Name: Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez l'immunohistochimie sur mont entier pour visualiser les protéines dans les embryons et larves de Danio rerio. Cette technique permet l'observation tridimensionnelle sans sectionnement.

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Financement de la subvention des NIH 8P20GM103436 14.

Les procédures de travail avec les adultes reproducteurs de poissons zèbres et les embryons décrits dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'État de Murray.
1. Collection d'embryons et fixation
<ol><li>Préparer les réservoirs de frai en plaçant des paires ou des groupes mixtes de poissons-zèbres adultes dans des réservoirs avec un maillage ou une doublure à fentes remplies d'eau du système pendant la nuit.</li>
	<li>Aux lumières allumées, modifiez l'eau du réservoir de frai pour l'eau fraîche du système afin d'éliminer les excréments. Utilisez un cycle sombre clair de 14 h/10 h avec des lumières qui s'allument à 9 h.</li>
	<li>Une fois les œufs pondus, retournez les adultes dans des réservoirs à la maison.</li>
	<li>Recueillir les œufs en les dessinant à l'aide d'une tuyauterie de transfert ou en les versant dans une passoire en maille.</li>
	<li>Transférer les œufs dans des plats Petri remplis à mi-chemin avec le milieu embryonnaire (comme 30% Danieau ou E2 embryon moyen avec 0,5 mg/L bleu méthylène), limitant le nombre d'embryons par plat à 50.</li>
	<li>Enlever les œufs morts ou qui ne se divisent pas. REMARQUE : Les embryons morts peuvent être facilement identifiés car ils deviennent opaques et semblent souvent « nuageux ». Si le bleu de méthylène est ajouté au milieu embryonnaire, les embryons morts prennent une apparence bleu foncé.</li>
	<li>Incuber les plats d'œufs à 28,5 oC jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade désiré. Pour cette expérience, élever les embryons jusqu'à 23 hpf.</li>
	<li>Facultatif) Transférer les embryons à 24 hpf à 200 M 1-phényl 2-thiourea (PTU) dans le milieu embryonnaire pour prévenir la mélanogenèse16,17. Alternativement, les embryons d'eau de Javel après fixation (voir la section 5 en option).</li>
	<li>Changer l'embryon moyen ou PTU moyen tous les jours.</li>
	<li>Déchorionate embryons non éclos à l'aide de forceps ultra-fin-tip sous un stéréomicroscope. Alternativement, déchorionate chimiqueembryons en couvant dans 1 mg/mL Pronase dans le milieu d'embryon pendant plusieurs minutes à température ambiante. Retirer les embryons de Pronase et les laver trois fois avec le milieu embryonnaire.</li>
	<li>Les embryons déchorions s'en tiendront au plastique. Conservez-les dans des plats Petri en verre ou en plastique recouverts d'agarose de 1 à 2 % dissous dans un milieu embryonnaire. Déplacer les embryons déchorions à l'aide de pipets Pasteur polis au feu pour minimiser les dommages.</li>
	<li>Transférer les embryons dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml à l'aide d'une tuyauterie en plastique ou polie par le feu.</li>
	<li>Retirer le milieu embryonnaire à l'eclec. Ne laisser que suffisamment de liquide pour couvrir les embryons après chaque changement de liquide.</li>
	<li>Préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x salin tamponné par phosphate (PBS) dans une hotte chimique à fumée. CAUTION: PFA est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez-les des liquides et des solides contaminés dans les zones désignées.</li>
	<li>Fixer les embryons en 4% PFA pour 1-2 h avec bascule douce à température ambiante. Alternativement, fixer les embryons de 4 h à la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Laver trois fois en 1x PBS et 1% De Triton-X (PBTriton) pendant 5 min.</li>
	<li>Utilisez les embryons immédiatement ou entreposez-les à 4 oC jusqu'à 1 semaine.</li>
	<li>Pour le stockage à long terme, déshydrater les embryons dans 100% méthanol (MeOH) 2 h ou pendant la nuit à -20 oC. Conserver les embryons à -20 oC à MeOH pendant plusieurs mois. CAUTION: MeOH est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez-les des liquides et des solides contaminés dans les zones désignées.</li>
</ol>2. Préparation d'embryons
<ol><li>Réhydratez les embryons par incubations en série à température ambiante.<ol>
<li>Incuber en 75% MeOH/25% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.</li>
		<li>Incuber en 50% MeOH/50% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.</li>
		<li>Incuber en 25% MeOH/75% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.</li>
		<li>Incuber en 100% PBTriton pendant 5 min, à bascule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Facultatif) Préparer une solution de travail nouvelle protéase K (10 g/mL en PBTriton) sur la glace en ajoutant 10 l de stock de protéase K fraîchement décongelé (10 mg/mL).<ol>
<li>Perméabilisez les embryons en digérant jusqu'à 30 min dans Proteinase K. REMARQUE : Le moment suggéré est de 24 hpf : pas de digestion ; 24 hpf : 15 min de digestion; et 7 jours: 30 min de digestion.</li>
		<li>Rincer les embryons perméabilisés dans PBTriton et re-fixer dans 4% PFA pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Laver les embryons trois fois en PBTriton pendant 5 min à température ambiante avec un léger basculement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Incubation primaire d'anticorps
<ol><li>Sélectionnez une solution de blocage commercial ou un sérum correspondant à l'espèce hôte d'anticorps secondaire (p. ex. 10 % de sérum de chèvre dans PBTriton) avec ou sans 2 mg/mL d'albumine bovine (BSA).</li>
	<li>Bloquer les embryons dans la solution de blocage pendant 1-3 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC pendant le basculement.</li>
	<li>Incuber dans l'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage ou 1% de sérum dans PBTriton pendant la nuit à 4 oC tout en se balançant. Dans cette expérience, les anticorps primaires utilisés étaient anti-NMDAR1, récepteur anti-pan-AMPA, et anti-phospho-Histone H3, chacun dilué à une concentration finale de 1:500 dans 1% de sérum de chèvre dans PBTriton.</li>
	<li>Laver cinq fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante tout en se balançant.</li>
</ol>4. Incubation secondaire d'anticorps
<ol><li>Sélectionnez un anticorps secondaire en fonction de l'espèce hôte de l'anticorps primaire et de la longueur d'onde désirée.</li>
	<li>Incuber dans un anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage ou 1 % de sérum pendant 2 h à température ambiante (ou pendant la nuit à 4 oC) pendant le basculement. REMARQUE : Les anticorps secondaires fluorescents sont sensibles à la lumière. Nous avons utilisé 1:500 chèvre-anti-souris Alexa488 dilué dans 1% sérum de chèvre dans PBTriton.</li>
	<li>Couvrez les tubes de papier d'aluminium ou couvrez-les d'une boîte de blocage de la lumière pour cette étape et toutes les étapes suivantes.</li>
	<li>Laver trois fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante tout en se balançant.</li>
	<li>Transférer les embryons à une solution de glycérol à 50 % dans le PBS sur un lit de 2 % d'agarose dans le milieu embryonnaire et procéder à la documentation ou procéder à d'autres étapes de traitement ci-dessous.</li>
</ol>Étapes facultatives
5. Blanchiment
<ol><li>Préparer la solution d'eau de Javel dans un tube de 1,5 ml en ajoutant 810,7 l de ddH2O, 89,3 l de 2 M KOH, et 100 oL de 30 % H2O2.</li>
	<li>Inverser le tube trois fois pour mélanger.</li>
	<li>Pipette 1 ml de direction de solution d'eau de Javel aux embryons.</li>
	<li>Ouvrez le bouchon du tube embryonnaire pour permettre au gaz de s'échapper. Appuyez doucement sur le tube sur le banc pour déloger les bulles.</li>
	<li>Surveiller le processus de blanchiment (utiliser un microscope si nécessaire) et arrêter la réaction lorsque le pigment est suffisamment enlevé (environ 5 min pour 24 hpf ou 10 min pour 72 hpf).</li>
	<li>Retirez soigneusement la solution de blanchiment à l'égard d'une micropipette et rincez les embryons trois fois en 1 ml de PBTriton. REMARQUE: Les embryons sont collants dans cette étape.</li>
	<li>Passez à la documentation ou à d'autres étapes de traitement ci-dessous.</li>
</ol>6. Dissection d'embryon et dedeyolking
<ol><li>Pour enlever le jaune, transférer une petite quantité (200 l ou assez pour couvrir complètement l'embryon, mais assez restrictive pour limiter l'endroit où il peut flotter) de 1x PBS à une glissière de dépression ou une glissière en verre ordinaire.</li>
	<li>Utilisez un tuyau de transfert en plastique pour déplacer 1 ou plusieurs embryons vers la gouttelette PBS.</li>
	<li>Utilisez des forceps ultra-fins et 00 broches d'insectes pour briser le jaune et gratter très doucement les granules de jaune de la surface ventrale de l'embryon (voir aussi Cheng et al., 2014)18.</li>
	<li>Retirer les granules de jaune et reconstituer le PBS au besoin.</li>
	<li>Répéter l'opération jusqu'à ce que l'embryon soit suffisamment exempt de jaune.</li>
</ol>7. Montage plat sur diapositives
<ol><li>Transférer les embryons deyolked sur une lame de verre chargée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 1 ml avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement). Orientez comme désiré avec une pointe micropipette de 200 l ou une goupille d'insecte.</li>
	<li>Wick loin excès PBS avec une lingette Kim ou essuie-tout.</li>
	<li>Ajouter 2-3 gouttes de support de montage à la diapositive et coverslip.</li>
	<li>Sécher à l'air pendant environ 5 à 10 min.</li>
	<li>Scellez le verre de couverture sur la glissière avec du vernis à ongles transparent. REMARQUE : Les bords du verre de couverture doivent être complètement recouverts d'une fine couche continue de vernis à ongles.</li>
	<li>Laisser sécher environ 10 minutes avant l'imagerie.</li>
</ol>8. Montage à Agarose
<ol><li>Préparer 1 % d'agarose dans le milieu embryonnaire en ajoutant 0,5 g d'agarose à 50 ml de milieu embryonnaire dans un flacon ou un bécher allant au micro-ondes d'au moins 3 fois plus grand que désiré.</li>
	<li>Chauffer au micro-ondes, en tourbillonnant tous les 30 s, jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute.</li>
	<li>Faire 1 mL d'aliquots dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml. Conserver les aliquots à température ambiante.</li>
	<li>Couvrir les bouchons de tube avec des serrures de capuchon avant le chauffage.</li>
	<li>Placer les tubes d'agarose dans un support de tube flottant dans un bécher à moitié rempli d'eau.</li>
	<li>Cuire au micro-ondes le bécher avec des tubes flottants pendant 2-3 min, ou jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondue.</li>
	<li>Transférer un embryon sur la glissière pontée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 200 l avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement).</li>
	<li>Placez l'embryon sur une couverture rectangulaire à l'aide d'épingles d'insectes et ajoutez environ 20 agarose fondue l'année directement à l'embryon.</li>
	<li>Orientez rapidement la région d'intérêt la plus proche de la couverture à l'aide de 00 broches d'insectes. REMARQUE : Il s'agit d'une monture à l'envers.</li>
	<li>Remettre le tube d'agarose dans le flotteur du tube d'eau chaude entre chaque utilisation et micro-ondes au besoin.</li>
	<li>Image à l'aide d'un microscope lorsque l'agarose durcit. Gardez l'embryon monté à l'envers pour être utilisé sur un microscope inversé. Retournez la couverture (de sorte que l'agarose est sous la couverture) pour une utilisation sur les microscopes droits.</li>
</ol>9. Montage sur des glissières pontées
<ol><li>Pour faire des diapositives pontées, collez les couvertures carrées à la glissière en verre à l'aide d'un petit point de superglue. REMARQUE : Il devrait y avoir un creux d'au moins 5 mm de large entre les couvertures. Deux #1 des couvertures élevées sont généralement appropriées pour les embryons de 24 à 48 hpf, tandis que trois couvertures élevées peuvent être nécessaires pour 72 hpf.</li>
	<li>Transférer 1-2 embryons deyolked à la glissière pontée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 200 l avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement).</li>
	<li>Éliminez l'excès de liquide avec une lingette Kim ou une serviette en papier.</li>
	<li>Ajouter une goutte de glycérol de 80 % directement à l'embryon.</li>
	<li>Couvrir d'un verre de couverture rectangulaire. La gouttelette de glycérol doit toucher le verre de couverture.</li>
	<li>Ajouter plus de glycérol à l'espace entre le verre de couverture et glisser au besoin pour couvrir complètement l'embryon avec une marge de glycérol sur les côtés de l'embryon.</li>
	<li>Faites glisser doucement le verre de couverture rectangulaire pour rouler l'embryon en position pour l'imagerie.</li>
</ol>10. DAB Staining
REMARQUE : Cette section commence après l'étape 4.2 ci-dessus et remplace le reste de l'étape 4.
<ol><li>Incuber les embryons dans une solution de blocage à l'aide d'un anticorps secondaire conjugué à la peroxidase pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC pendant le basculement.</li>
	<li>Laver trois fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer les embryons dans une plaque de culture ou une glissière de dépression avec une pipette de transfert.</li>
	<li>Mélanger 50 'L de 1% de DAB (3,3'-diaminobenzidine) dissous en ddH2O et 50 'L de 0,3% de peroxyde d'hydrogène et porter à 1 ml avec PBS. CAUTION: DAB est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez les liquides et les solides contaminés par le DAB dans les zones désignées.</li>
	<li>Couvrez les embryons souillés hrP avec la solution DAB préparée ci-dessus et surveillez le développement des couleurs (généralement 1-5 min) au microscope.</li>
	<li>Après avoir atteint le niveau souhaité de développement des couleurs, rincez brièvement les embryons dans PBS.</li>
	<li>Transférer les embryons dans un tube de 1,5 ml avant la fixation.</li>
	<li>Refixez les embryons de 15 à 20 min en 4 % de PFA à température ambiante.</li>
	<li>Laver les embryons trois fois en PBTriton pendant 5 min.</li>
	<li>Passez à la documentation.</li>
</ol>11. Protocole modifié pour la coloration des tissus sectionnés qui est monté sur des diapositives
<ol><li>Encerclez le tissu à souir avec un stylo pap.</li>
	<li>Transférer les toboggans dans une chambre humide.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS directement sur la diapositive.</li>
	<li>Incuber 7 min à température ambiante pour enlever le milieu d'intégration.</li>
	<li>Verser PBS en inversant la glissière.</li>
	<li>Réhydratez 1 min dans jusqu'à 1 ml de tampon TNT (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween20).</li>
	<li>Bloquer jusqu'à 1 ml de solution de blocage (commercial ou sérum de 10% et 2% BSA) pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Incuber toute la nuit dans un anticorps primaire dilué dans 1 % de sérum ou une solution de blocage à 4 oC.</li>
	<li>Laver cinq fois dans jusqu'à 1 ml de tampon TNT à température ambiante.</li>
	<li>Incuber dans un anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC. Couvrir la chambre de papier d'aluminium ou utiliser un couvercle foncé.</li>
	<li>Laver cinq fois en TNT à température ambiante. Verser le dernier lavage.</li>
	<li>Monter avec 2-3 gouttes de milieu de montage et de coverslip. Laisser s'asseoir 5-10 min.</li>
	<li>Scellez le verre de couverture sur la lame à l'aide de vernis à ongles transparent. Laisser sécher complètement avant l'imagerie.</li>
</ol>12. Documentation
<ol><li>Enregistrez la procédure complète et toutes les déviations dans un cahier de laboratoire.</li>
	<li>Enregistrez la concentration, le nom, le numéro de catalogue, le fabricant et le numéro de lot de l'anticorps primaire.</li>
	<li>Placez l'échantillon correctement monté sur l'étape de microscope. Localiser la région d'intérêt.</li>
	<li>Sélectionnez un exemple relativement lumineux. Définir l'exposition de la caméra et de gain de sorte que le signal est suffisamment lumineux sans saturer.</li>
	<li>Comparez l'intensité de coloration d'une même région d'intérêt en utilisant les mêmes paramètres d'exposition en comparant les embryons expérimentaux étiquetés par anticorps et les embryons d'anticorps témoins (ex. IgG).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont aucune information à divulguer.

L'immunohistochimie est un outil polyvalent qui peut être utilisé pour caractériser l'expression spatio-temporelle de pratiquement n'importe quelle protéine d'intérêt dans un organisme. L'immunohistochimie est utilisée sur une grande variété de tissus et d'organismes modèles. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation chez le poisson zèbre. L'immunohistochimie chez différentes espèces peut nécessiter différentes techniques de fixation et de manipulation, bloquant les solutions selon les espèces et la présence de pe...

Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle puissant pour l'étude des processus biologiques pour plusieurs raisons, y compris le temps de génération court, le développement rapide, et l'agréabilité aux techniques génétiques. En conséquence, le poisson zèbre est couramment utilisé dans les écrans à haut débit de petites molécules pour la recherche toxicologique et la découverte de médicaments. Le poisson zèbre est également un modèle attrayant pour l'étude des processus de développement étant donné qu'une seule femelle peut régulièrement produire 50-300 œufs à la fois et les embryons optiquement clairs se développent à l'extérieur permettant une visualisation efficace des processus de développement. Cependant, les premières recherches se sont surtout appuyées sur des écrans génétiques avancés utilisant n-éthyle-N-nitrosourea (ENU) ou d'autres mutagènes en raison de difficultés à établir des techniques génétiques inversées. Il y a environ deux décennies, les morpholinos ont été utilisés pour la première fois chez le poisson zèbre pour éliminer les gènes ciblés1. Les morpholinos sont de petits oligonucléotides antisens qui inhibent la traduction de l'ARNm cible après la microinjection dans un embryon à un stade de développement précoce. Une faiblesse majeure des morpholinos est qu'ils sont dilués pendant que les cellules se divisent et perdent généralement l'efficacité par 72 heures après la fertilisation (hpf). Tandis que les morpholinos restent un outil puissant pour la perturbation de gène de poisson-zèbre, les nucléases d'effecteur de transcription-comme d'activateur (TALENs), les nucléases de zinc-doigt (ZFNs), et les groupés régulièrement interspaced courtes répétitions palindromic (CRISPRs) sont plus récemment employés pour cibler directement le génome de poisson zèbre2,3. Ces stratégies génétiques inversées, combinées à la génétique avancée et aux écrans à haut débit, ont établi le poisson zèbre comme un modèle puissant pour étudier l'expression et la fonction des gènes.
La capacité d'étudier la fonction de gène exige généralement une évaluation de la distribution spatio-temporelle de l'expression de gène ou de produit de gène. Les deux techniques les plus couramment utilisées pour visualiser de tels modèles d'expression au début du développement sont l'hybridation in situ (ISH) et l'immunohistochimie de montage entier (IHC). L'hybridation in situ a été développée pour la première fois en 1969 et repose sur l'utilisation de sondes d'ARN antisens étiquetées pour détecter l'expression de l'ARNm dans un organisme4. En revanche, les anticorps étiquetés sont utilisés dans l'immunohistochimie pour visualiser l'expression des protéines. L'idée d'étiqueter les protéines pour la détection remonte auxannées 5 des années 1930 et la première expérience du CIH a été publiée en 1941 lorsque des anticorps étiquetés FITC ont été utilisés pour détecter les bactéries pathogènes dans les tissus infectés6. ISH et IHC ont évolué et amélioré de manière significative au cours des décennies suivantes et sont maintenant à la fois couramment utilisés dans le laboratoire de recherche moléculaire et diagnostique7,8,9,10,11. Bien que les deux techniques présentent des avantages et des inconvénients, le CSI offre plusieurs avantages par rapport à l'ISH. Pratiquement, le CSI prend beaucoup moins de temps qu'ISH et est généralement moins coûteux en fonction du coût de l'anticorps primaire. En outre, l'expression de l'ARNm n'est pas toujours une mesure fiable de l'expression des protéines, car il a été démontré chez les souris et les humains que seulement environ un tiers de la variation de l'abondance des protéines peut être expliquée par l'abondance de l'ARNm12. Pour cette raison, IHC est un supplément important pour confirmer les données ISH, si possible. Enfin, le CSI peut fournir des données subcellulaires et de co-localisation qui ne peuvent pas être déterminées par ISH13,14,15. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour détecter de façon fiable des protéines par immunohistochimie dans les embryons et les larves de poissons zèbres de monture entière. Le but de cette technique est de déterminer l'expression spatiale et temporelle d'une protéine d'intérêt dans l'embryon entier. Cette technologie utilise des anticorps primaires spécifiques à l'antigène et des anticorps secondaires étiquetés fluorescents. Le protocole est facilement adaptable pour une utilisation sur les sections de tissu montés sur la diapositive et pour une utilisation avec des substrats chromogéniques au lieu de la fluorescence. Utilisant ce protocole, nous démontrons que le développement du muscle squelettique de poisson zèbre exprime des récepteurs ionotropic de glutamate, en plus des récepteurs d'acétylcholine. Les sous-unités de récepteur de glutamate de type NMDA sont détectables sur le muscle longitudinal à 23 hpf.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium, usage intensif</td><td>Kirkland</td><td></td><td>Toute marque peut être substituée</td></tr><tr><td>Anticorps anti-NMDA</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone H3 (Ser10), clone RR002</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>Récepteur anti-pan-AMPA (GluR1-4)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>MABN832</tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de calcium [Ca(NO3)2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>Sally Hanson</td><td></td><td>Tout vernis à ongles ou durcisseur peut être remplacé</td></tr><tr><td>Dépression (concavité) lame</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>Milieu embryonnaire, Danieau, 30%</td><td></td><td></td><td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES dans de l’eau ultrapure.</td></tr><tr><td>Milieu embryonnaire, E2</td><td></td><td></td><td>7,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 &mu ; M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L bleu de méthylène</td></tr><tr><td>Porte-tube flottant</td><td>Thermo Scientific</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>Microscope composé à fluorescence</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope à fluorescence</td><td>Leica Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre 18 mm x 18 mm</td><td>Corning</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre 22 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>Lames en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Chambre humide avec couvercle</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène, 30 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Immunedge pap pen</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes, taille 00</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4 &middot ; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à mailles</td><td>Oneida N’importe</td><td></td><td>quelle marque peut être substituée</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Serrure à capuchon de micro-tube</td><td>Research Products International</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>Toastmaster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Millipore Sigma</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur à nutation</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1 % TritonX-100 en 1x PBS</td></tr><tr><td>Permount support de montage</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (verre)</td><td>Pyrex</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (plastique)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-phényle 2-thiourée</td><td>Acros</td><td>Organics 207250250</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10x, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x</td><td></td><td></td><td>1x fabriquée à partir de 10x de stock dilué dans dH2</td></tr><tr><td>O Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de reproduction avec couvercle et insert</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + diapositives</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, pH 8,0 ; 150 mM de NaCl ; 0,1 % préadolescents20 ; fabriqué en dH2O</td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Acide trichloracétique (Cl3CCOOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>Scientific S374-500</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Pince ultrafine</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Eau, ultrapure/double distillation</td><td>Fisher Scientific</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

L'immunohistochimie est une technique largement utilisée pour explorer l'expression et la localisation des protéines pendant les états normaux de développement et de maladie. Bien que de nombreux protocoles d'immunohistochimie aient été optimisés pour les sections des tissus et des tissus des mammifères, ces protocoles nécessitent souvent une modification et une optimisation pour les organismes modèles non mammifères. Le poisson zèbre est de plus en plus utilisé comme système modèle dans la recherche fondamentale, biomédicale et translationnelle pour étudier les mécanismes moléculaires, génétiques et biologiques cellulaires des processus de développement. Le poisson zèbre offre de nombreux avantages en tant que système modèle, mais nécessite également des techniques modifiées pour une détection optimale des protéines. Ici, nous fournissons notre protocole pour l'immunohistochimie de fluorescence de montage entier dans les embryons et les larves de poissons-zèbres. Ce protocole décrit en outre plusieurs stratégies de montage différentes qui peuvent être utilisées et une vue d'ensemble des avantages et des inconvénients de chaque stratégie fournit. Nous décrivons également des modifications à ce protocole pour permettre la détection des substrats chromogéniques dans le tissu entier de montage et la détection de fluorescence dans le tissu larvaire sectionné. Ce protocole est largement applicable à l'étude de nombreux stades de développement et structures embryonnaires.

L'immunohistochimie de montage entier emploie des anticorps pour détecter le modèle spatial de l'expression de protéine dans l'animal intact. Le flux de travail de base de l'immunohistochimie (représenté à la figure 1) consiste à élever le poisson zèbre, à élever et à préparer des embryons, à bloquer les antigènes non spécifiques, à utiliser un anticorps primaire spécifique à l'antigène pour cibler la protéine d'intérêt, à détecter cet anticorps primaire avec...

Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

L’immunohistochimie de montage entier est une technique relativement rapide et simple qui permet l’observation spatiale et temporelle des protéines directement dans un tissu ou un organisme utilisant des anticorps étiquetés. L’utilité de cette technique est qu’elle permet la coloration d’un tissu intact ou d’un organisme sans avoir à le sectionner d’abord et la microscopie confoccale peut être utilisée pour générer une représentation tridimensionnelle du modèle d’expression protéique. L’immunohistochimie est largement utilisée dans la recherche biomédicale pour comprendre l’étiologie et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la maladie.C’est également un outil diagnostique valable pour identifier des tumeurs dans des échantillons pathologiques. Pour commencer, préparez des réservoirs de frai remplis d’eau du système et d’une maille ou d’un revêtement fendté en place. Placer les couples de sexe mixte adultes de poisson zèbre en groupes dans les réservoirs pendant la nuit.Utilisez un cycle lumière/obscurité de 14 heures/10 heures avec des lumières qui s’allument à 9 .m. Le lendemain matin, avec les lumières allumées, changer l’eau du réservoir de frai avec de l’eau du système frais pour enlever les excréments. Une fois les œufs pondus, retourner les adultes dans des réservoirs à la maison.Recueillir les œufs en les dessinant à l’aide d’une pipette de transfert. Transférer 50 œufs dans chaque boîte de Pétri remplie à mi-chemin avec un milieu embryonnaire. Enlevez tous les œufs opaques et nuageux qui sont morts ou qui n’ont pas réussi à se diviser.Incuber le plat d’œufs à 28,5 degrés Celsius jusqu’à 23 heures après la fécondation. Si les embryons sont plus âgés que 24 heures après la fécondation, avec une pipette transférer les embryons à 200 PTU micromolaire dans le milieu embryonnaire pour prévenir la mélanogenèse. Au microscope stéréo, déchorionner les embryons non hachés à l’aide de forceps à pointe ultra fine.À l’aide de pipettes Pasteur polies par le feu pour minimiser les dommages, transférez-les dans des boîtes de Pétri en verre ou en plastique recouvertes de 1 à 2 % d’agarose dissoute dans un milieu embryonnaire. Transférez ensuite les embryons dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette en plastique ou polie par le feu. Retirer le milieu embryonnaire à l’aide d’une micropipette.Ne laissez que suffisamment de liquide pour couvrir les embryons. Fixer les embryons en 4%PFA pendant une à deux heures avec un basculement doux à température ambiante. Ensuite, lavez les embryons trois fois en 1X PBS et 1%PBTriton pendant cinq minutes.Utilisez les embryons immédiatement ou conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Pour le stockage à long terme, déshydrater et stocker les embryons dans 100% méthanol à moins 20 degrés Celsius. Pour réhydrater les embryons, effectuez des incubations en série cinq minutes chacune à température ambiante avec des quantités décroissantes de méthanol et de PBS et de PBTriton pour le lavage final.Procéder à la préparation de l’embryon selon le manuscrit. Choisissez une solution de blocage correspondant à l’espèce hôte secondaire d’anticorps, par exemple 10% sérum de chèvre dans PBTriton avec ou sans deux milligrammes par millilitre de BSA. Ajouter 0,5 millilitres de la solution de blocage dans le tube contenant l’embryon et placer le tube sur un rocker pendant une à trois heures à température ambiante.Puis incuber l’embryon dans l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage et PBTriton pendant la nuit à quatre degrés Celsius tout en berçant. Le matin, laver l’embryon cinq fois dans PBTriton pendant 10 minutes chacun à température ambiante tout en basculant. Choisissez ensuite un anticorps secondaire basé sur l’espèce hôte de l’anticorps primaire et la longueur d’onde désirée à 488 nanomètres.Ajouter l’anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage dans le tube contenant l’embryon. Couvrir le tube de papier d’aluminium et incuber pendant deux heures à température ambiante pendant le basculement. Après cela, laver les embryons trois fois dans PBTriton pendant 10 minutes chacun à température ambiante tout en étant recouvert de papier d’aluminium et de bascule.Avec une pipette, transférer les embryons à une solution de 50% glycérol dans PBS sur un lit de 2% agarose dans le milieu embryonnaire. Pour enlever le jaune, transférer 200 microlitres de 1X PBS sur une glissade de dépression ou une glissière en verre ordinaire. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour déplacer un ou plusieurs embryons vers la gouttelette PBS.Utilisez des forceps ultra fins et des broches à double zéro insecte pour briser le jaune et gratter très doucement les granules jaunes de la surface ventrale de l’embryon. Retirer les granules jaunes et les reconstituer en PBS au besoin. Après montage, placez l’échantillon au microscope.Localisez la région d’intérêt en choisissant un exemple relativement lumineux. Ajustez l’exposition à la caméra et gagnez de sorte que le signal soit suffisamment lumineux sans saturer. Lorsque vous comparez entre les embryons expérimentaux étiquetés anticorps et les embryons d’anticorps de contrôle, utilisez les mêmes paramètres d’exposition.Ce protocole de l’immunohistochimie de montage entier est un outil valable pour l’étude de l’expression spatiale et temporelle de protéine utilisant le développement de zebrafish. La sous-unité GluN1 du récepteur du glutamate de type NMDA a révélé l’expression de sous-unités de récepteur de glutamate dans l’ensemble des muscles du poisson zèbre en développement à 23 heures après la fécondation. Des sections congelées d’embryons post fertilisants de 72 heures ont été montées sur des toboggans et immunotachées pour le phospho-H3, un marqueur des cellules proliférantes.Plusieurs cellules ont exprimé le phospho-H3 et l’expression était la plus notable aux zones ventriculaires. L’anticorps de contrôle d’IgG de souris et à l’exclusion des anticorps primaires a indiqué un bas niveau d’expression non spécifique. Il est important de choisir des solutions de blocage appropriées et des anticorps secondaires basés sur les anticorps primaires des espèces hôtes afin d’assurer la détection et de minimiser les taches non spécifiques.L’immunohistochimie doit être vérifiée pour s’assurer que le signal observé est en fait la protéine d’intérêt. Les expériences de suivi impliquent habituellement l’utilisation d’organismes génétiquement ou écologiquement modifiés. L’immunohistochimie permet aux chercheurs d’observer les protéines in situ, accélérant considérablement notre compréhension de nombreux systèmes en biologie fondamentale et appliquée, en particulier pendant le développement embryonnaire.Le méthanol et le formaldéhyde sont toxiques et doivent être manipulés avec soin. Les déchets doivent être collectés et éliminés selon les procédures institutionnelles.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Un moyen rapide pour effectuer immunocoloration des embryons de poisson zèbre coeur est décrite. Comparativement à l'approche immunologique monter ensemble, cette méthode augmente considérablement la pénétration de l'anticorps, ce qui permet d'obtenir des images haute résolution qui révèlent des structures cellulaires / subcellulaires dans le coeur dans un temps de traitement beaucoup plus réduite.

Immunocoloration des Disséqué coeur embryonnaire Zebrafish

Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L'expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée...

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Techniques sont décrites à immunocoloration phospho-épitopes dans embryons de poisson zèbre entiers et ensuite procéder à deux couleurs confocal fluorescent localisation dans des structures cellulaires aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation et d'imagerie peuvent définir l'emplacement et de la cinétique de l'apparition ou de l'activation de protéines spécifiques.

Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

Ce protocole démontre l'immunofluorescence séquentielle et l'immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.

Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés

Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l'imagerie sur n'importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations.

Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie de coupes embryonnaires de poisson-zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. Il est utile de détecter les schémas d’expression de deux gènes chez le poisson zèbre s’il y a une pénurie d’anticorps.

In situ Hybridation combinée à l’immunohistochimie dans des embryons de poisson-zèbre cryosectionnés

Un protocole d’imagerie in vivo du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle est présenté ici. La procédure expérimentale comprend la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et la visualisation.

In vivo Imagerie du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle

Découvrez l'immunohistochimie sur mont entier pour visualiser les protéines dans les embryons et larves de Danio rerio. Cette technique permet l'observation tridimensionnelle sans sectionnement.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

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