Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

L’immunohistochimie de montage entier est une technique relativement rapide et simple qui permet l’observation spatiale et temporelle des protéines directement dans un tissu ou un organisme utilisant des anticorps étiquetés. L’utilité de cette technique est qu’elle permet la coloration d’un tissu intact ou d’un organisme sans avoir à le sectionner d’abord et la microscopie confoccale peut être utilisée pour générer une représentation tridimensionnelle du modèle d’expression protéique. L’immunohistochimie est largement utilisée dans la recherche biomédicale pour comprendre l’étiologie et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la maladie.

C’est également un outil diagnostique valable pour identifier des tumeurs dans des échantillons pathologiques. Pour commencer, préparez des réservoirs de frai remplis d’eau du système et d’une maille ou d’un revêtement fendté en place. Placer les couples de sexe mixte adultes de poisson zèbre en groupes dans les réservoirs pendant la nuit.

Utilisez un cycle lumière/obscurité de 14 heures/10 heures avec des lumières qui s’allument à 9 .m. Le lendemain matin, avec les lumières allumées, changer l’eau du réservoir de frai avec de l’eau du système frais pour enlever les excréments. Une fois les œufs pondus, retourner les adultes dans des réservoirs à la maison.

Recueillir les œufs en les dessinant à l’aide d’une pipette de transfert. Transférer 50 œufs dans chaque boîte de Pétri remplie à mi-chemin avec un milieu embryonnaire. Enlevez tous les œufs opaques et nuageux qui sont morts ou qui n’ont pas réussi à se diviser.

Incuber le plat d’œufs à 28,5 degrés Celsius jusqu’à 23 heures après la fécondation. Si les embryons sont plus âgés que 24 heures après la fécondation, avec une pipette transférer les embryons à 200 PTU micromolaire dans le milieu embryonnaire pour prévenir la mélanogenèse. Au microscope stéréo, déchorionner les embryons non hachés à l’aide de forceps à pointe ultra fine.

À l’aide de pipettes Pasteur polies par le feu pour minimiser les dommages, transférez-les dans des boîtes de Pétri en verre ou en plastique recouvertes de 1 à 2 % d’agarose dissoute dans un milieu embryonnaire. Transférez ensuite les embryons dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette en plastique ou polie par le feu. Retirer le milieu embryonnaire à l’aide d’une micropipette.

Ne laissez que suffisamment de liquide pour couvrir les embryons. Fixer les embryons en 4%PFA pendant une à deux heures avec un basculement doux à température ambiante. Ensuite, lavez les embryons trois fois en 1X PBS et 1%PBTriton pendant cinq minutes.

Utilisez les embryons immédiatement ou conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Pour le stockage à long terme, déshydrater et stocker les embryons dans 100% méthanol à moins 20 degrés Celsius. Pour réhydrater les embryons, effectuez des incubations en série cinq minutes chacune à température ambiante avec des quantités décroissantes de méthanol et de PBS et de PBTriton pour le lavage final.

Procéder à la préparation de l’embryon selon le manuscrit. Choisissez une solution de blocage correspondant à l’espèce hôte secondaire d’anticorps, par exemple 10% sérum de chèvre dans PBTriton avec ou sans deux milligrammes par millilitre de BSA. Ajouter 0,5 millilitres de la solution de blocage dans le tube contenant l’embryon et placer le tube sur un rocker pendant une à trois heures à température ambiante.

Puis incuber l’embryon dans l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage et PBTriton pendant la nuit à quatre degrés Celsius tout en berçant. Le matin, laver l’embryon cinq fois dans PBTriton pendant 10 minutes chacun à température ambiante tout en basculant. Choisissez ensuite un anticorps secondaire basé sur l’espèce hôte de l’anticorps primaire et la longueur d’onde désirée à 488 nanomètres.

Ajouter l’anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage dans le tube contenant l’embryon. Couvrir le tube de papier d’aluminium et incuber pendant deux heures à température ambiante pendant le basculement. Après cela, laver les embryons trois fois dans PBTriton pendant 10 minutes chacun à température ambiante tout en étant recouvert de papier d’aluminium et de bascule.

Avec une pipette, transférer les embryons à une solution de 50% glycérol dans PBS sur un lit de 2% agarose dans le milieu embryonnaire. Pour enlever le jaune, transférer 200 microlitres de 1X PBS sur une glissade de dépression ou une glissière en verre ordinaire. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour déplacer un ou plusieurs embryons vers la gouttelette PBS.

Utilisez des forceps ultra fins et des broches à double zéro insecte pour briser le jaune et gratter très doucement les granules jaunes de la surface ventrale de l’embryon. Retirer les granules jaunes et les reconstituer en PBS au besoin. Après montage, placez l’échantillon au microscope.

Localisez la région d’intérêt en choisissant un exemple relativement lumineux. Ajustez l’exposition à la caméra et gagnez de sorte que le signal soit suffisamment lumineux sans saturer. Lorsque vous comparez entre les embryons expérimentaux étiquetés anticorps et les embryons d’anticorps de contrôle, utilisez les mêmes paramètres d’exposition.

Ce protocole de l’immunohistochimie de montage entier est un outil valable pour l’étude de l’expression spatiale et temporelle de protéine utilisant le développement de zebrafish. La sous-unité GluN1 du récepteur du glutamate de type NMDA a révélé l’expression de sous-unités de récepteur de glutamate dans l’ensemble des muscles du poisson zèbre en développement à 23 heures après la fécondation. Des sections congelées d’embryons post fertilisants de 72 heures ont été montées sur des toboggans et immunotachées pour le phospho-H3, un marqueur des cellules proliférantes.

Plusieurs cellules ont exprimé le phospho-H3 et l’expression était la plus notable aux zones ventriculaires. L’anticorps de contrôle d’IgG de souris et à l’exclusion des anticorps primaires a indiqué un bas niveau d’expression non spécifique. Il est important de choisir des solutions de blocage appropriées et des anticorps secondaires basés sur les anticorps primaires des espèces hôtes afin d’assurer la détection et de minimiser les taches non spécifiques.

L’immunohistochimie doit être vérifiée pour s’assurer que le signal observé est en fait la protéine d’intérêt. Les expériences de suivi impliquent habituellement l’utilisation d’organismes génétiquement ou écologiquement modifiés. L’immunohistochimie permet aux chercheurs d’observer les protéines in situ, accélérant considérablement notre compréhension de nombreux systèmes en biologie fondamentale et appliquée, en particulier pendant le développement embryonnaire.

Le méthanol et le formaldéhyde sont toxiques et doivent être manipulés avec soin. Les déchets doivent être collectés et éliminés selon les procédures institutionnelles.