Name: Génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Découvrez la transgenèse lentivirale chez le rat pour l'ingénierie génétique et la recherche en neurosciences. Cette méthode utilise des injections multiples de vecteurs viraux dans l'espace périvitellin de l'embryon.

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Cette étude a été soutenue par le projet ANIMOD dans le cadre du programme Team Tech Core Facility Plus de la Fondation pour la science polonaise, cofinancé par l’Union européenne dans le cadre du Fonds européen de développement régional à WK.

La production et l’application de vecteurs viraux étaient conformes aux lignes directrices du niveau 2 de la biosécurité et ont été approuvées par le ministère polonais de l’Environnement. Toutes les procédures expérimentales relatives aux animaux décrites ci-dessous ont été approuvées par le Comité local d’éthique. Les animaux étaient logés dans des cages ventilées individuellement à une température stable (21 à 23 oC) et dans une humidité (50 à 60 %) avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture dans un cycle clair/obscurité de 12 h/12 h.
1. Production vectorielle lentivirale
<ol><li>Transfection des cellules HEK 293T REMARQUE : Le protocole présenté ici est conçu pour la transfection de vingt plats de culture de 10 cm qui produit environ 200 ml de vecteur brut supernatant.<ol>
<li>Cellules heK 293T de culture dans le milieu de DMEM qui est complétée avec le sérum bovin foetal (10%, v/v) dans un incubateur humidifié de CO2 à 37 oC. Pour la transfection, préparer vingt plaques de 10 cm de diamètre et les graines de 1,5 à 2 x 106 cellules HEK 293T par plat.</li>
		<li>Lorsque la confluence atteint 70 %, transfectez les cellules à l’aide d’un réactif en polyéthylénimine (PEI), pH 7,0, à un rapport de 3 g de l’Ile-du-Prince-Édouard par 1 g d’ADN.<ol>
<li>Préparer le mélange transfection pour cinq assiettes (préparer le nombre de répétitions en fonction du nombre total de plats). À 1 mL du Medium Aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, ajoutez le mélange de trois plasmides afin qu’ils atteignent une quantité finale de 25 g de plasmid VSVg, 50 g de delta R8.2 et 50 g de plasmide codant.</li>
			<li>Pipette de haut en bas, et ajouter 125 l’île de l’Ile-du-Prince-Édouard à une concentration de 3 g/L. Incubate à température ambiante pendant 15 min, en inversant le tube trois fois pendant l’incubation. Ajouter 200 L du mélange transfection par assiette. Ensuite, incuber les plaques dans un incubateur de CO2 humidifié à 37 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Concentration de vecteurs lentiviraux<ol>
<li>Quarante-huit heures après la transfection, récoltez le milieu qui contient des particules de VBL. Utilisez des tubes coniques de 50 ml. REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un plasmide avec une étiquette fluorescente, les cellules peuvent être visualisées à ce stade pour vérifier l’efficacité de la transfection. Une nouvelle partie du milieu DMEM peut être ajoutée, et les cellules peuvent être incubées pour un supplément de 24 h. Le rendement LV est comparable lorsqu’il est collecté aux points de temps de 48 et 72 h après la transfection.</li>
		<li>Centrifuge le milieu à 3.000 x g pendant 5 min et la température ambiante pour enlever les cellules détachées.</li>
		<li>Filtrer le supernatant (0,45 m) et le verser dans de nouveaux tubes. REMARQUE : Cette étape peut être omise.</li>
		<li>Ajouter DNase I (sans RNase, 1 g/mL) et MgCl2 (1 mM), et incuber dans un bain d’eau à 37 oC pendant 15 min.</li>
		<li>Transférer les tubes de polyéthylène moyen à jetable, et l’ultracentrifugeuse dans un rotor oscillant à 115 000 x g et à 4 oC pour 1,5 h.</li>
		<li>Après centrifugage, égouttez doucement les parois des tubes des résidus moyens.</li>
		<li>Faire tremper la granule avec du salin stérile tamponné par phosphate (PBS; 70 à 80 ll par tube).</li>
		<li>Incuber pendant 2 h à 4 à 8 oC.</li>
		<li>Réutilisez les vecteurs viraux dans PBS en passant doucement à la pipe. CAUTION: Évitez la mousse.</li>
		<li>Transférer à un tube de centrifugeuse de 1,5 mL et une centrifugeuse à 7 000 x g et 4 oC pour 30 s. Transférer le supernatant dans un nouveau tube. Répétez cette étape jusqu’à ce qu’aucune granule de débris cellulaires ne soit visible.</li>
		<li>Aliquot et congeler à -80 oC. Évitez de recongeler l’aliquot LV.</li>
	</ol></li>
	<li>Détermination du virus titer à l’aide d’une réaction quantitative en chaîne de polymérase REMARQUE : La titration des vecteurs viraux est effectuée à l’aide de PCR quantitatif (QPCR). Cette méthode est basée sur l’amplification d’un fragment d’ADN de 84 bp de long à double brin dans la longue région terminale de répétition du génome viral15.<ol>
<li>Préparer la courbe standard en faisant des dilutions en série du plasmide de codage LV : 1:500, 1:1,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:100,000, et 1:1,000.000. Déterminez le nombre d’exemplaires du plasmide qui est utilisé pour la courbe standard. Utilisez la formule suivante : nombre d’copies/L (concentration [g/L] x 6,02 x 1023 [nombre/mol]) / (660 [g/mol] x plasmid taille [bp]), où 6,02 x 1023 nombre/mol est le numéro d’Avogadro, et 660 g/mol est le poids de bp. REMARQUE : Des calculatrices de numéros de copie en ligne peuvent être utilisées.</li>
		<li>Préparer les dilutions de la suspension lentiviral : 1:100, 1:500 et 1:1,000.</li>
		<li>Préparer le mélange de réaction (volumes par puits) : 10 l de QPCR Mastermix, 1 ll de l’apprêt avant de 10 M, 1 l de l’amorce inversée de 10 M et 7 L de H2O. Pipette le mélange dans les puits de 96 plaques bien. REMARQUE : Apprêt avant : 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA. Apprêt inversé: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA.</li>
		<li>Ajouter 1 l de chaque dilution standard et suspension lentiviral en triplicate.</li>
		<li>Exécuter le QPCR selon les paramètres suivants : 50 oC pour 2 min, 96 oC pour 5 min, et 35 cycles de 96 oC pour 20 s, 60 oC pour 40 s et 70 oC pendant 1 min, suivis de l’étape de la courbe de fonte : 95 oC pour 1 min et 60 c à 30 s.</li>
		<li>Analyser les résultats en comparant le nombre de molécules reçues pour chaque dilution à la courbe standard. Déterminer la concentration de molécules vectorielles que la moyenne de trois réplique pour chaque dilution. REMARQUE : La quantification présentée donne la concentration physique des particules virales. Il ne doit pas être traité comme un titer fonctionnel.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Génération de rats transgéniques
<ol><li>Superovulation et collecte d’embryons fécondés<ol>
<li>Administrer des gonadotropines. REMARQUE : Pour augmenter le nombre d’embryons recueillis (environ 30 par femelle), utilisez des femelles Wistar immatures de 5 semaines pour la stimulation hormonale.<ol>
<li>Le jour 1 (12 PM-1 PM), injectez intraperitoneally la gonadotropine sérique de la jument enceinte (PMSG ; 25 UI par femelle). Préparer 1 mL aliquots de solution de travail à une concentration de 125 UI/mL en dissolvant la poudre d’hormone dans 0,9% NaCl. Conserver à -20 oC jusqu’à 1 mois ou -80 oC pour un temps allant jusqu’à 6 mois.</li>
			<li>Le jour 3 (12 PM-1 PM), injectez intraperitoneally la gonadotrophine chorionique humaine (hCG ; 30 UI par femelle). Préparer 1 mL aliquots de solution de travail (150 UI/mL) en dissolvant la poudre d’hormone dans 0,9% NaCl. Conserver à -20 oC jusqu’à 1 mois ou -80 oC pour un temps allant jusqu’à 6 mois.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Après l’administration de hCG, s’accouplent les femelles 1:1 avec des mâles sexuellement fertiles (3-10 mois).</li>
		<li>Le lendemain matin (jour 4 à 8-10 AM), vérifiez les femelles pour la présence d’une prise vaginale. Vérifiez l’ouverture vaginale pour la présence d’une prise d’accouplement blanchâtre, qui pour la meilleure visualisation devrait être vérifiée tôt le matin après la nuit d’accouplement. Pour la collecte d’embryons, n’utilisez que les femelles avec une prise visible.</li>
		<li>Recueillir des embryons à 10 heures. Sacrifiez les animaux pour exciser les oviductes et recueillir les oviductes dans un plat avec un support M2 pré-réchauffé.<ol>
<li>Transférer les oviductes dans un plat de 35 mm qui contient un milieu M2 préchauffé avec de l’hyaluronidase des testicules bovins à une concentration de 0,5 mg/mL.</li>
			<li>Ouvrez les parois de l’oviduct à l’aide de forceps fins sous un stéréomicroscope et appuyez sur l’ampulla (c’est-à-dire la partie gonflée de l’oviduct qui contient des embryons fécondés qui sont entourés de cellules cumulus) jusqu’à ce que les embryons soient libérés. REMARQUE : Hyaluronidase digère enzymatiquement les cellules de cumulus, libérant des embryons. CAUTION : L’exposition prolongée à l’hyaluronidase est nocive pour les embryons ; par conséquent, cette étape ne devrait pas durer plus de 5 min.</li>
			<li>Pour faciliter la libération d’embryons provenant de cellules cumulus, les pipette doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette de transfert de verre qui est reliée à un tube d’aspirateur actionné par la bouche.<ol>
<li>Pour produire la pipette de transfert, tirez une pipette Pasteur en verre sur une flamme pour produire une pointe droite de 5 à 10 cm. Casser la pipette en laissant une pointe de 4 cm.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Laver les embryons à quelques reprises dans le milieu M2 pour enlever l’hyaluronidase et les débris cellulaires. Transférer les embryons dans un plat de 60 mm qui contient des gouttes de M16 pré-équilibrés, recouvertes de paraffine liquide ou d’huile minérale, dans un incubateur humidifié de 37 oC avec une atmosphère deCO 2 de 5 %.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjection de vecteurs lentiviraux à l’embryon à un étage sous la zona pellucida REMARQUE : Utilisez des embryons à une cellule avec deux pronuclées visibles pour la microinjection(figure 1).<ol>
<li>Décongeler l’aliquot LV à température ambiante et la centrifugeuse à 10 000 x g et RT pendant 2 min pour pelleter les débris cellulaires restants.</li>
		<li>Configuration de micro-injection<ol>
<li>Préparer les pipettes en verre (capillaire en verre borosilicate) à l’aide d’une microforge. Tirez le capillaire de verre sur une flamme pour produire une pointe de 5 à 10 cm. Casser la pipette en laissant une pointe de 4 cm. Le diamètre extérieur doit être de 80 à 120 m. REMARQUE : Assurez-vous que la pointe de la pipette est parfaitement droite et lisse.</li>
			<li>Assembler la pipette tirée dans une microforge avec la pointe devant le filament de chauffage. Chauffer le filament très près de la pointe de la pipette et lui permettre de rétrécir à un diamètre de 15 m (environ 20 % de la taille de l’embryon). Placez la pipette perpendiculairement au filament chauffant, de 2 à 3 mm de la pointe de la pipette, et commencez à chauffer. Le verre ramollira. Chauffer jusqu’à ce qu’il atteigne un angle de 15 degrés.</li>
			<li>Préparer les capillaires en verre de borosilicate de microinjection avec un filament à l’aide d’un puller pipette. Insérer le capillaire dans la chambre de traction. Exécuter un essai de rampe (pour la première fois pour le nouveau verre et à chaque fois après avoir changé le filament). Réglez la chaleur à la valeur de la rampe -10, Pull à 100, Velocity à 150 et Time to 100. REMARQUE : Modifier les paramètres pour obtenir un capillaire d’injection optimal.</li>
			<li>Sous un capot de flux lamineur biosécurité, chargez environ 2 lil de la solution virale dans la pipette de microinjection avec une pointe de microchargeur.</li>
			<li>Préparer un plat de microinjection (couvercle de 60 mm de plat Petri) avec une goutte de 100 l de M2 moyen (au milieu), recouverte de paraffine liquide ou d’huile minérale.</li>
			<li>Montez la pipette de fixation et le capillaire de microinjection qui est chargé avec la solution virale à un micromanipulateur et un plat de microinjection sous un microscope inversé.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Effectuez la microinjection.<ol>
<li>Transférer 15 à 20 embryons à un étage sur la chute M2 sur le plat de microinjection. Tenez l’embryon à l’aide d’une pipette de retenue.</li>
			<li>À l’aide du grossissement 400x, injectez la solution LV sous la zona pellucida à l’espace périvitelline à l’aide du capillaire en verre qui est connecté à un injecteur automatique. Tenez le capillaire sous la zona pellucida pendant un moment. REMARQUE : En utilisant une légère pression positive, la solution virale s’écoulera continuellement hors du capillaire d’injection, mais le volume de la suspension qui est livrée ne peut pas être contrôlé.</li>
			<li>À l’aide d’une pipette fine, remettre les embryons au plat de culture de l’incubateur à 37 oC dans une atmosphère de CO2 de 5 %. Le nombre d’injections d’un zygote peut varier et peut être adapté en fonction de la concentration virale de vecteur. REMARQUE : Les embryons injectés peuvent être transférés à des mères adoptives au stade d’une cellule ou à un milieu O/N incubé dans le milieu M16 avant d’être transférés au stade à deux cellules. La culture in vitro prolongée des embryons de rats doit être évitée.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transfert d’embryons injectés aux mères adoptives<ol>
<li>Préparez les mères adoptives en accouplant des femelles SD sexuellement matures avec des mâles BN fertiles ou avec des mâles SD vasectomisés (la procédure de vasectomie est décrite à la section 3 ci-dessous) le jour 3 (pour le transfert d’embryons au stade d’une cellule) ou au quatrième jour (pour le transfert d’embryons au stade à deux cellules). REMARQUE : Pour le transfert d’oviduct, utilisez 0.5 jours après coitum (dpc) femelles.</li>
		<li>Le lendemain matin, vérifiez les femelles SD pour une prise vaginale, et n’utilisez que ceux avec une prise visible.</li>
		<li>Effectuez le transfert d’embryons. REMARQUE : Conduisez la procédure chirurgicale avec des instruments stériles sous un stéréomicroscope. Avant le jour de la chirurgie, ciseaux autoclave, forceps fins, porte-aiguille, et porte-scalpel.<ol>
<li>Anesthésiez une femelle avec l’administration i.p. de la kétamine (50 mg/kg) et de la médénodine (0,5 mg/kg). Testez les réflexes pour confirmer l’anesthésie avant de commencer l’intervention chirurgicale.</li>
			<li>Injecter l’animal sous-cutanée avec de l’acide toléfenamique (2 mg/kg), du tartrate de butorphanol (1 mg/kg) et de l’enrofloksacine (5 à 10 mg/kg) pour prévenir l’inflammation, la douleur et l’infection, respectivement.</li>
			<li>Appliquer la lubrification de la pommade ophtalmique aux deux yeux pour prévenir le séchage cornéen. Rasez la fourrure du dos et stérilisez la peau avec un gommage chirurgical suivi de 70 % d’alcool à l’aide de tampons stériles non adhérants. Laisser sécher la peau.</li>
			<li>Injecter l’animal sous-cutanée avec 100 L de bupivacaine de 0,25% (anesthésique local) au site d’incision. Transférer l’animal en position couchée sur une surface propre sur un coussin chauffant dans le but d’un microscope chirurgical. Couvrir le rat d’un drapé stérile d’un petit trou coupé sur le bas du dos.</li>
			<li>Effectuer une incision cutanée d’environ 2 cm, parallèle à la colonne vertébrale lombaire.</li>
			<li>À l’aide de ciseaux pointus, faire une coupure dans la paroi abdominale. Prenez un coussin de graisse ovarienne à l’aide de forceps, et retirez l’ovaire et l’oviducte et placez-les sur de la gaze qui est mouillée avec 0,9% NaCl.</li>
			<li>Aspirer le milieu M2, trois bulles d’air et les embryons dans le capillaire de transfert. Nombre total recommandé d’embryons à transférer (unilatérales ou bilatérales) : femelle enceinte (embryons de 15 à 16 ans), pseudo-femelles (30 embryons).</li>
			<li>Faire une petite incision dans l’oviducte (entre l’infundibulum et l’ampulla) à l’aide de micro-ciseaux, et insérer la pipette de transfert dans l’oviducte.</li>
			<li>Expulser délicatement les embryons et les bulles d’air de la pipette vers l’oviducte. Avec des forceps émoussés, placez l’appareil reproducteur dans la cavité abdominale.</li>
			<li>Suture de la paroi abdominale avec de l’acide polyglycolique sutures absorbables et fermer l’incision de la peau avec des pinces de plaie. Selon le nombre d’embryons disponibles, répétez cette procédure pour l’autre oviducte.</li>
			<li>Injecter l’animal intraperitoneally avec l’atipamezole (0,5 mg/kg) pour inverser l’effet de l’anesthésie.</li>
			<li>Transférer l’animal dans une cage propre et le garder sur une plaque chauffante pour récupérer complètement de l’anesthésie. La livraison chez les rats se produit après 21 jours. REMARQUE : Lorsque les rats mâles BN sont utilisés pour l’accouplement, seuls les chiots blancs sont potentiellement transgéniques; les chiots bruns sont de grossesse naturelle.</li>
			<li>Recueillir des fragments de tissu (de préférence de l’oreille) au génotype de 3 semaines.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vasectomie
REMARQUE : Avant le jour de la chirurgie, ciseaux autoclave, forceps fins et porte-aiguilles.
<ol><li>Anesthésiez un rat SD mâle de 5 semaines avec l’administration i.p. de la kétamine (50 mg/kg) et de la médénodine (0,5 mg/kg). Testez les réflexes pour confirmer l’anesthésie avant de commencer l’intervention chirurgicale.</li>
	<li>Administrer de l’acide tolfenamic (2 mg/kg), du tartrate de butorphanol (1 mg/kg) et de l’enrofloksacine (5 à 10 mg/kg) sous-cutanée pour prévenir l’inflammation, la douleur et l’infection, respectivement.</li>
	<li>Appliquer la lubrification de la pommade ophtalmique aux deux yeux pour prévenir le séchage cornéen. Placez le rat supine sur une surface propre sur un coussin chauffant, et stérilisez la peau sur les testicules avec des gommage chirurgicaux suivis de 70% d’alcool à l’aide de tampons stériles non adhérants. Laisser sécher la peau. Couvrir le rat d’un drapé stérile d’un petit trou coupé sur les testicules. Appuyez doucement sur l’abdomen pour exposer les testicules dans le sac scrotal.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision de 0,5 cm au milieu du sac scrotal. Localiser le mur de ligne médiane (ligne blanchâtre) entre les testicules.</li>
	<li>Faire une incision de 5 mm dans la membrane des testicules près du côté gauche de la paroi de la ligne médiane.</li>
	<li>Poussez soigneusement les testicules vers la gauche et localisez les différenciations vas (entre les testicules et la ligne médiane) comme un conduit blanc avec un seul vaisseau sanguin.</li>
	<li>Tirez doucement les vas deferens hors du sac scrotal à l’aide des forceps d’un horloger. Tenir le vas différencié d’une paire de forceps, et couper avec des ciseaux fins (ou cautériser avec des pointes rouges d’une deuxième paire de forceps). Retirer un fragment de 1 cm du conduit. REMARQUE : Si la cautérisation est effectuée, maintenez la pointe de la deuxième paire de forceps dans la flamme.</li>
	<li>Répétez la procédure ci-dessus pour les autres testicules. Suture de la peau avec de l’acide polyglycolique sutures absorbables et injecter l’animal intraperitoneally avec de l’atipamezole (0,5 mg/kg).</li>
	<li>Placez le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante jusqu’à ce que l’animal se rétablisse de l’anesthésie. REMARQUE : Les mâles peuvent être utilisés dans les accouplements d’essai après une période de récupération de 2 semaines. Une fois la stérilité confirmée, ils peuvent être utilisés pour l’induction pseudo-grossesse.</li>
</ol>

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</ol>

L’auteur (W.K.) a droit au brevet, "Méthode de production d’un animal transgénique", de l’office des brevets de la République de Pologne (no 355353; 21.03.2008).

Les progrès des technologies transgéniques ont fait des modèles de rongeurs un outil inestimable dans la recherche biomédicale. Ils offrent l’occasion d’étudier les relations génotype-phénotype in vivo. Ici, nous présentons une alternative largement disponible pour la transgenèse conventionnelle par des injections pronucléaires. L’utilisation de la transduction de gène lentiviral contourne la nécessité d’exiger des microinjections parce que des vecteurs viraux peuvent être injectés sous la zona pellucida. Cette approche ...

Depuis de nombreuses années, les rongeurs de laboratoire, comme les rats et les souris, ont été utilisés pour modéliser les conditions physiologiques et pathologiques humaines. La recherche sur les animaux a mené à des découvertes qui étaient inaccessibles par tous les autres moyens. Initialement, les études génétiques se sont concentrées sur l’analyse des désordres spontanément et phénotypes qui sont considérés pour imiter étroitement la condition humaine1. Le développement de méthodes de génie génétique a permis l’introduction ou la suppression de gènes spécifiques pour obtenir un phénotype désiré. Par conséquent, la génération d’animaux transgéniques est reconnue comme une technique fondamentale dans la recherche moderne qui permet des études de la fonction génique dans les organismes vivants.
La technologie animale transgénique est devenue possible grâce à une combinaison de réalisations en embryologie expérimentale et en biologie moléculaire. Dans les années 1960, l’embryologiste polonais A. K. Tarkowski a publié les premiers travaux sur la manipulation des embryons de souris au cours des premiers stades du développement2. En outre, les biologistes moléculaires ont développé des techniques pour générer des vecteurs d’ADN (c.-à-d., porteurs) pour l’introduction, entre autres, de l’ADN étranger dans le génome de l’animal. Ces vecteurs permettent la propagation de gènes sélectionnés et leur modification appropriée, selon le type de recherche qui est menée. Le terme « animal transgénique » a été introduit par Gordon et Ruddle3.
La première espèce largement acceptée qui a été utilisée dans la neurobiologie, la physiologie, la pharmacologie, la toxicologie, et beaucoup d’autres domaines des sciences biologiques et médicales était le rat de Norvège, Rattus norvegicus4. Cependant, en raison de la difficulté à manipuler les embryons de rats, la souris maison Mus musculus est devenue l’espèce animale dominante dans la recherche génétique5. Une autre raison de la primauté de la souris dans une telle recherche était la disponibilité de la technologie des cellules souches embryonnaires pour générer des animaux knock-out pour cette espèce. La technique la plus couramment utilisée de transgenèse (2 à 10 % de la progéniture transgénique par rapport à tous les animaux nés) est la microinjection de fragments d’ADN dans un pronucléus d’un oocyte fécondé. En 1990, cette approche, qui a été introduite pour la première fois chez la souris, a été adaptée pour les rats6,7. La transgenèse de rat par injection pronucléaire est caractérisée par une efficacité inférieure8 comparée aux souris, qui est strictement liée à la présence de plasma élastique et de membranes pronucléaires9. Bien que la survie des embryons après manipulation soit de 40 à 50 % inférieure à celle des souris, cette technique est considérée comme une norme dans la génération de rats génétiquement modifiés10. D’autres approches qui peuvent garantir une incorporation transgène efficace et des taux de survie plus élevés de zygotes injectés ont été étudiées.
Le déterminant clé de l’expression transgène stable et de la transmission à la progéniture est son intégration dans le génome des cellules hôtes. Les lentivirus (VBL) ont la particularité d’être en mesure d’infecter à la fois les cellules de division et de non-division. Leur utilisation comme outil pour l’incorporation de gènes hétérologues dans les embryons s’est avérée très efficace11, et les individus transgéniques sont caractérisés par l’expression stable du fragment d’ADN incorporé. L’efficacité des vecteurs lentiviraux a été confirmée pour la modification génétique des souris12,13, rats12,14, et d’autres espèces11. Dans cette méthode, la suspension LV est injectée sous la zona pellucida de l’embryon au stade de deux pronuclées. Cette technique garantit essentiellement la survie à 100% des embryons parce que l’olémma reste inchangée. La production de suspensions LV de haute qualité et relativement fortement concentrées sont des facteurs cruciaux. Cependant, des concentrations plus faibles de suspensions de VL peuvent être surmontées par des injections répétées11, ce qui augmente la quantité de particules virales à la surface de l’œuf tout en n’affectant pas l’intégration de membrane. Les embryons qui sont soumis à des injections répétées dans l’espace périvitelline se développent davantage, et la progéniture transgénique peut transmettre le transgène par la lignée germinale. L’efficacité de la production de rats transgéniques par transgenèse lentivirale peut atteindre 80 %12.
Ici, nous décrivons la production du lentivirus recombiné dérivé du VIH-1 qui a été pseudotypé avec la protéine d’enveloppe de virus de stomatite vésiculaire (VSV) G. L’utilisation du pseudotype VSV de deuxième génération détermine la grande infectiosité des particules virales et permet la production de vecteurs très stables qui peuvent être concentrés par ultracentrifugation et cryoconservé. Après vérification de titer, les vecteurs sont prêts à être utilisés comme véhicule pour la livraison transgène dans les zygotes de rat Wistar albinos. Après une série d’injections, les embryons peuvent être cultivés du jour au lendemain et transférés à l’étape des deux cellules pour favoriser les mères. À ce stade, l’une des deux approches alternatives peut être envisagée. La procédure standard utilise les femelles pseudo-enceintes comme receveurs d’embryons. Cependant, lorsque le taux de grossesse est faible après l’accouplement avec des mâles vasectomisés, les embryons peuvent être implantés dans les femelles Enceintes Wistar/Sprague-Dawley (SD) qui sont accouplées avec des rats mâles fertiles avec une couleur de fourrure foncée (par exemple, Brown Norway [BN] rats). La couleur de la fourrure permet la distinction de la progéniture de la grossesse naturelle de la progéniture qui proviennent des embryons manipulés transférés.

<table><tbody><tr><td>7500 Système de PCR en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerrane (isoflurane)</td><td>Baxter</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Ensembles de tubes d’aspirateur pour pipettes microcapillaires calibrées</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Atipam 5 mg/ml</td><td>Eurovet Animal Health BV</td><td>N/A</td><td>0,5 mg/kg</td></tr><tr><td>Baytril 25 mg/ml (enrofloksacine)</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td>5-10 mg/kg</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté avec filament GC100TF-15</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0039</td><td>injection</td></tr><tr><td>capillaire Bupivacaïne 25 mg/ml</td><td>Advanz Pharma</td><td>N/A</td><td>0,25 % in&nbsp ; 0,9 % NaCl</td></tr><tr><td>Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&nbsp ; tartrate)</td><td>Orion Pharma</td><td>N/A</td><td>1 mg/kg</td></tr><tr><td>CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Boîte de culture cellulaire tissulaire 60-mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CellTram Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5176 000.025</td><td></td></tr><tr><td>Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td><td>cp-pharma</td><td>N/A</td><td>0,5 mg/kg</td></tr><tr><td>Chorulon, gonadotrophine chorionique humaine&nbsp ;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>150 UI/ml ml 0,9 % NaCl</td></tr><tr><td>DMEM faible glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6048</td><td></td></tr><tr><td>DNase, sans RNase</td><td>A& Un</td> plasmide codant pour la protéine d’enveloppe EmbryoMax <td>1009-100</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax</td><td>Sigma</td><td>ES-005-C</td><td></td></tr><tr><td>pour vecteurs lentiviraux (plasmide VSVg)&nbsp ;</td><td>ADDGENE</td><td>14888</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>4i /5252 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Folligon, Jument Gestante' s Gonadotrophine sérique&nbsp ;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>125 UI/ml dans des cellules NaCl</td></tr><tr><td>HEK 293T à 0,9 %&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase de testicule bovin.</td><td>Sigma</td><td>H4272-30MG</td><td>0,5 mg/ml en M2 medium</td></tr><tr><td>Microscope inversé&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine 100mg/ml</td><td>Biowet Pulawy</td><td>N/A</td><td>50 mg/kg</td></tr><tr><td>Paraffine liquide</td><td>Merck Millipore</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>M16 medium EmbryoMax</td><td>Sigma</td><td>MR-016-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Huile Minérale</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9 %</td><td>POLPHARMA OTC</td><td>N/A</td><td>stérile, ampoules 5ml</td></tr><tr><td>Opération microscope&nbsp ;</td><td>Inami Ophthalmic Instruments</td><td>Deca-21</td><td></td></tr><tr><td>Système d’emballage codant pour plasmide pour vecteurs lentiviraux&nbsp ; (plasmide delta R8.2)</td><td>ADDGENE</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>Réactif PEI (Polyéthylénimine, Mw ~ 25 000,),</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline-streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Saline Tamponné, pH 7,4, liquide, stérile-filtré, adapté à la culture cellulaire</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806552-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur&nbsp ;</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td><td>World Precision Instruments</td><td>500345/500346</td><td></td></tr><tr><td>Safil, acide polyglycolique, tressés, enduits, fils résorbables</td><td>B.Braun Fil à coudre chirurgical</td><td>1048029</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B.Braun&nbsp ;</td><td></td><td></td>C1048040</tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystem</td><td>4334973</td><td></td></tr><tr><td>Tolfedine 4 % (acide tolfénamique)</td><td>Vetoquinol</td><td>N/A</td><td>2 mg/kg</td></tr><tr><td>TransferMan NK2</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100 XP&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>VacuTip</td><td>Eppendorf</td><td>5175108.000</td><td>porte-accessoires</td></tr><tr><td>capillaires Vita-POS</td><td>Ursapharm</td><td>N/A</td><td>pommade pour les yeux</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Semic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Horloger Forceps</td><td>VWR</td><td>470018-868</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Les modèles animaux transgéniques sont fondamentalement importants pour la recherche biomédicale moderne. L’incorporation de gènes étrangers dans les premiers embryons de souris ou de rats est un outil inestimable pour l’analyse de la fonction génique dans les organismes vivants. La méthode standard de transgenèse est basée sur le microinjectage de fragments d’ADN étrangers dans un pronucléus d’un ocrayte fécondé. Cette technique est largement utilisée chez la souris, mais reste relativement inefficace et techniquement exigeante chez d’autres espèces animales. Le transgène peut également être introduit dans des embryons à un étage par infection lentivirale, offrant une alternative efficace aux injections pronucléaires standard, en particulier chez les espèces ou les souches ayant une structure embryonnaire plus difficile. Dans cette approche, une suspension qui contient des vecteurs lentiviraux est injectée dans l’espace périvitelline d’un embryon de rat fécondé, qui est techniquement moins exigeant et a un taux de réussite plus élevé. Il a été démontré que les vecteurs lentiviraux intègrent efficacement le transgène dans le génome pour déterminer la génération de lignées transgéniques stables. Malgré certaines limitations (p. ex., les exigences de biosécurité de niveau 2, les limites de taille des fragments d’ADN), la transgenèse lentiviral est une méthode de transgenèse rapide et efficace. En outre, l’utilisation de rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est présentée comme une alternative pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.

À l’aide du protocole décrit dans les présentes, des vecteurs lentiviraux qui transportaient la construction Syn-TDP-43-eGFP ont été produits (3,4 x 108/L) et pourraient ensuite être utilisés pour des injections subzonales embryonnaires à un stade cellulaire. Seuls les embryons avec deux pronuclées visibles ont été soumis à la procédure. Le nombre d’injections de suspensions virales a été déterminé expérimentalement. Une efficacité élevée d’implantation et un manque simultané de progéniture transgénique ont ét...

Cet article vise à fournir la méthodologie pour la transgenèse lentivirale chez les embryons de rats à l’aide d’injections multiples d’une suspension de virus dans l’espace périvitelline zygote. Les rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est employée pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.

Génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Les animaux transgéniques sont essentiels à la recherche biomédicale moderne car ils permettent des études de la fonction génique dans les organismes vivants. Diverses méthodes de modifications génétiques ont été appliquées dans les études sur les animaux. Ici, nous présentons une technique largement accessible et efficace qui utilise les vecteurs lentiviraux comme un outil pour l’incorporation transgénique dans le génome d’un embryon de rat.Après l’administration chorionique humaine de gonadotropine, accouplez les rats femelles de Wistar de cinq semaines un-à-un avec les mâles sexuellement fertiles de trois à 10 mois de Wistar. Le lendemain matin, à 8 h .m, vérifiez la présence d’une prise vaginale et récoltez les oviductes des femelles avec une prise d’accouplement au plus tard 10 .m.dans un plat de collection contenant un milieu M2 préchauffé. Lorsque tous les oviductes ont été recueillis, transférer les tissus dans un plat de 35 millimètres contenant un milieu M2 préchauffé complété par 0,5 milligramme par millilitre d’hyaluronidase à partir de testicules bovins et placer le plat sous un microscope stéréo. Utilisez des forceps fins pour ouvrir les parois de l’oviducte et appuyez sur l’ampulla jusqu’à ce que les embryons soient libérés.Pour faciliter la libération des embryons des cellules cumulus, utilisez une pipette de transfert de verre reliée à un tube d’aspirateur à commande buccale pour pipette doucement les embryons de haut en bas. Lorsque tous les embryons ont été libérés, lavez les cellules à quelques reprises dans un milieu M2 frais pour enlever l’hyaluronidase et les débris cellulaires. Transférer les embryons dans des gouttes individuelles de 50 microlitres de milieu M16 prééquilibré recouvert d’huile minérale dans un plat de 60 millimètres.Placez ensuite le plat dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius avec une atmosphère de dioxyde de carbone de 5 % jusqu’à leur injection. Pour la microinjection vectorielle lentiviral sous la zona pellucida des embryons à un stade cellulaire, utilisez un puller pipette pour préparer des capillaires en verre borosilicate de microinjection avec un filament. Après chaque fois que le filament est changé ou un nouveau capillaire en verre est utilisé, exécutez un test rampe pour définir les paramètres optimaux.Ensuite, utilisez une pointe de microchargeur pour charger environ deux microlitres de solution lentivirale fraîchement décongelée par pipette de microinjection sous un capot d’écoulement laminaire de biosécurité. Ajouter une goutte de 100 microlitres de milieu M2 au centre du couvercle à partir d’une boîte de Pétri de 60 millimètres. Couvrir le milieu d’huile minérale et monter la pipette de fixation et le virus chargé capillaires microinjection sur un micromanipulateur.Placer le plat de microinjection sous un microscope inversé et transférer 15 à 20 embryons à un stade cellulaire dans la goutte M2 dans le plat de microinjection. Capturez un embryon avec la pipette de fixation et utilisez le grossissement 400 fois et le capillaire de verre pour injecter la solution lentiviral sous la zona pellucida dans l’espace périvitelline tenant le capillaire sous la zona pellucida pendant un moment après que le virus a été livré. Lorsque tous les embryons ont été injectés, utilisez une pipette fine pour retourner les cellules injectées dans le plat de culture et retourner le plat à l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à leur implantation.Pour préparer les mères adoptives au transfert d’embryons, accoupler les femelles Sprague-Dawley sexuellement matures avec des mâles vasectomisés et vérifier les femelles le lendemain matin pour une prise vaginale. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez les femelles anesthésiées avec un bouchon viable, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et rasez la fourrure de l’arrière de chaque animal. Placez le premier rat en position couchée sur une surface propre sur un coussin chauffant sous un microscope chirurgical.Couvrir le rat d’un drapé stérile avec un petit trou coupé sur le bas du dos et faire une incision cutanée d’environ deux centimètres parallèle à la colonne vertébrale lombaire. Utilisez des ciseaux pointus pour faire une coupure dans la paroi abdominale et utilisez des forceps pour saisir un coussin de graisse ovarienne. Retirer l’ovaire et l’oviducte de la cavité abdominale sur un morceau de gaze trempée de chlorure de sodium à 0,9 %.Chargez le milieu M2, trois bulles d’air et les embryons dans un capillaire de transfert. Utilisez des microscisseurs pour faire une petite incision dans l’oviducte entre l’infundibulum et l’ampulla et insérer la pointe de la pipette de transfert dans l’incision. Expulser doucement les embryons et les bulles d’air dans l’oviducte, puis utiliser des forceps contondants pour placer l’appareil reproducteur de nouveau dans la cavité abdominale.Suture de la paroi abdominale avec des sutures absorbables à l’acide polyglycolique et fermer l’incision cutanée avec des pinces à plaies et placer l’animal dans une cage propre sur une plaque chauffante avec surveillance jusqu’à ce que la pleine écume. Pour vasectomiser les partenaires potentiels, après avoir préparé le rat mâle pour la chirurgie comme démontré, utilisez 70% d’éthanol et un gommage chirurgical pour désinfecter la peau sur les testicules. Appuyez doucement sur l’abdomen pour exposer les testicules dans le sac scrotal et couvrir le rat d’un drapé stérile avec un petit trou sur le site chirurgical et utiliser des ciseaux scrotal pour faire une incision de 0,5 centimètre au milieu du sac.Poussez soigneusement les testicules vers la gauche et localisez les déférents de vas entre le testicules et la ligne médiane comme conduit blanc avec un seul vaisseau sanguin. Utilisez les forceps de l’horloger pour tirer doucement les déférents vas hors du sac scrotal et tenant le navire avec des forceps, utilisez des ciseaux fins pour enlever un fragment d’un centimètre du conduit. Répétez la procédure pour le deuxième testicules comme vient de le démontrer et fermez la peau avec des sutures absorbables à l’acide polyglycolique.Ensuite, placez le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète. Dans cette expérience représentative dans laquelle des embryons simples ont été injectés plusieurs fois, huit rats sont nés d’embryons qui ont été injectés deux fois, dont trois ont été confirmés pour porter le transgène. L’un des fondateurs n’a pas transféré le transgène à la progéniture et trois femelles adoptives ont été utilisées pour chaque configuration expérimentale.L’approche choisie a permis la génération de lignées de rats transgéniques stables qui exprimaient la protéine de fusion TDP-43-eGFP sous le contrôle de la synapse neuronale chez un promoteur dans tout le système nerveux central. La transgenèse à base de lentivirus a donné lieu à une insertion à copie unique du transgène, comme le démontre le PCR quantitatif. Lorsque cette méthode a été utilisée pour d’autres vecteurs lentiviraux, un taux de survie d’environ 90 % a été observé.Le pourcentage d’embryons qui ont survécu aux injections pronucléaires était significativement inférieur. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les rats femelles enceintes peuvent être utilisés comme mères adoptives avec une efficacité comparable. Notamment, les données numériques analysées pour des cycles individuels de microinjection indiquaient que l’efficacité de l’implantation dépendait directement du nombre d’injections dans un embryon et indirectement de la charge virale.L’utilisation de vecteurs lentiviraux garantit l’intégration génomique et la transmission du transgène et facilite un taux de survie élevé des embryons micromanipulés même lorsque de multiples injections subdermiques sont effectuées. Cette procédure peut être appliquée efficacement à d’autres espèces et peut être considérée comme une alternative à la transgenèse conventionnelle.

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Vecteurs d'expression lentiviraux sont les véhicules les plus efficaces pour différentes exprimant de façon stable des molécules effectrices ou des constructions rapporteurs à diviser et non de division des cellules de mammifères et des organismes entiers. Ici, nous fournir un protocole sur la façon d'emballer des constructions d'expression lentivector particules pseudoviral et pour transduire des cellules cibles en utilisant les particules pseudoviral.

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Injection d’un vecteur viral dans la moelle épinière d’un rat pour le traçage neuronal rétrograde

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Ce manuscrit décrit comment l’administration locale de gènes par vecteur viral offre un moyen attrayant d’exprimer des transgènes dans le système nerveux central.  Le protocole décrit toutes les étapes cruciales pour effectuer une injection de vecteur viral dans la substance noire du rat afin de développer un modèle animal basé sur un vecteur viral pour la maladie de Parkinson.

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

Méthodes pour une livraison de gène à grande échelle du système nerveux central chez le rat sont couvertes. Dans cet exemple, le but consiste à mimer une maladie qui affecte l’ensemble de la moelle épinière. La transduction généralisée peut être utilisée pour fournir une protéine thérapeutique à la CNS d’une administration unique, périphérique.

Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral marqués transportable dans les tissus de la moelle épinière de rat. Le vecteur est absorbé au niveau de la synapse et transporté vers le corps cellulaire des neurones de la cible. Ce modèle convient pour un traçage rétrograde des voies importantes de la colonne vertébrale ou ciblage des cellules pour des applications de la thérapie génique.

Injection directe d’un vecteur Lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices de la moelle épinière de Rat

Le présent protocole décrit des méthodes d’expression transgénique dans le cœur de rats et de souris par injection intramyocardique directe du virus sous guidage échocardiographique. Les méthodes d’évaluation de la susceptibilité des cœurs aux arythmies ventriculaires par la stimulation électrique programmée de cœurs isolés perfusés par Langendorff sont également expliquées ici.

Expression de transgènes viraux dans les cœurs de rongeurs et évaluation du risque d’arythmie cardiaque

Ce protocole présente une approche optimisée pour la production de modèles de rats génétiquement modifiés. Le virus adéno-associé (AAV) est utilisé pour fournir une matrice de réparation de l’ADN, et l’électroporation est utilisée pour délivrer des réactifs CRISPR-Cas9 afin de compléter le processus d’édition du génome dans un embryon à 2 cellules.

Édition du génome CRISPR-Cas9 d’embryons de rats à l’aide d’un virus adéno-associé (AAV) et d’une électroporation d’embryons à 2 cellules

Découvrez la transgenèse lentivirale chez le rat pour l'ingénierie génétique et la recherche en neurosciences. Cette méthode utilise des injections multiples de vecteurs viraux dans l'espace périvitellin de l'embryon.

Génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale

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