dans 200 OL de PBS à RT.</li>
		<li>Les cellules de perméabilize pendant 10 min à RT dans 200 'L de 0.1% surfactant nonionic (tableau des matériaux) et 0.1% détergent nonionic (tableau des matériaux) dilué dans PBS.</li>
		<li>Bloquer en 200 l de 3% d'albumine de sérum bovin en PBS pendant 30 min à RT.</li>
		<li>Incuber avec des anticorps dans 150 OL de PBS contenant 3% d'albumine de sérum bovin et 0,1% de surfactant nonionique et 0,05% de détergent nonionique pendant 1 h à RT. REMARQUE: Les principaux anticorps utilisés pour générer les résultats représentatifs sont les nanobodys anti-GFP conjugués fluorescents (utilisés à 1:400 dilution), et fluorescents conjugués anti-mScarlet-I nanobody (utilisé à 1:500 dilution). Ceux-ci améliorent le signal des protéines déjà fluorescentes.</li>
		<li>Laver 2x pendant 5 min dans 300 OL de PBS, puis laisser dans 200 'L de PBS. REMARQUE: Les échantillons sont représentés dans PBS. Les échantillons peuvent être stockés à 4 oC, protégés de la lumière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acquisition d'images<ol>
<li>Acquérir des images avec un microscope à fluorescence approprié capable d'imagerie quatre couleurs (p. ex., éclairage confocal, large champ, structuré).</li>
		<li>Excitez-moiGFP et mScarlet-I canaux avec 488 nm et 561 nm lasers longueur d'onde, respectivement. Définir les détecteurs pour détecter à 505 à 550 nm et à 590 à 650 nm. Excitez les canaux violets et les canaux de teinture rouge lointain avec 405 nm et 633 nm lasers, respectivement. Définir les détecteurs pour détecter à 430 à 500 nm et à 660 à 750 nm.</li>
		<li>Déterminez empiriquement l'intensité laser de telle sorte qu'il n'y ait pas de photoblanchiment significatif et que les cellules restent en bonne santé (si l'imagerie cellulaire vivante).</li>
		<li>Déterminez empiriquement le gain tel que le signal est obtenu sans saturer ou couper artificiellement les valeurs des pixels.</li>
		<li>Recueillir des données De pile Z, de sorte que les images sont tridimensionnelles, couvrant une gamme de 20 à 60 m avec une taille d'étape de 500 m. REMARQUE: Les images présentées dans les données représentatives ont été acquises soit par confocal (figure 2B), Airyscan (figure 2C) ou par microscopie d'éclairage structurée (figure 2D). Chaque cellule est un hétérookaryon de bonne foi si elle contient à la fois des colorants violets et rouges qui se chevauchent dans le cytoplasme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li>
<li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li>
<li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li>
<li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells%3A+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Nous démontrons un protocole facile et rentable pour fusionner des cellules et visualiser l'architecture suivante des hybrides cellulaires avec la microscopie, prenant approximativement deux jours du début à la fin. Les parties critiques de ce protocole sont l'enrichissement des cellules fusionnées par tri cellulaire (section 3 du protocole) et la validation soigneuse des cellules fusionnées par microscopie (section 4 du protocole). Ces sections s'assurent que les cellules fusionnées sont facilement obtenues et sont des ...

L'entretien homéostatique de la structure cellulaire est essentiel à la vie. Les cellules ont des morphologies caractéristiques, des nombres d'organites sous-cellulaires et une composition biochimique interne. Comprendre comment ces propriétés fondamentales sont générées et comment elles tournent mal pendant la maladie nécessite des outils de laboratoire pour les perturber.
La fusion cellulaire est la fusion de deux ou plusieurs cellules distinctes. La fusion cellulaire peut avoir été essentielle à l'émergence de la vie eucaryote1. Dans le corps humain, la fusion cellulaire est relativement rare, se produisant pendant les circonstances de développement restreintes et les types de tissu, tels que pendant la fécondation ou la formation du muscle, de l'os et du placenta2. Ce protocole décrit l'induction de la fusion cellule-cellule dans les lignées cellulaires de culture de tissu avec les organites fluorescents différentiellement, comme outil pour comprendre les mécanismes contrôlant la structure et la fonction de cellules.
La fusion cellulaire induite in vitro est au cœur de la production d'anticorps monoclonaux3, un outil important pour la recherche biologique et le traitement des maladies. La fusion cellulaire a également été utilisée pour poser de nombreuses questions biologiques fondamentales différentes sur la dominance du cycle cellulaire4, aneuploidy5,6, reprogrammation cellulaire7,8, la réparation des neurones endommagés9, prolifération virale10, apoptose11, tumorigenesis12, dynamique cytosquelettique13, et fusion membranaire14,15. Méthodes basées en laboratoire pour induire la fusion cellule-cellule16,17,18,19 induire la coalescence de membrane lipidique par la fusion physique de deux bicouches en un seul. La fusion cellulaire peut être induite par l'électricité18, les méthodes virales17, chauffage thermoplasmonique20, expression transgène19, et les produits chimiques, y compris le polyéthylène glycol (PEG)16,21,22.
Les centrosomes sont des centres d'organisation de microtubules contrôlant la forme cellulaire, la motilité, la polarisation, et la division23. Les racines centrosomal sont des structures fibreuses s'étendant des centrosomes contenant la racine de protéine24 (encodée par le gène CROCC). Nous avons récemment utilisé la fusion cellule-cellule pour comprendre comment la position centrosome et le nombre varie à l'intérieur des hétérodaryons par rapport aux cellules parentales24. La raison d'être de cette méthode est de suivre la cellule d'origine des racines dans un hétérookaryon après la fusion de cellules parentales étiquetées différemment fluorescentes, et donc d'imager la fusion et la fission organelle. Les protéines fluorescentes taguées rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I sont créées par l'édition du génome dans des lignées cellulaires séparées qui sont ensuite fusionnées par la fusion cellulaire médiée par PEG. Nous décrivons l'utilisation de colorants cellulaires (Tableau des matériaux) pour identifier les cellules fusionnées par cytométrie d'écoulement et identification subséquente de microscopie de fluorescence de la cellule centrosome d'origine et de la morphologie (figure 1). Cette approche est une méthode robuste et unique pour étudier comment les changements majeurs dans l'état cellulaire, y compris le nombre d'organelles empiéter sur l'homéostasie cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>solution de formaldéhyde à 37 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 Balayage laser Microscope confocal Airyscan</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes d’imagerie à 8 puits</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Nanocorps de booster GFP d’alpaga anti-GFP Chromotek</td><td></td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD Influx Trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Filtres cellulaires (70 &mu ; m)</td><td>Biofil</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glycémie élevée, GlutaMAX, pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 nanocorps d’alpaga anti-mScarlet-I</td><td>NanoTag Biotechnologies</td><td>N1302-At565</td><td></td></tr><tr><td>L15 CO2 support d’imagerie indépendant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sans rouge de phénol, haute teneur en glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS)</td><td></td><td></td><td>8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2HPO4, dH2O jusqu’à 1 L</td></tr><tr><td>de polyéthylène glycol Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>Tensioactif non ionique</td> <td>BP151</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>détergent non ionique</td></tr></tbody></table>

fusion cellulaire du génome lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

La vie est spatialement cloisonnée dans les membranes lipidiques pour permettre la formation isolée d'états moléculaires distincts à l'intérieur des cellules et des organites. La fusion cellulaire est la fusion de deux cellules ou plus pour former une seule cellule. Ici, nous fournissons un protocole pour la fusion cellulaire de deux types de cellules différentes. Les cellules hybrides futilisées sont enrichies par le tri à base de cytométrie de flux, suivi de la microscopie de fluorescence de la structure et de la fonction des cellules hybrides. Les protéines étiquetées fluorescentes générées par l'édition du génome sont représentées à l'intérieur de cellules fusionnées, ce qui permet d'identifier les structures cellulaires en fonction de l'émission de fluorescence et de les référencer au type d'origine cellulaire. Cette méthode robuste et générale peut être appliquée à différents types de cellules ou organites d'intérêt, pour comprendre la structure cellulaire et la fonction à travers une gamme de questions biologiques fondamentales.

Les cellules correctement étiquetées sont visibles pendant la cytométrie d'écoulement par signal de fluorescence plus élevé que les cellules témoins non étiquetées (figure 2A). Les portes sont fixées pour le tri des cellules double ment positives, enrichissant cette population directement dans des plats d'imagerie pour d'autres analyses microscopiques. Les cellules futilisées sont détectables en tant que cellules distinctes à double fluoresce...

Le but de ce protocole est de fusionner deux types de cellules différents pour créer des cellules hybrides. L'analyse de microscopie de fluorescence des cellules fusionnées est employée pour suivre la cellule d'origine des organites cellulaires. Cet analyse peut être utilisé pour explorer comment la structure cellulaire et la fonction réagissent à la perturbation par fusion cellulaire.

Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Cette méthode permet de perturber la structure et la fonction cellulaires par la fusion de deux types de cellules différents pour répondre à des questions telles que la façon dont les cellules réagissent aux changements dans le nombre d’organelles. En élisant les protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules fusionnées, les structures cellulaires peuvent être référencées à leur type d’origine cellulaire pour étudier les mécanismes de l’homéostasie et de la fonction organelles. Pour l’étiquetage des colorants fluorescents, voir les populations de cellules cancéreuses humaines d’intérêt de telle sorte que chaque culture aura augmenté à au moins six fois 10 à la sixième cellule à une confluence de 70 à 90% d’ici le lendemain matin.Le jour de l’étiquetage, laver deux fois les cellules de rootletine eGFP et de rootletin-mScarlet avec 10 millilitres de PBS par lavage. Diluer le colorant violet à 500 nanomolaires dans le colorant PBS et Far Red cell à 200 nanomolar dans PBS. Étiquetez les cellules eGFP de rootletin avec le colorant dilué de cellules violettes et les cellules de rootletin-mScarlet avec le colorant dilué de globule rouge lointain pendant une minute à la température ambiante.À la fin des incubations, arrêter les réactions avec 10 millilitres de DMEM pendant cinq minutes. Lavez les deux cultures cellulaires étiquetées et une culture cellulaire parentale non étiquetée avec 10 millilitres de PBS frais avant d’incuber toutes les cultures avec un millilitre de trypsine préchaurée. À la fin de l’incubation, transférer les solutions cellulaires détachées dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres pour centrifugation et résusuer doucement les granulés étiquetés de teinture dans un millilitre de PBS et les cellules non étiquetées dans un millilitre de DMEM.Retournez ensuite tous les échantillons de cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Pour l’expérience de fusion cellulaire, mélanger 500 microlitres de colorant violet étiquetés cellules avec 500 microlitres de colorants far red étiquetés cellules dans un nouveau tube de 15 millilitres et sédimenter les cellules non mélangées restantes étiquetées par centrifugation. Resuspendez les granulés dans un millilitre de DMEM frais et placez les cellules dans l’incubateur.Recueillir les cellules mélangées par centrifugation et ajouter 700 microlitres de 50%1450 PEG d’une manière drop-wise à la pastille sur une période de 30 secondes. Après 3,5 minutes à température ambiante, ajouter 10 millilitres de DMEM sans sérum sur une période de 30 secondes et placer les tubes dans l’incubateur pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, sédimenter les cellules mélangées par centrifugation et resuspendre doucement la pastille en un millilitre de milieu complet.Pour enrichir pour la population cellulaire fusionnée par FACS, filtrez doucement toutes les cellules dans des tubes FACS individuels à travers une passoire de 70 micromètres et créez des diagrammes de dispersion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale et à la discrimination des doublets dans le logiciel de cytomètre. Exécutez les cellules non étiquetées pour enregistrer leur intensité de fluorescence et créer des barrières pour identifier les cellules fusionnées. Ensuite, exécutez les cellules étiquetées de colorant violet positif unique pour confirmer qu’il n’y a pas de débordement du signal violet dans le canal rouge lointain et les cellules étiquetées de colorant far red positif unique pour confirmer qu’il n’y a pas de signal rouge lointain dans le canal violet.Ensuite, exécutez brièvement l’échantillon de fusion pour confirmer que les cellules fusionnées sont visibles avec ces portes. Lorsque les paramètres de tri ont été définis, alignez le flux de tri centralement dans un plat d’imagerie de huit puits contenant 100 microlitres de milieu de croissance et triez les cellules fusionnées doublement positives directement dans le plat. Lorsque toutes les cellules ont été triées, placez immédiatement le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à 16 heures.Pour la coloration immunofluorescente, remplacez d’abord le supernatant de culture cellulaire par 200 microlitres de 4% de paraformaldéhyde pour une incubation de 15 minutes à température ambiante. À la fin de la fixation, laver les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS par lavage avant de perméabiliser les cellules dans 200 microlitres de 0,1% de surfactant non ionique pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique avec 200 microlitres d’albumine de sérum 3% bovin dans PBS pendant 30 minutes à température ambiante, suivi de l’étiquetage avec les anticorps d’intérêt dans 150 microlitres de tampon de coloration.Après une heure à température ambiante, laver les cellules deux fois dans 300 microlitres de PBS pendant cinq minutes par lavage. Après le dernier lavage, remplacer le lavage par 200 microlitres de PBS frais. Pour obtenir des images des cellules fusionnées, utilisez un microscope à fluorescence approprié capable d’imagerie en quatre couleurs et de recueillir des images tridimensionnelles.Les cellules dûment étiquetées sont visibles pendant la cytométrie du flux par signal fluorescent à un niveau plus élevé que les cellules de contrôle non étiquetées. Les portes peuvent être fixées pour le tri à enrichir pour la population de cellules double positif directement dans les plats d’imagerie pour une analyse microscopique plus approfondie. La fusion induit un réarrangement majeur de l’architecture cellulaire par le mélange de deux cellules en une seule.Les heterokaryons sont identifiés comme des cellules contenant les deux signaux fluorescents de colorant mélangés à l’intérieur d’une seule cellule sans intervenir dans les membranes plasmatiques. En outre, deux noyaux peuvent également être visibles dans les cellules fusionnées par imagerie Brightfield. La structure et la fonction cellulaires peuvent faire l’objet d’études plus approfondies grâce à la fusion de cellules contenant des protéines étiquetées meGFP et mScarlet.La fusion entraîne un doublement du nombre centrosome à l’intérieur des heterokaryons visibles comme au moins quatre foyers matériels péricentriolaires lorsque le composant péricentriolaire centrosome NEDD1 est étiqueté fluorescentement. La fusion des cellules avec de la rootlétine taguée de façon endogène permet d’identifier la cellule d’origine de chaque centrosome dans un hétérokaryon. Ce protocole montre comment fusionner les lignées cellulaires étiquetées différemment et comment imager leurs organites pour comprendre leur structure et leur fonction.Ce protocole robuste est à la fois relativement facile et relativement peu coûteux à exécuter par rapport à des méthodes similaires. Cette technique peut être utilisée pour poser une série de questions telles que la façon dont la fusion organelle est réglementée et comment les cellules réagissent aux changements dans le nombre d’organelles subcellulaires.

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Apprenez la fusion cellulaire pour étudier la structure et la fonction cellulaires en créant des cellules hybrides. Cette méthode utilise la microscopie à fluorescence pour suivre les organelles et analyser leur homéostasie.

Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

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