Name: Modèle in Vitro de l’angiogenèse coronaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez un modèle in vitro d'angiogenèse coronaire utilisant des cultures d'explant de sinus veineux et d'endocarde de souris embryonnaires. Cette méthode permet d'étudier les réponses cellulaires au VEGF-A et les mécanismes moléculaires de la formation vasculaire cardiaque.

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Les auteurs remercient les membres du laboratoire Sharma d’avoir fourni un environnement de recherche favorable. Nous tenons à remercier tout particulièrement Diane (Dee) R. Hoffman qui entretient et prend soin de notre colonie de souris. Nous tenons également à remercier les Drs Philip J. Smaldino et Carolyn Vann d’avoir soigneusement relu le manuscrit et d’avoir fourni des commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par des fonds du Ball State University Provost Office et du Department of Biology à B.S, des fonds de la subvention de recherche senior de l’Académie des sciences de l’Indiana à B.S. et des NIH (RO1-HL128503) et des fonds de la New York Stem Cell Foundation à K.R.

<ol><li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li>
<li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li>
<li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li>
<li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li>
<li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+Development%3A+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li>
<li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li>
<li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li>
<li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li>
<li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li>
<li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%2C+a+specific+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368(2018).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Quelques-unes des étapes les plus critiques pour la croissance réussie des vaisseaux coronaires des tissus progéniteurs SV et Endo sont : 1) Identifier correctement et isoler le tissu SV pour la culture SV ; 2) en utilisant des ventricules d’embryons âgés de 11 à 11,5 ans pour une culture précise d’Endo; 3) maintenir des conditions stériles tout au long de la période de dissection et garder les tissus froids en tout temps; et 4) garder les explants attachés à la membrane enduite ECM pour éviter que les tissus flottent da...

Les vaisseaux sanguins du cœur sont communément appelés vaisseaux coronaires. Ces vaisseaux sont composés d’artères, de veines et de capillaires. Pendant le développement, des capillaires fortement ramifiés sont établis d’abord, qui se transforment ensuite en artères coronaires et veines1,2,3,4,5. Ces capillaires initiaux sont construits à partir de cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le proépicardium, sinus venosus (SV), et endocardium (Endo) tissus1,6,7,8. SV est l’organe d’afflux de cœur embryonnaire et Endo est la doublure intérieure du lumen de coeur. Les cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le SV et l’Endo construisent la majorité de la vascularisation coronaire, tandis que le proépicardium contribue à une partie relativement faible decelui-ci 2. Le processus par lequel le réseau capillaire des vaisseaux coronaires se développe dans le cœur à partir de ses cellules précurseurs préexistantes est appelé angiogenèse coronaire. La maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde et pourtant un traitement efficace pour cette maladie fait défaut. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires détaillés de l’angiogenèse coronaire peut être utile dans la conception de thérapies nouvelles et efficaces pour réparer et régénérer les artères coronaires endommagées.
Récemment, une augmentation de notre compréhension de la façon dont les vaisseaux coronariens se développent a été en partie réalisée grâce au développement de nouveaux outils et technologies. En particulier, l’étiquetage in vivo de lignée et les technologies d’imagerie de pointe ont été très utiles pour découvrir l’origine cellulaire et les voies de différenciation des vaisseaux coronaires9,10,11,12. Malgré les avantages de ces outils in vivo, il y a des limites en termes de rapidité, de flexibilité et d’accessibilité. Par conséquent, des systèmes modèles in vitro robustes peuvent compléter les systèmes in vivo pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière à haut débit.
Ici, nous décrivons un modèle in vitro de l’angiogenèse coronaire. Nous avons développé un système de culture d’explation in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires à partir de deux tissus progéniteurs, SV et Endo. Avec ce modèle, nous montrons que les cultures d’explants de tissu in vitro cultivent des germes de vaisseau coronaires lorsqu’elles sont stimulées par le milieu de croissance. En outre, les cultures explantées se développent rapidement par rapport au contrôle lorsqu’elles sont stimulées par le facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGF-A), une protéine angiogénique très puissante. En outre, nous avons constaté que les germes angiogéniques de la culture SV subissent la dénodéliation veineuse (perte de l’expression COUP-TFII), un mécanisme similaire à l’angiogenèse SV in vivo1. Ces données suggèrent que le système de culture explantée in vitro rétablisse fidèlement les événements angiogéniques qui se produisent in vivo. Collectivement, les modèles in vitro de l’angiogenèse qui sont décrits ici sont idéaux pour sonder les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière élevée et accessible.

<table><tbody><tr><td>Boîte de culture tissulaire 100 x 20 MM</td><td>Fisher Scientific</td><td>877222</td><td>Désignée dans le protocole sous le nom de boîte de Pétri</td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>8.0 uM Inserts de culture membranaire PET</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-lapin 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Sonde métallique inclinée</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10088-15</td><td>Coudé 45 degrés, utilisé pour détecter les bouchons profonds</td></tr><tr><td>Anticorps anti-ERG 1/2/3</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anticorps anti-VE-Cadhérine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>Anticorps primaire, fabricant BD BioSciences</td></tr><tr><td>Réservoir de gaz CO2</td><td>Divers fournisseurs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>For 37 &deg ; C, 5 % CO2 Incubation</td></tr><tr><td>Dissection stéréomicrosope</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope EBM-2 milieu basal</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>Croissance des cellules endothéliales milieu basal</td></tr><tr><td>Solution ECM</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Connu commercialement sous le nom de Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Kit de supplément de cellules endothéliales microvasculaires ; Ceci est mélangé dans l’EBM-2 pour faire le milieu complet EGM-2</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Logiciel de traitement d’images (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads » target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Outils de science fine</td><td>11412-11</td><td>Utilisé pour l’embryon dissection</td></tr><tr><td>Fisherbrand Ciseaux opératoires à lame droite</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>Capot de culture tissulaire à flux laminaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>différents modèles disponibles</td><td></td></tr><tr><td>Montage Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Vectashield avec DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>Ceci est disponible à 32 %; doit être dilué à 4</td></tr> %<tr><td>Cuillère perforée</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10370-18</td><td>Utile pour retirer des embryons/tissus d’une solution</td></tr><tr><td>Murin recombinant VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>Pince standard, Dumont #5</td><td>Outils de sciences fines</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal Chambre pour souris/rats</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>Chambre d’euthanasie</td></tr></tbody></table>

modèle in vitro de l’angiogenèse coronaire

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Ici, nous décrivons un essai in vitro de culture pour étudier l’angiogenèse coronaire. Les vaisseaux coronaires nourrissent le muscle cardiaque et sont d’importance clinique. Les défauts dans ces vaisseaux représentent des risques graves pour la santé tels que dans l’athérosclérose, qui peut mener aux infarctus du myocarde et aux insuffisances cardiaques chez les patients. Par conséquent, la maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde. En dépit de son importance clinique, relativement peu de progrès ont été réalisés sur la façon de régénérer les artères coronaires endommagées. Néanmoins, des progrès récents ont été réalisés dans la compréhension de l’origine cellulaire et des voies de différenciation du développement des vaisseaux coronaires. L’avènement d’outils et de technologies qui permettent aux chercheurs d’étiqueter fluorescentement les cellules progénitrices, de suivre leur destin et de visualiser les descendants in vivo ont joué un rôle déterminant dans la compréhension du développement des vaisseaux coronaires. Les études in vivo sont précieuses, mais ont des limites en termes de vitesse, d’accessibilité et de flexibilité dans la conception expérimentale. Alternativement, des modèles in vitro précis de l’angiogenèse coronaire peuvent contourner ces limitations et permettre aux chercheurs d’interroger d’importantes questions biologiques avec rapidité et flexibilité. L’absence de systèmes modèles in vitro appropriés peut avoir entravé les progrès dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance des vaisseaux coronaires. Ici, nous décrivons un système de culture in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires du sinus venosus (SV) et de l’endocardium (Endo), les deux tissus progéniteurs à partir desquels de nombreux vaisseaux coronaires surgissent. Nous avons également confirmé que les cultures récapitulent avec précision certains des mécanismes in vivo connus. Par exemple, nous montrons que les germes angiogéniques dans la culture de SV déréglementent l’expression COUP-TFII semblable à ce qui est observé in vivo. En outre, nous montrons que VEGF-A, un facteur angiogénique bien connu in vivo, stimule vigoureusement l’angiogenèse des cultures SV et Endo. Collectivement, nous avons conçu un modèle précis de culture in vitro pour étudier l’angiogenèse coronaire.

Une des caractéristiques les plus frappantes de l’angiogenèse SV in vivo est qu’il suit une voie spécifique et implique la dénduisation cellulaire et les événements de redifferentiation qui se produisent à des moments stéréotypés et les positions1. Au fur et à mesure que les cellules SV initiales se développent sur le ventricule cardiaque, elles cessent de produire des marqueurs veineux tels que LE COUP-TFII(figure 7). Par la suite, le...

Des modèles in vitro d’angiogenèse coronaire peuvent être utilisés pour la découverte des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire. Les cultures d’explantation in vitro des tissus sinus venosus et endocardium montrent une croissance robuste en réponse au VEGF-A et affichent un modèle similaire d’expression DEMENT-TFII comme in vivo.

Modèle in Vitro de l’angiogenèse coronaire

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Notre protocole est significatif parce qu’il permet aux chercheurs d’étudier le mécanisme moléculaire de l’angiogenèse coronaire en dehors d’un organisme. Le principal avantage de cette technique est qu’elle modèle avec précision le processus d’angiogenèse coronaire à l’intérieur d’un organisme, facilitant l’étude des mécanismes de l’angiogenèse coronaire. Commencez par pulvériser une souris enceinte portant des embryons de jour 11,5 embryons avec 70% d’éthanol.Soulevant la peau sur le ventre avec des forceps, utilisez des ciseaux pour faire une peau abdominale et une incision péritonéale latéralement et antérieurement jusqu’au diaphragme pour exposer la corne utérine. Saisir l’utérus, couper le tissu librement et retirer la corne utérine. Placez la chaîne d’embryons dans le PBS stérile glacé sous un microscope stéréo, et épluchez le muscle utérin, le sac de jaune, et le couvercle d’amnion de chaque embryon.Au fur et à mesure que chaque embryon est isolé, utilisez une cuillère perforée pour transférer les tissus dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS stérile sur la glace. Pour récolter le tissu cardiaque embryonnaire, transférez le premier embryon à être disséqué dans une nouvelle boîte de Pétri sous le microscope, et placez l’embryon dans le côté ventral vers le haut. Utilisez des forceps fins pour faire une petite incision dans la poitrine, légèrement au-dessus du diaphragme, et insérez les forceps fermés dans l’incision pour agrandir l’incision.En utilisant les forceps pour maintenir la paroi thoracique ouverte pour exposer le cœur et les poumons, utilisez une deuxième paire de forceps pour déplacer doucement le cœur antérieurement 90 degrés pour exposer l’aorte dorsale et la veine. Puis, saisissant ces vaisseaux à la base du cœur, retirez soigneusement le cœur et les poumons antérieurement et rincez les tissus avec du PBS froid. Lorsque tout le tissu cardiaque a été récolté, placez les échantillons cardiaques sous le microscope et retirez les lobes pulmonaires de chaque cœur.Orientez le premier cœur sur son côté dorsal, et en tenant le cœur à sa base, utilisez des forceps fins pour gratter les atrias gauche et droite dans le tissu adjacent entourant le SV du cœur. Pour isoler le SV, orientez le côté dorsale du cœur vers le haut. Retirez soigneusement le SV du cœur et utilisez une pipette de transfert stérile pour placer le tissu isolé dans une nouvelle boîte de Petri de six centimètres contenant du PBS stérile glacé sur la glace.Pour isoler l’ensemble des ventricules, retirez le tractus sortant et utilisez une nouvelle pipette de transfert stérile pour placer les ventricules dans une boîte de Petri séparée de six centimètres contenant du PBS stérile glacé sur la glace. Pour mettre en place des cultures de SV et de ventricules entiers, enduire d’abord les membranes d’un insert de culture PET de huit micromètres pore par puits d’une plaque de culture de puits de 24 puits, avec 100 microlitres de matrice extracellulaire fraîchement diluée par culture pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque la matrice s’est solidifiée, utilisez une pipette de transfert pour transférer une explantation sur chaque insert et déplacez la plaque au microscope.À l’aide de forceps propres, placez les explants au centre de chaque insert pour s’assurer qu’ils ne sont pas fixés aux parois latérales, et retirez soigneusement tout PBS supplémentaire. Ensuite, transférez la plaque avec le couvercle fermé sous un capot de culture de tissu d’écoulement laminaire, et ajoutez 100 microlitres de milieu complet préchauffé à chaque insert, et 200 microlitres au puits au-dessous de chaque insert. Ajouter ensuite 300 microlitres de PBS à tous les puits inutilisés, et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours.Pour le traitement VEGF-A le deuxième jour de la culture, retirez le milieu des deux chambres de chaque culture et ajoutez 100 microlitres de PBS à chaque insert, et 200 microlitres de PBS à chaque puits. Après avoir tourbillonné la plaque à quelques reprises, remplacer le PBS par 300 microlitres de milieu basal complété par 1% de sérum bovin fœtal pour démarrer les cultures, et retourner la plaque à l’incubateur. Le troisième jour après la famine, ajouter 300 microlitres de milieu basal frais plus sérum aux puits de contrôle et au milieu basal plus 50 nanogrammes par millilitre de VEGF-A aux puits de traitement, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.Le sixième jour de la culture, laver les chambres avec PBS comme démontré, et fixer les cultures avec 200 microlitres de 4% paraformaldéhyde dans chaque puits, et 100 microlitres de fixatif dans chaque insert. Après 20 minutes à 4 degrés Celsius avec basculement, laver les cultures avec 300 microlitres de PBS pendant 10 minutes par lavage avec basculement à température ambiante. Après le dernier lavage, ajouter 300 microlitres de solution d’anticorps primaires aux puits et des inserts pour une culture nocturne à quatre degrés Celsius avec basculement.Le lendemain matin, lavez les cultures 10 fois dans du surfactant non ionique en PBS avec du basculement, en changeant la solution de lavage toutes les 10 minutes avant d’étiqueter les cultures avec 300 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué fluorophore approprié à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec le basculement. Le lendemain, lavez les cultures 10 fois en PBS frais avec du surfactant non ionique comme démontré. Après le dernier lavage, utilisez des forceps fins pour peler soigneusement la membrane de chaque insert et placer les membranes sur des glissières individuelles au microscope en verre, explanter le côté vers le haut.Couvrez les échantillons avec le milieu de montage complété par DAPI dans un glissement de couverture, et scellez les bords des glissements de couverture avec le vernis à ongles clair. Lorsque le vernis à ongles a séché, imagez les diapositives par microscopie confoccale. Comme les cellules SV initiales se développent sur le ventricule cardiaque, elles cessent de produire des marqueurs veineux tels que Coup-TF2.Après cinq jours de culture, les cellules endothéliales SV poussent et migrent sur la membrane. Comme dans le cœur embryonnaire, l’expression coup-TF2 est réduite à mesure que les vaisseaux migrent loin du SV. Les cultures stimulées par vegf-A présentent une croissance accrue des germes angiogéniques à la fois en densité et en longueur. D’autres cultures de SV stimulées par VEGF-A démontrent une augmentation presque triple de la longueur de pousse comparée aux contrôles, suggérant que les pousses endothéliales du SV et de l’endocardium répondent au VEGF-A.Il est important de ne pas perdre le tissu SV tout en tirant le cœur et les poumons, en enlevant les atria, et en nettoyant le tissu adjacent entourant le SV. Des expériences d’imagerie en direct peuvent être réalisées pour visualiser l’angiogenèse coronaire et pour capturer les détails de la dynamique cellulaire et moléculaire pendant le processus. Cette technique est extrêmement utile pour évaluer les mécanismes moléculaires potentiels de l’angiogenèse coronaire et comme système modèle pour étudier l’angiogenèse en général.

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Le dosage de co-culture anneau aortique : Un outil pratique pour évaluer le potentiel angiogénique de cellules stromales mésenchymateuses In Vitro

Cette présente protocole une perle roman in vitro d’analyse que plus modèles convenablement le processus d' in vivo la germination de l’angiogenèse en incorporant des péricytes. Cette modification permet le dosage de la perle à récapituler plus fidèlement les interactions cellulaires hétérotypiques entre cellules endothéliales et murales qui sont essentiels pour l’angiogenèse.

Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination

Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.

In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments

La méthode présentée ici permet d’évaluer l’effet des réactifs sur l’angiogenèse ou la perméabilité vasculaire in vivo sans coloration. La méthode utilise l’injection de dextran-FITC via la veine de la queue pour visualiser les néo-vaisseaux ou les fuites vasculaires.

Essai de bouchon de gel matriciel in vivo modifié pour les études d’angiogenèse

L’angiogenèse germinative, fondamentale pour le développement et la maladie, implique des processus moléculaires et mécaniques complexes. Nous présentons un modèle 2,5D ex vivo polyvalent qui analyse la germination cellulaire des artères carotides porcines, révélant l’angiogenèse dépendante de la rigidité et la mécanique cellulaire distincte leader-follower. Ce modèle aide à faire progresser les stratégies d’ingénierie tissulaire et les approches de thérapie contre le cancer.

Modèle 2.5D pour la caractérisation mécanique ex vivo de l’angiogenèse germinative dans les tissus vivants

Découvrez un modèle in vitro d'angiogenèse coronaire utilisant des cultures d'explant de sinus veineux et d'endocarde de souris embryonnaires. Cette méthode permet d'étudier les réponses cellulaires au VEGF-A et les mécanismes moléculaires de la formation vasculaire cardiaque.

Modèle in Vitro de l’angiogenèse coronaire

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