Name: Production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Découvrez la fabrication de polybilles pour la livraison de vaccins avec libération retardée et stabilité améliorée des cargaisons. Cette méthode utilise des polyesters pour optimiser la distribution des vaccins dans les pays en développement.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier le Dr Bryan E. Tomlin affilié au laboratoire d’analyse élémentaire du département de chimie de TAMU qui a participé à l’analyse de l’activation des neutrons (NAA).

1. Synthèse du triacrylate de polycaprolacyone (PCLTA)
<ol><li>Sécher 3,2 ml de 400 Da polycaprolacyone (PCL) triol toute la nuit à 50 °C dans une fiole ouverte de 200 mL de fond rond et K2CO3 dans un flacon en verre à 90 °C.</li>
	<li>Mélanger le triol avec 6,4 mL de dichlorométhane (DCM) et 4,246 g de carbonate de potassium (K2CO3)sous l’argon.</li>
	<li>Mélanger 2,72 ml de chlorure d’acryloyle dans 27,2 ml de DCM et ajouter le mélange de réaction dans la fiole sur 5 min.</li>
	<li>Couvrir le mélange de réaction de papier d’aluminium et le laisser tranquille à température ambiante pendant 24 h sous l’argon.</li>
	<li>Après 24 h, filtrer le mélange de réaction à l’aide d’un papier filtre sur un entonnoir Buchner sous vide pour jeter l’excès de réactifs.</li>
	<li>La filtrate précipitée de l’étape 1.5 qui contient le polymère encapped dans l’éther diéthylique dans un 1:3 (vol/vol) et le rotovape à 30 °C pour enlever l’éther de diéthyle.</li>
</ol>2. Formation de la polybulle
REMARQUE : L’injection de polymère dans l’eau déionisée (DI) entraînerait la migration des polybulles vers le fond du flacon, ce qui entraînerait un aplatissement du fond. Utilisez 10 % (wt/vol) de cellulose de carboxyméthyle (CMC) remplir le flacon de verre à la place pour éviter l’aplatissement de polybulote.
<ol><li>Préparer une solution CMC à 10 % (wt/vol) dans l’eau di.</li>
	<li>Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 0,8 mL de 10 % de CMC à l’aide d’un tuyau de transfert de 1 mL.</li>
	<li>Mélanger 1000 mg/mL de 14 kDa PCL en DCM et synthétiser pclta dans un 1:3 (vol/vol) pour un volume total de 200 μL ou préparer 200 μL de 1000 mg/mL de 5 kDa poly (acide lactique-co-glycolique) diacrylate (PLGADA) en chloroforme.</li>
	<li>Mélanger le mélange 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-méthylpropiophénone (photoinitiator) avec le mélange polymère (PLGADA ou PCL/PCLTA) en 0,005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Charger 200 μL de mélange polymère dans une seringue en verre de 1 mL montée sur une pompe à seringues reliée à un tube en acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.</li>
	<li>Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère pour injecter du polymère dans le CMC à 10 % dans le flacon en verre pour former le polybulle.</li>
	<li>Soignez les polybulles sous ultraviolet (UV) à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm2.</li>
	<li>Geler les polybulles dans l’azote liquide et lyophiliser pendant la nuit à 0,010 mBar vide et à -85 °C.</li>
	<li>Séparez les polybulles du CMC séché à l’aide de forceps et lavez les polybulles avec de l’eau DI pour éliminer tout CMC résiduel. Notez que d’autres polymères peuvent être utilisés probablement avec des modifications pour modifier la cinétique de libération.</li>
</ol>3. Modulation du diamètre de polybulote
<ol><li>Remplissez un flacon en verre de 0,92 mL avec 10 % de CMC à l’aide d’un tuyau de transfert de 1 mL.</li>
	<li>Mélangez PCL/PCLTA dans un 1:3 (vol/vol) avec 1000mg/mL 14kDa PCL et synthétisez PCLTA. Mélanger le photoinitiator avec le mélange de polymère dans un 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Chargez le mélange de polymère dans une seringue en verre de 1 mL montée sur une pompe à seringues reliée à un tube en acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.</li>
	<li>Utilisez un micromoteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère pour injecter du polymère dans le CMC à 10 % dans le flacon en verre pour former le polybulle.</li>
	<li>Pour obtenir des polybulles de diamètres divers, varier le taux de distribution de 0,0005 à 1 μL/s.</li>
	<li>Prenez des images de la fiole avec les polybulles de diamètre variable.</li>
	<li>Utilisez ImageJ pour quantifier le diamètre des polybulles et utiliser la taille du flacon comme échelle.</li>
</ol>4. Centrement de la cargaison dans le polybulle
<ol><li>
Modulation de la viscosité PCL/PCLTA à l’aide de K2CO3: REMARQUE : La viscosité de PLGADA n’a pas à être modifiée à l’aide de K2CO3 parce que la viscosité de 5 kDa PLAGDA à 1000 mg/mL est suffisante pour le centre de la cargaison.<ol>
<li>Ajouter K2CO3 (qui a été isolé après la réaction pclta) à la PCLTA à des concentrations variables, y compris 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, et 60 mg/mL.</li>
		<li>Mesurer les viscosités dynamiques des solutions en modifiant le taux de cisaillement de 0 à 1000 1/s à l’aide de la rhéométrie.</li>
		<li>Injecter manuellement la cargaison au milieu (voir l’étape 4.2 pour préparer le mélange de cargaison) des polybulles qui ont été formés à l’aide des solutions PCL/PCLTA avec différentes concentrations de K2CO3 (étape 4.1.1). Déterminer la concentration optimale de K2CO3 en observant quelle solution de l’étape 4.1.1 peut entraîner la rétention de la cargaison au milieu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centrage de la cargaison (déjà montré faisabilité avec de petites molécules) avec CMC
	<ol>
<li>Mélanger la cargaison avec 5 % (wt/vol) CMC dans un rotateur pendant la nuit afin d’augmenter la viscosité de la cargaison.</li>
		<li>Injecter manuellement 2 μL de mélange de cargaison dans la polybulle et procéder à un traitement UV à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm2.</li>
		<li>Geler les polybulles en azote liquide pendant 30 s et lyophiliser pendant la nuit à 0,010 mBar vide et à -85 °C.</li>
		<li>Séparez les polybulles du CMC séché à l’aide de forceps et lavez-les avec de l’eau DI pour enlever tout CMC résiduel.</li>
		<li>Couper la polybulle en deux et imager les moitiés à l’aide de la microscopie confocale pour vous assurer que la cargaison est centrée (voir l’étape 6 pour les longueurs d’onde d’excitation et d’émission utilisées).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Formulation de cargaison
REMARQUE : La formulation de polybulbble peut abriter divers types de cargaison, y compris de petites molécules, des protéines, et des acides nucléiques.
<ol><li>Sur la base d’études antérieures, dans le cas de la cargaison de protéines, utiliser des excipients, y compris le polyéthylène glycol (PEG)6, la polyvinylpyrroidone (PVP), et les glycopolymères6 pour améliorer la stabilité des protéines pendant la formulation de polybulble.</li>
	<li>Former des polybulles basés sur le protocole à l’étape 2.</li>
	<li>Préparer la solution d’antigène en ajoutant 17,11 g de tréhalose à 625 μL d’antigène gp120/41 du VIH.</li>
	<li>Injecter manuellement 1 μL de solution d’antigène au milieu de la polybulle.</li>
	<li>Ouvrez les polybulles les jours 0, 7, 14 et 21, et enregistrez la fluorescence de l’antigène avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission 497 nm et 520 nm, respectivement.</li>
	<li>Déterminer la fonctionnalité de l’antigène à l’aide d’un test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) et utiliser 5 % de lait non gras comme tampon de blocage.</li>
</ol>6. Libération de la cargaison
REMARQUE : Une petite molécule ou un antigène peut être utilisé comme type de cargaison
<ol><li>
Petite molécule
	<ol>
<li>Incuber des polybulles avec de l’acriflavine centrée dans 400 μL de saline tampon de phosphate (PBS) à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C, 70 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA. REMARQUE : La raison pour laquelle nous recommandons de tester au-dessus de la température corporelle est de simuler la température (50 °C) à laquelle la polybulle atteint tout en laserant les nanorods d’or (AuNRs) dans PCL et PLGA; b) accélérer le processus de dégradation du PCL (50 °C, 70 °C).</li>
		<li>À chaque point de temps, recueillir les supernatants et remplacer par 400 μL de PBS frais.</li>
		<li>Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier les intensités de fluorescence dans les supernatants recueillis. REMARQUE : Utilisez ex/em de 416 nm/514 nm pour l’acriflavine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antigène
	<ol>
<li>Incuber des polybulbulles avec sérum d’albumine bovine centré (BSA)-488 en 400 μL de PBS à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PLGADA et à 37 °C, 50 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA.</li>
		<li>À chaque point de temps, recueillir les supernatants et remplacer par 400 μL PBS frais.</li>
		<li>Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier les intensités de fluorescence dans les supernatants recueillis. Utilisez ex/em de 497 nm/520 nm pour BSA-488. REMARQUE : L’étude de libération à 70 °C pour les polybulbulles PCL/PCLTA ne doit pas être menée pour éviter d’exposer l’antigène à des températures extrêmes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Toxicité
<ol><li>
Quantification de la teneur en chlore dans les polybulles à l’aide de l’analyse d’activation des neutrons (NAA)
	<ol>
<li>Utilisez des polybulles qui ont été lyophilisés pendant 2, 4, 6, 20 et 24 h pour cette étude à 0,010 mBar vide et à -85 °C.</li>
		<li>Mesurez 5 à 9 mg de polybulles et placez-les sur des flacons d’irradiation LDPE.</li>
		<li>Préparer 1000 g/mL de solution d’étalonnage du chlore à partir de la solution d’étalonnage traçable de l’Institut national des normes et de la technologie (NIST).</li>
		<li>Utiliser le réacteur Triga de 1 mégawatt pour effectuer des irradiations de neutrons sur chaque échantillon à un taux de fluence neutronique de 9,1 ×10 12 /cm2·s pour 600 s.</li>
		<li>Transférer les polybulles dans des flacons non irradiés.</li>
		<li>Utilisez le détecteur HPGe pour obtenir des spectres de rayons gamma pendant 500 s après 360 s intervalles de décomposition.</li>
		<li>Utilisez le logiciel NAA de canberra Industries pour analyser les données.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantification de la teneur en chlore libérée par les polybulles à l’aide de NAA
	<ol>
<li>Incuber des polybulles qui ont été lyophilisés pendant la nuit (à 0,010 mBar vide et à -85 °C) dans 400 μL de PBS à 37 °C.</li>
		<li>Recueillir les supernatants aux semaines 1, 2 et 3 après incubation.</li>
		<li>Analyser les supernatants pour la teneur en chlore à l’aide de NAA en utilisant la même méthode que celle décrite ci-dessus à l’étape 7.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. AuNR Synthesis par Kittler, S., et al.8
<ol><li>Préparer la solution d’ensemencement AuNR en mélangeant 250 μL d’acide chloroaurique de 10 m MM (HAuCl4),7,5 mL de bromure de cétrimonium de 100 mM (CTAB) et 600 μL de 10 m M de borohydrure de sodium glacée (NaBH4).</li>
	<li>Préparer la solution de croissance en mélangeant 40 ml de CTAB de 100 mM, 1,7 mL de 10 mM HAuCl4,250 μL de nitrate d’argent (AgNO3)et 270 μL de 17,6 mg/mL d’acide ascorbique à un tube.</li>
	<li>Mélanger vigoureusement 420 μL de solution de semences avec la solution de croissance à 1200 tr/min pendant 1 min. Ensuite, laissez le mélange tranquille pour réagir pendant 16 h.</li>
	<li>Retirer l’excédent de réactifs du mélange en centrifuge à 8000 × g pendant 10 min et jeter le supernatant.</li>
</ol>9. Hydrophobicization of AuNRs par Soliman, M.G., et coll.9
<ol><li>Ajuster le pH de 1,5 mL d’AuNR synthétisés ctab-stabilisés à 10 à l’aide d’hydroxyde de sodium de 1 mM (NaOH).</li>
	<li>Remuer la solution avec 0,1 mL de 0,3 m M de PEG méthylé (mPEG) thiol à 400 tr/min pendant la nuit.</li>
	<li>Mélanger les auNRs PEGylated avec 0,4 M de dodécylamine (DDA) en chloroforme à 500 tr/min pendant 4 jours.</li>
	<li>Pipet la couche organique supérieure contenant des auNR hydrophobes et stocker à 4 °C jusqu’à l’utilisation future.</li>
</ol>10. NIR-activation des polybulles
<ol><li>Mélanger la solution polymère (PLGADA ou PCL/PCLTA) avec des AuNR hydrophobes dans un 1:9 (vol/vol).</li>
	<li>Ajouter le photoinitiator au mélange polymère-AuNR dans un 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Former des polybulles en injectant le mélange polymère-AuNR dans un flacon en verre de 0,92 mL avec 10 % de CMC (wt/vol) (voir l’étape 2).</li>
	<li>Soignez les polybulles à 254 nm de longueur d’onde pendant 60 s à 2 W/cm2.</li>
	<li>Gel éclair dans l’azote liquide pendant 30 s et lyophiliser pendant la nuit à 0.010 mBar vide et à -85 °C.</li>
	<li>Séparez les polybulles séchés à l’aide de forceps et lavez-les avec de l’eau DI pour enlever tout CMC résiduel.</li>
	<li>Incuber les polybulles dans 400 μL de PBS à 37 °C.</li>
	<li>Activez les polybulles à l’aide du laser NIR 801 nm à 8A pendant 5 minutes tous les lundis, mercredis et vendredis.</li>
	<li>Prenez des images infrarouges (FLIR) prospectives de la polybulle avant et après l’activation laser pour obtenir des valeurs de température.</li>
	<li>Calculez les différences de température entre l’activation au laser avant et après en fonction des valeurs de température des images FLIR.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).</li>
<li>Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Hydroxycinnamate+for+sequential+photouncaging+of+two+different+functional+groups+and+its+application+in+releasing+cosmeceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Dai, C., Wang, B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+peptide+and+protein+drugs+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).</li>
<li>Souery, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+and+quantifying+the+stability+of+amino+acid-based+cargo+within+polymeric+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems.</a> Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Advanced protein formulations.</a> Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultraviolet-curable%2C+core-shell+vaccine+formed+via+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).</li>
<li>Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+and+Fast+Phase+Transfer+of+CTAB+Stabilised+Gold+Nanoparticles+from+Water+to+Organic+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Physikalische+Chemie%22%5BJournal%5D)">Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase.</a> Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235(2015).</li>
<li>Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Transfer+and+Polymer+Coating+Methods+toward+Improving+the+Stability+of+Metallic+Nanoparticles+for+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications.</a> Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).</li>
<li>Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoengineered+Light-Activatable+Polybubbles+for+On%3FDemand+Therapeutic+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery.</a> Adv. Funct. Mater. , 2003579(2020).</li>
<li>Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+and+delayed+release+of+lysozyme+from+ointment-like+poly%28ortho+esters%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters).</a> Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability%2C+stabilization%2C+and+formulation+of+liquid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals.</a> International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).</li>
<li>Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28epsilon-caprolactone%29+and+poly+%28L-lactic-co-glycolic+acid%29+degradable+polymer+sponges+attenuate+astrocyte+response+and+lesion+growth+in+acute+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury.</a> Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).</li>
<li>Davoodi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems+for+programmed+and+on-demand+release%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems for programmed and on-demand release.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).</li>
<li>Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+laser+intensity+activated+plasmonic+gold+nanoparticle-generated+photothermal+effects+on+cellular+morphology+and+viability%3A+a+real-time%2C+long-term+tracking+and+monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).</li>
<li>Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+Shape+Changes+of+Colloidal+Gold+Nanorods+Using+Femtosecond+and+Nanosecond+Laser+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Technologies et défis actuels Les microparticules à base d’émulsion et les nanoparticules ont été couramment utilisées comme vecteurs de livraison de médicaments. Bien que la cinétique de libération de la cargaison de ces dispositifs ont été largement étudiées, le contrôle de la cinétique de libération d’éclatement a été un défi majeur11. La polyvalence et la fonctionnalité du fret sont également limitées dans les systèmes à base d’émulsion en raison de l’exposition de la carga...

Une couverture vaccinale limitée entraîne la mort de 3 millions de personnes causées spécifiquement par des maladies évitables par la vaccination1. Les conditions de stockage et de transport inadéquates entraînent le gaspillage de vaccins fonctionnels et contribuent ainsi à réduire la vaccination mondiale. En outre, la vaccination incomplète due au non-respect des calendriers vaccinaux requis entraîne également une couverture vaccinale limitée, en particulier dans les pays en développement2. Plusieurs visites au personnel médical sont nécessaires dans la période recommandée pour recevoir des vaccins de rappel, limitant ainsi le pourcentage de la population avec la vaccination complète. Par conséquent, il est nécessaire d’élaborer de nouvelles stratégies pour la livraison contrôlée de vaccins afin de contourner ces défis.
Les efforts actuels pour développer des technologies de livraison de vaccins comprennent des systèmes polymériques à base d’émulsion3,4. Toutefois, la cargaison est souvent exposée à une plus grande quantité de solvant organique qui peut potentiellement provoquer l’agrégation et la dénaturation, en particulier dans le contexte de la cargaison à base de protéines5,6. Nous avons mis au point une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins, « polybulles », qui peut potentiellement abriter plusieurs compartiments de chargement tout en minimisant le volume de cargaison qui est exposé au solvant7. Par exemple, dans notre plate-forme en coquille de noyau polybulle, une poche cargo de diamètre 0,38 mm (SEM) est injectée au centre d’une polybulle de 1 mm. Dans ce cas, la surface de la cargaison exposée au solvant organique serait d’environ 0,453 mm2. Après avoir examiné la densité d’emballage des sphères (microparticules) dans une sphère (dépôt de cargaison), le volume réel de microparticules (10 μm de diamètre) pouvant tenir dans le dépôt est de 0,17 mm3. Le volume d’une microparticule est de 5,24x10-8 mm3 et donc le nombre de particules microparticules pouvant s’adapter au dépôt est de ~3,2x106 particules. Si chaque microparticule a 20 poches de cargaison (à la suite d’une double émulsion) de 0,25 μm de diamètre, alors la surface de la cargaison exposée au solvant organique est de 1274 mm2. Le dépôt de marchandises dans la polybulle aurait donc une surface inférieure d’environ 2 800 fois moins exposée au solvant organique que celle de la cargaison organique exposée aux solvants dans les microparticules. Notre plate-forme à base de polyester peut ainsi réduire potentiellement la quantité de marchandises exposées au solvant organique qui peut autrement causer l’agrégation et l’instabilité du fret.
Les polybulles sont formés sur la base du principe de séparation de phase où le polyester en phase organique est injecté dans une solution aqueuse résultant en une bulle sphérique. La cargaison dans la phase aqueuse peut alors être injectée au centre de la polybulle. Une autre soute peut potentiellement être réalisée dans le polybulbble en mélangeant une cargaison différente avec la coque en polymère. Le polybulle à ce stade sera malléable et sera ensuite guéri pour aboutir à une structure solide polybulle avec la cargaison au milieu. Les polybulles sphériques ont été choisis plutôt que d’autres formes géométriques pour augmenter la capacité de chargement dans le polybulbble tout en minimisant la taille globale du polybulle. Les polybulles avec la cargaison dans le centre ont été choisis pour démontrer la libération retardée d’éclatement. Les polybulles ont également été incorporés avec l’agent proche infrarouge (NIR) - sensible (c’est-à-dire l’onduler) agent, à savoir les nanorods d’or (AuNR), pour provoquer une augmentation de la température des polybulles. Cet effet pourrait potentiellement faciliter une dégradation plus rapide et pourrait être utilisé pour contrôler la cinétique dans les applications futures. Dans cet article, nous décrivons notre approche pour former et caractériser les polybulbbles, pour obtenir la libération retardée d’éclatement des polybulbulles, et pour incorporer AuNR dans les polybulles pour causer nir-activation.

<table><tbody><tr><td>Solution de substrat en 1 étape Ultra Tétraméthylbézidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Solution de substrat</td><td>Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-2-méthylpropiophénone</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>450 nm Solution d’arrêt pour substrat TMB</td><td>Abcam</td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’acryloyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A24109-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acriflavine</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>Éther éthylique anhydre</td><td>Fisher Chemical</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-VIH1 gp120 conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-CF488 conjugués de colorants</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Acide bromosalicylique</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyméthylcellulose (CMC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de centrimonium (CTAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemical</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’enrobage</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane (DCM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Fisher Chemical</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>Dodéacylamine</td><td>Acros Organics</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de doxorubicine</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Acros Organics</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Pompe à seringue</td><td>KD Scientific</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEG thiol</td><td>Laysan Bio</td><td>NC0702454</td> Lait écrémé en poudre Andwin Scientific NC9022655 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de potassium</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Tampon salin phosphate</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>(Poly(caprolactone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr><tr><td>(Poly(caprolactone) triol</td><td>Acros Organics</td><td>AC190730250</td><td></td></tr><tr><td>Diacrylate de poly (acide lactique-co-glycolique)</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de potassium</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant HIV1 gp120 + gp41</td><td>protéine Abcam</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent</td><td>Acros Organics</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydrure</td><td>Fisher Chemical</td><td>S678 10</td><td></td></tr><tr><td>Acide tétrachloroaurique</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54 1</td><td></td></tr><tr><td>Tréhalose</td><td>Acros Organics</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Triéthylamine</td><td>Acros Organics</td><td>AC157910010</td><td></td></tr></tbody></table>

production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Les stratégies de livraison de vaccins qui peuvent limiter l’exposition de la cargaison au solvant organique tout en permettant de nouveaux profils de diffusion sont cruciales pour améliorer la couverture vaccinale dans le monde entier. Ici, une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins injectables, ultraviolets et retardés, appelée polybulles. La cargaison a été injectée dans des polybulles à base de polyester qui ont été formés dans 10% de solution aqueuse à base de carboxyméthycellulose. Ce document comprend des protocoles pour maintenir la forme sphérique des polybulles et optimiser le placement et la rétention de la cargaison afin de maximiser la quantité de cargaison dans les polybulles. Pour assurer la sécurité, la teneur en solvants chlorés dans les polybulles a été analysée à l’aide d’une analyse d’activation des neutrons. Des études de libération ont été menées avec de petites molécules comme cargaison dans le polybulle pour confirmer la libération retardée d’éclatement. Pour montrer davantage le potentiel de livraison à la demande de la cargaison, les nanorods d’or ont été mélangés dans la coque polymère pour permettre l’activation laser proche infrarouge.

Les polybulles ont été largement caractérisés à l’aide de SEM et de NAA. Cargo a été centré avec succès pour entraîner un dégagement retardé. Les polybulles ont également été activés avec succès au laser en raison de la présence d’AuNRs dans les polybulles.
Caractérisation des polybulles Les polybulles injectées dans une solution aqueuse sans CMC ont donné lieu à une polybulille aplatie en raison de leur cont...

Cet article décrit les protocoles utilisés pour produire une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins, « polybulles », pour permettre la libération retardée. Des polyesters, y compris le poly (acide lactique-co-glycolique) et la polycaprolactone, ont été utilisés pour former les polybulles et de petites molécules et antigènes ont été utilisés comme cargaison.

Production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...

Ce protocole peut aider à maintenir la stabilité de la cargaison, qui peut être à la fois de petites molécules et des protéines, grâce à l’utilisation du polybubble, qui peut à son tour réduire les interactions de carbone avec le solvant. Cette nouvelle technique peut être utilisée pour améliorer la couverture vaccinale dans les pays en développement, car les fonctionnalités vaccinals peuvent souvent être compromises en raison de l’inefficacité des installations de transport et de stockage. Pour fabriquer les polybubbles, utilisez d’abord une pipette de transfert d’un millilitre pour ajouter 800 microlitres de 10% CMC dans un flacon de verre de 0,92 millilitre.Pour synthétiser pclta, mélanger 1000 grammes par millilitre de 14 kilodalton PCL dans 200 microlitres de DCM. Pour synthétiser plgada, mélanger 1000 grammes par millilitre de cinq kilodalton PLGADA en 200 microlitres de chloroforme. Mélanger le photoinitiateur avec le mélange de polymère d’intérêt à un rapport de 0,005 à 1 et charger 200 microlitres de la solution résultante en une seringue en verre d’un millilitre montée sur une pompe à seringues reliée à un tube d’acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.À l’aide d’un micro moteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère, injecter le polymère dans le flacon de verre à 10 %CMC pour former les polybubbles et guérir les polybubbles sous la lumière ultraviolette à une longueur d’onde de 254 nanomètres pendant 60 secondes à deux watts par centimètre carré, puis congeler les polybubbles dans l’azote liquide pendant 30 secondes et lyophiliser les porteurs pendant la nuit à 0,01 millibar vide en moins 85 degrés Celsius. Pour le centrage de la cargaison d’intérêt dans un polybubble, mélanger la cargaison avec 5% CMC dans un rotateur pendant la nuit pour augmenter la viscosité de la cargaison avant d’injecter manuellement deux microlitres du mélange de cargaison dans le polybubble. Lorsque toute la cargaison a été injectée, re-guérir, gel flash, et lyophiliser le polybubble injecté comme vient de le démontrer.Le lendemain matin, utilisez des forceps pour séparer le polybubble du CMC séché et laver le polybubble avec de l’eau déionisée pour éliminer tout CMC résiduel. Ensuite, coupez le polybubble en deux et imagez les moitiés par microscopie confoccale pour s’assurer que la cargaison est centrée. Pour la libération de petites molécules, incuber les polybubbles avec de l’acriflavine centrée dans 400 microlitres de PBS à 37 degrés Celsius pour la longueur d’incubation appropriée.À chaque moment expérimental, recueillir le supernatant et ajouter 400 microlitres de PBS frais au flacon. Ensuite, utilisez un lecteur de plaque pour quantifier l’intensité de fluorescence du supernatant recueilli. Pour l’activation proche infrarouge, mélanger la solution polymère avec des nano tiges hydrophobes d’or à un rapport d’un à neuf et ajouter l’initiateur photo à un rapport de 0,005 à 1.Injecter le mélange résultant dans un flacon de verre de 0,92 millilitre contenant 800 microlitres de 10% CMC et guérir les polybobbles sous la lumière ultraviolette comme démontré. Après le gel flash et la lyophilisation comme démontré, laver les polybubbles avec de l’eau déionisée et incuber les porteurs dans 400 microlitres de PBS à 37 degrés Celsius pour la période d’incubation appropriée. À la fin de l’incubation, obtenir une image infrarouge prospective du polybubble avant et après l’activation des polybubbles avec un laser proche infrarouge de 801 nanomètres à huit amplis pendant cinq minutes trois fois par semaine pendant quatre semaines pour les polybobbles PLGADA et 14 semaines pour les polybobbles PCL-PCLTA.À chaque moment expérimental, recueillir le supernatant et ajouter 400 microlitres de PBS frais au flacon. Calculez ensuite les différences de température entre les polybubbles avant et après l’activation laser en fonction des valeurs de température des images infrarouges prospectives. L’ajout d’une solution aqueuse à base de 10 % de CMC entraîne une suspension complète en polybubble pour un entretien réussi de la sphérique polybubble.L’injection de cargaison dans le polybubble en l’absence de CMC entraîne une fuite et un manque conséquent de rétention de la cargaison dans le polybubble. Pour remédier à cette fuite, la viscosité de la PCLTA peut être augmentée à l’aide de carbonate de potassium isolé après le plafonnement final du polycaprolactone avec du triacrylate et la viscosité de la cargaison peut être augmentée en mélangeant la cargaison avec 5% CMC. La viscosité des polybobbles PLGADA est suffisante pour faciliter le centrage de la cargaison et ne nécessite pas de modulation par carbonate de potassium.Notez qu’aucune différence statistiquement significative dans l’efficacité contraignante de l’anticorps n’est observée après avoir mélangé l’antigène VIH gp120/41 avec et sans tréhalose avant l’injection de polybubble. Des rejets d’éclatement retardés sont observés dans les polybobbles PLGADA avec acriflavine au milieu le jour 19 pour les polybubbles incubés à 37 degrés Celsius et le cinquième jour pour les polybubbles incubés à 50 degrés Celsius. En outre, les polybobbles PLGADA et les polybobbles PCL et PCLTA contenant des nano tiges d’or peuvent être activés avec succès au laser plusieurs fois.Lors de la formation des polybubbles, s’il vous plaît prendre soin de protéger les reagents de la lumière et aussi d’utiliser les solutions immédiatement. Après avoir développé cette technologie, nous avons également voulu explorer l’automatisation de ce processus à l’échelle de la production de polybubble.

production-near-infrared-sensitive-core-shell-vaccine-delivery

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit une procédure générale pour l'étude de liaison au récepteur recombinant domaine (RBD) basé vaccins sous-unitaires contre le SRAS. Il inclut des méthodes pour la transfection et l'expression des protéines dans les cellules 293T RBD, l'immunisation de souris avec RBD et la détection de l'activité de neutralisation de sérums de souris en utilisant un dosage établie SRAS neutralisation pseudovirus.

Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

Cette vidéo présente une méthode permettant de générer des vaccins multivalents à vésicules de membrane externe (OMV). Des cellules de mammifères sont transfectées pour exprimer et sécréter des antigènes viraux fusionnés à un SpyTag et à un marqueur de polyhistidine. Ces antigènes sont ensuite purifiés à l’aide d’une colonne d’affinité d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA). L’antigène purifié est mélangé à des vésicules de membrane externe exprimant la protéine SpyCatcher (SC) liée à la...

Génération d’un vaccin multivalent à vésicules de la membrane externe

Cette vidéo présente une méthode de génération d’une bulle de polymère ou d’une nouvelle plateforme à base de polybulles qui permet une libération en rafale retardée. Des polymères à base de polyester sont utilisés pour former les polybulles avec une structure noyau-coquille, et de petites molécules et des antigènes peuvent être utilisés comme cargaison.

Technique permettant de générer une nouvelle plate-forme d’administration pour une libération retardée de molécules en rafale

Cette vidéo présente une méthode de génération d’un candidat vaccin à ARNm à l’aide de nanoparticules polymères. Le polymère cationique interagit avec l’ARNm chargé négativement, formant des polyplexes. La formation de polyplexes stabilise l’ARNm, ce qui en fait un candidat potentiel pour de futurs vaccins à ARNm dans des applications immunothérapeutiques.

Formulation de nanoparticules chargées d’ARNm à des fins de vaccination

Une méthode détaillée est fournie ici décrivant la purification, le repliement et la caractérisation des nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPN) pour le développement de vaccins.

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

Ce protocole décrit l’utilisation de kits commerciaux d’expression protéique acellulaire pour produire des protéines membranaires supportées dans des nanodisques qui peuvent être utilisées comme antigènes dans les vaccins sous-unitaires.

Production à l’échelle sans cellules et ajout d’adjuvant à une protéine recombinante de la membrane externe majeure de Chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin

Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2

Ici, nous présentons des méthodes détaillées pour la préparation et l’évaluation du vaccin tumoral nanoémulsion nasale auto-assemblé in vitro et in vivo.

Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Cette méthode décrit l’encapsulation de l’antigène rabique dans des microparticules polymères biodégradables ayant des propriétés structurelles et matérielles qui permettent une libération pulsatile après un délai prédéterminé. L’évaluation par dosage immunoenzymatique (ELISA) de l’antigène extrait du noyau de particules confirme la présence intacte de glycoprotéine trimérique du virus de la rage par fabrication de particules.

Fabrication de microparticules polymères pulsatiles encapsulant l’antigène antirabique

Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque (AR) encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. En ajoutant l’AR approuvé par la FDA à la nanoémulsion, la sIgA spécifique de l’antigène a été promue dans le vagin et l’intestin grêle après l’injection intramusculaire de la nanoémulsion.

Acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique en tant qu’adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’OVA

Découvrez la fabrication de polybilles pour la livraison de vaccins avec libération retardée et stabilité améliorée des cargaisons. Cette méthode utilise des polyesters pour optimiser la distribution des vaccins dans les pays en développement.

Production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale

Explorer plus de vidéos