Name: In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez une stratégie thérapeutique pour augmenter l'induction des cellules T régulatrices gut-homing via des cellules dendritiques génétiquement modifiées. Cette méthode s'applique aux environnements pro-inflammatoires et offre des perspectives pour l'immunothérapie clinique.

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Ce travail a été soutenu par le Bureau du sous-secrétaire à la Défense pour les affaires de santé dans le cadre du Programme de recherche médicale révisé par les pairs dans le cadre du Prix No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles de l'auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Ce travail a également été partiellement soutenu par des subventions pour l'innovation en recherche du Département de médecine de l'Université de Loma Linda (681207-2967 [XT et GG], 681205-2967 [XT], et 325491 [DJB]).

Tous les protocoles d'étude des animaux in vivo ont été examinés et approuvés par le Loma Linda University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ainsi que par le Bureau d'examen des soins et de l'utilisation des animaux (ACURO) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research Ministère de la Défense.
1. Préparation du Lentivirus qui exprime à la fois 1-hydroxylase et RALDH2 (lenti-CYP-ALDH Virus)
<ol><li>Jour 0 : Tôt le matin, préparez 5 x 105 cellules/mL de cellules 293T dans le milieu de culture cellulaire CM-10-D.</li>
	<li>Graines 20 ml/plaque dans des plats de culture de 150 mm x 25 mm. Culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h. La confluence atteindra 80 à 90 % après 24 h.</li>
	<li>Jour 1: Faire 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, et 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Faire 2 M CaCl2 et conserver à température ambiante.</li>
	<li>Pour chaque plat de culture de 150 mm x 25 mm, préparer un mélange de précipitations d'ADN dans un tube de culture stérile de 50 ml. Tout d'abord, ajoutez 1 620 oL de 2x HBS, 9,5 g de PMD2G (VSVG), 17,5 g de pCMVR8,74 (Capsid), 27 g de plasmide Lenti-CYP-ALDH (un vecteur lentiviral qui transporte à la fois CYP27B1 et ALDH1a2). Deuxièmement, ajouter H2O à un volume final de 3 037,5 L.</li>
	<li>Dans le dernier, ajouter 202,5 l de 2 M CaCl2 goutte à goutte tout en mélangeant la solution aux concentrations finales de 1x HBS et 125 mM CaCl2. CaCl2 doit être le dernier à être ajouté. Laisser les mélanges de transfection à température ambiante pendant 20 min avec un mélange occasionnel. Pour plusieurs plats de culture de 150 mm x 25 mm, agrandir en conséquence.</li>
	<li>Ajoutez les 3 240 L de mélange de précipitations d'ADN dans le sens de la chute à un plat de culture de 150 mm x 25 mm contenant les cellules 293T. Faites tourbillonner doucement le plat de culture d'un côté à l'autre tout en ajoutant le mélange de précipitations d'ADN. Incuber le plat à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Jour 2 : Retirez la solution de transfection de phosphate de calcium, lavez doucement avec 1x PBS, et redonnez la culture cellulaire avec le milieu de culture cellulaire CM-4-D. Incuber les cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Jour 3 : Récoltez les supernatants dans des bouteilles de rangement stériles et entreposez-les à 4'8 oC. Reconstituer la culture cellulaire avec frais CM-4-D milieu de culture cellulaire. Culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pour 24 h.</li>
	<li>Jour 4: Récoltez les supernatants dans des bouteilles de rangement stériles. Filtrer les supernatants du Jour 3 et du Jour 4 à travers un filtre de 0,45 m. Pour concentrer le virus pseudotype VSVG, transférer les supernatants dans des tubes de centrifugeuse et tourner à 4 780 x g pendant 24 h à 4 oC.</li>
	<li>Jour 5 : Versez les supernatants des granulés (le granule est souvent visible) et laissez les tubes s'écouler sur un essuie-tout dans une armoire stérile de biosécurité pendant plusieurs minutes.</li>
	<li>Resuspendre les granulés par pipetting avec PBS stérile contenant 5% de glycérol. Le volume de la suspension sera de 33,3 L par 150 mm x 25 mm plat de culture.</li>
	<li>Aliquot 200 l/tube et magasin à -80 oC. Faire un aliquot séparé de 50 l/vial à des fins de titration. Les titers doivent être dans la fourchette de 108à 109 unités de transduiseur (TUs)/mL.</li>
	<li>Ajouter de l'eau de Javel dans les plats de culture et les jeter. REMARQUE : Ces cellules transfectées sont la plus grande préoccupation de sécurité dans le protocole puisque tous les éléments lentiviraux sont exprimés dans les cellules.</li>
</ol>2. Génération de DCdérivés dérivés de moelle osseuse (BMDCs)
<ol><li>Récoltez les tibias et les fémurs de 4 à 5 souris Balb/c dans un tube de polypropylène stérile de 50 ml contenant le milieu de culture6.</li>
	<li>Transférer les tibias et les fémurs dans un plat de culture de 100 mm x 20 mm contenant le milieu de culture. Enlever les tissus tels que les muscles des tibias et des fémurs à l'aide de ciseaux et de forceps disséquants.</li>
	<li>Couper les deux extrémités des tibias et des fémurs pour exposer la cavité de la moelle osseuse.</li>
	<li>Dessiner 10 ml de culture dans une seringue de 10 ml attachée à une aiguille de 30 G.</li>
	<li>Insérez soigneusement l'aiguille dans la cavité de la moelle osseuse et rincer la moelle osseuse dans un tube de polypropylène stérile propre de 50 ml. Répétez cette procédure si nécessaire, pour s'assurer que la moelle osseuse a été complètement vidée.</li>
	<li>Pelleter les cellules de la moelle osseuse par centrifugation (400 x g) à 2'8 oC pendant 5 min. Aspirez le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre la pastille avec 5 ml de tampon de lyse des globules rouges 1x.</li>
	<li>Incuber les cellules à température ambiante pendant 4 à 5 min avec des secousses occasionnelles.</li>
	<li>Arrêtez la réaction en ajoutant 30 ml de milieu de culture.</li>
	<li>Pelleter les cellules par centrifugation (400 x g) à 2'8 oC pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 10 ml de cm-10-R milieu de culture cellulaire. Si nécessaire, les cellules peuvent être passées à travers une passoire à cellules de 40 m pour enlever les débris.</li>
	<li>Effectuer un compte cellulaire et ajuster les cellules à 1 x 106 cellules/mL en utilisant le milieu de culture cellulaire CM-10-R.</li>
	<li>Ajouter le granulocyte murine recombinant/macrophage facteur de stimulation de la colonie (GM-CSF, concentration finale de 100 U/mL) et interleukine-4 murine (IL-4, concentration finale 10 U/mL). REMARQUE : Les solutions de stock de GM-CSF et d'IL-4 sont stockées à -80 oC à 100 000 U/mL (1 000x) et 10 000 U/mL (1 000x), respectivement.</li>
	<li>Distribuer les cellules dans 6 plaques de culture de puits à 4 ml/puits et la culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pour 48 h.</li>
	<li>Enlever les cellules non adhérentes avec un tuyauterie doux.</li>
	<li>Ajouter le milieu de culture cellulaire CM-10-R frais contenant le GM-CSF (100 U/mL) et l'IL-4 (10 U/mL). Culture les cellules pour un autre 48 h.</li>
	<li>Récoltez les cellules non adhérentes (BMDC) pour la transduction par le virus lenti-CYP-ALDH.</li>
</ol>3. Transduction des CD avec le virus lenti-CYP-ALDH pour générer des cellules DC-CYP-ALDH
<ol><li>Préparer 1 x 106 DC/puits dans un volume total de 0,5 ml de milieu de culture cellulaire CM-10-R contenant 50 l de virus et 8 protaminede g/mL dans une plaque de culture de 6 puits.</li>
	<li>Culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Remplacer le milieu par un milieu de culture cellulaire CM-10-R frais et la culture des cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pour un autre 24 h. À ce stade, les activités enzymatiques de 1-hydroxylase et RALDH2 peuvent être évaluées (voir l'étape 4). Si nécessaire, répétez les étapes 3.1-3.3 pour une deuxième transduction.</li>
	<li>Ajouter le lipopolysaccharide (100 ng/mL) et la culture des cellules pendant 24 h.</li>
	<li>Récoltez les cellules (cellules DC-CYP-ALDH) pour des expériences.</li>
</ol>4. Évaluation de la sur-exprimée 1-hydroxylase et RALDH2 dans les cellules DC-CYP-ALDH
<ol><li>Évaluation de la sur-exprimée 1-hydroxylase dans les cellules DC-CYP-ALDH<ol>
<li>Graine 1.0 x 106 cellules DC-CYP-ALDH/puits dans 2 ml de milieu de culture cellulaire CM-10-R dans 12 plaques de culture de puits.</li>
		<li>Ajouter 25 (OH)D à la concentration finale de 2,5 M. Incuber les cellules DC-CYP-ALDH pendant 24 h.</li>
		<li>Récoltez les supernatants et entreposez-les à -20 oC.</li>
		<li>Analyse de 1,25 (OH)2Concentrations De D chez les supernatants à l'aide d'un radioimmunoassay (RIA) disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Déterminer l'expression de l'hydroxylase de 1 o-hydroxylase dans les cellules DC-CYP-ALDH par tri des cellules activées par fluorescence (FACS) à l'aide d'un anticorps anti-CYP27B1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Évaluation du RALDH2 surexprimé dans les cellules DC-CYP-ALDH REMARQUE : L'expression et l'activité du RALDH2 surexprimé sont déterminées à l'aide d'un kit commercial de détection de déhydrogénase d'aldéhyde (ALDH) (voir Tableau des matériaux).<ol>
<li>Graine 1 mL de DC-CYP-ALDH ou cellules témoins (1 x 105 cellules/mL en tampon d'analyse) dans chacun des deux tubes de 5 ml (l'un étiqueté comme « Contrôle » et l'autre étiqueté comme « Test »).</li>
		<li>Ajouter 10 lde de solution de diéthylaminobenzaldéhyde (DEAB) (1,5 mm d'éthanol à 95 %) à chacun des tubes témoins et mélanger immédiatement. LE DEAB est un inhibiteur de RALDH2.</li>
		<li>Ajouter 5 ll de substrat de fluorescence RALDH activé (300 M) dans les tubes de contrôle et d'essai et mélanger immédiatement.</li>
		<li>Incuber les tubes pendant 45 min.</li>
		<li>Pelleter les cellules par centrifugation à 400 x g à 2'8 oC pendant 5 min. Aspirez les supernatants.</li>
		<li>Reconstituer les cellules en 200 l de tampon d'assay.</li>
		<li>Gardez les cellules sur la glace et procédez à l'analyse par LE FACS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers%2C+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li>
<li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li>
<li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li>
<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
</ol>

Xiaolei Tang et David J. Baylink sont les inventeurs d'un brevet en instance lié à cette étude.

Dans cet article nous décrivons l'utilisation des cellules de DC-CYP-ALDH, pour augmenter l'induction des cellules de Treg d'intestin-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques. Nos données ont montré que les cellules DC-CYP-ALDH peuvent synthétiser localement des concentrations élevées de novo de 1,25 (OH)2D et RA in vitro en présence de substrats correspondants (c.-à-d. 25[OH]D et rétinol, respectivement). Puisque les concentrations suffisantes de sang de 25(OH)D et de rétinol peuvent être facilement ré...

La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu'une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse1,2. Pour cette raison, actuellement disponibles U.S. Food and Drug Administration (FDA) médicaments approuvés inhibent les fonctions des médiateurs inflammatoires ou de bloquer le homing des cellules immunitaires dans l'intestin. Cependant, les médiateurs inflammatoires et les cellules immunitaires qui sont ciblées sont également nécessaires pour les défenses immunitaires. En conséquence, les inhibiteurs inflammatoires de médiateur compromettent la défense immunitaire systémique et les bloqueurs de homing de cellules immunitaires affaiblissent la défense immunisée d'intestin, qui peuvent mener aux conséquences graves3,4. En outre, les bloqueurs de homing de cellules immunitaires peuvent également bloquer le homing des cellules t (Treg) réglementaires dans l'intestin et ainsi peuvent aggraver la tolérance immunitaire d'intestin déjà compromise dans les patients d'IBD. En outre, le blocage de la cellule Treg homing dans l'intestin peut également conduire à la suppression immunitaire systémique en raison de l'accumulation de cellules Treg dans le sang5. Enfin, les inhibiteurs et les bloqueurs fonctionnent de façon transitoire et, par conséquent, nécessitent des administrations fréquentes. L'administration fréquente de ces inhibiteurs et bloqueurs peut exacerber davantage les effets secondaires fâcheux.
Récemment, nous avons proposé une nouvelle stratégie qui peut potentiellement atténuer ou même éliminer les effets secondaires associés aux médicaments actuels pour le traitement des MII6. Cette stratégie augmente l'induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6. La raison d'être de cette stratégie est que les cellules Treg gut-homing spécifiquement à la maison à l'intestin et donc ne compromettra pas les défenses immunitaires systémiques. En outre, puisque les cellules de Treg peuvent potentiellement former la mémoire7,8, cellules de Treg gut-homing peuvent potentiellement fournir un contrôle stable de l'inflammation chronique d'intestin dans les patients d'IBD et, ainsi, le traitement ne devrait pas devoir être administré aussi fréquemment. En outre, puisque cette stratégie augmente l'induction de cellules Treg gut-homing in vivo, il n'a pas le souci de l'instabilité in vivo dans un environnement hautement proinflammatoire qui est associé au transfert adoptif des cellules Treg générées in vitro9,10. À cet égard, les cellules Treg générées in vitro sont l'une des stratégies proposées pour le traitement des maladies auto-immunes11,12,13 et le rejet de transplantation14,15. Enfin, dans cette stratégie, les cellules dendritiques (DC) sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo : la vitamine D active (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25(OH)2D et RA parce que 1,25 (OH)2D peut induire l'expression de molécules régulatrices (p. ex., boîte à fourche P3 [foxp3] et interleukine-10 [IL-10])16,17 et que la RA peut stimuler l'expression des récepteurs gut-homing dans les lymphocytes T18. Parce que les deux 1,25(OH)2D et RA peut également tolériser DCs28,29, nous raison non plus que les DC machinés seront maintenus de façon stable dans un statut tolérogène in vivo et donc contourner les préoccupations d'instabilité in vivo qui sont associés à des DC tolérogènes générés in vitro (TolDCs)19,20,21. À cet égard, les TolDC sont également l'une des stratégies proposées pour l'augmentation in vivo des fonctions cellulaires Treg19,20,21. Pour soutenir notre raisonnement, nous avons montré que les DC s'est fait ingénieur, lors d'une livraison in vivo, peut augmenter l'induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6.
Un autre avantage de notre stratégie proposée est que 1,25 (OH)2D a également d'autres fonctions qui peuvent potentiellement bénéficier aux patients atteints de MII. Ces autres fonctions comprennent la capacité de 1,25 (OH)2D pour stimuler la sécrétion d'antimicrobiens22 et pour supprimer la carcinogenèse23. Les infections et les cancers sont fréquemment associés aux MII24,25.
Pour générer les DC qui peuvent produire localement des concentrations élevées de 1,25 (OH)2D et RA de novo, nous utilisons un vecteur lentiviral pour concevoir des DC pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 sous-famille B membre 1 (CYP27B1) qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase (1-hydroxylase), qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L'autre gène est la déhydrogénase d'aldéhyde 1 membre de la famille A2 (ALDH1a2) qui code la déhydrogénase rétinienne 2 (RALDH2), qui catalyse physiologiquement la synthèse de RA6.
Parce que l'augmentation in vivo de l'induction des cellules Treg intestinale est potentiellement importante dans le traitement des MII, dans le protocole suivant, nous détaillerons les procédures de production des DC de 1-hydroxylase-RALDH2-overexpressing (dC-CYP-ALDH) qui peut être utilisé pour l'étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.

<table><tbody><tr><td>Seringues de 10 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture de 100 mm x 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture à 12 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture de 150 mm x 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-hydroxycholécalciférol (25[OH]D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 21985023</td><td></td></tr><tr><td>plaques de culture à 6 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR kit Stemcell</td><td>Technologies</td><td>Cat# 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D milieu</td><td></td><td></td> de culture cellulaire <td>DMEM contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS), 100 U/ml de pénicilline/streptomycine, 0,055 mM de 2-mercaptoéthanol (2-ME), 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM d’acide aminé non essentiel et 2 mM de L-glutamine.</td></tr><tr>Milieu <td></td><td></td><td>de culture cellulaire CM-10-R</td><td>Milieu RPMI 1640 (sans glutamine) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U/ml de pénicilline/streptomycine, 0,055 mM de 2-mercaptoéthanol (2-ME), 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM d’acide aminé non essentiel et 2 mM de L-glutamine.</td></tr><tr>Milieu <td></td><td></td> de <td>culture cellulaire CM-4-D</td><td>Milieu DMEM contenant 4 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U/ml de pénicilline/streptomycine, 0,055 mM de 2-mercaptoéthanol (2-ME), 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM d’acide aminé non essentiel et 2 mM de L-glutamine.</td></tr><tr><td>Filtres à vide pour bouteilles Corning, 0,22 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Filtres sous vide pour bouteilles Corning, 0,45 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td> <td>fœtal bovinThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 16000044</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lysing Gibco ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>Cat# 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>Des</td><td>CYP27B1 de souris de 1,6 kb et des ADNc ALDH1a2 fabriqués sur mesure ont été amplifiés par PCR à l’aide d’un plasmide contenant l’ADNc CYP27B1 et d’un plasmide contenant l’ADNc ALDH1a2 respectivement (GeneCopoeia). Le fragment d’ADNc CYP27B1 amplifié avec une séquence d’entrée du ribosome 5' KOZAK a été cloné dans le vecteur lentiviral pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE (Addgene). La construction résultante a été désignée comme lenti-CYP-GFP. Le fragment d’ADNc amplifié d’ALDH1a2 a été cloné dans le lenti-CYP-GFP pour remplacer le GFP et a été désigné comme lenti-CYP-ALDH. Ce plasmide bicisternique exprime CYP27B1 contrôlé par le promoteur SFFV et ALDH1a2 contrôlé par le promoteur PGK.</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3755</td><td></td></tr><tr><td>Murin GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 315-03</td><td></td></tr><tr><td>Murin IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Aiguilles Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>Cat# 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>Addgene</td><td>Plasmide# 22036</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#15140148</td><td></td></tr><tr><td>Phoshate Balanced Solution ( PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 12259</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polypropylène, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polypropylène, 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de protamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P3369</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit contrôle polycloncal des isotypes IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab171870</td><td></td></tr><tr><td>Radio-immunodosage pour la mesure 1,25(OH)2D</td><td>Heartland Assays</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen, sans glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# : 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td> <td>Sorvall Legend XTRThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à cellules stériles, 40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles de stockage stériles, 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu'une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse. Nous avons récemment montré que les cellules T (Treg) réglementaires gut-homing sont une thérapie prometteuse pour IBD. En conséquence, cet article présente un protocole pour l'augmentation in vivo de l'induction de cellules de Treg gut-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo, la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25 (OH)2D et RA basé sur des résultats précédents montrant que 1,25 (OH)2D peut induire l'expression de molécules régulatrices (par exemple, boîte de tête de fourchette P3 et interleukine-10) et que la RA peut stimuler l'expression des récepteurs gut-homing dans les cellules T. Pour générer de telles cellules dendritiques machinées, nous utilisons un vecteur lentiviral pour transduire les cellules dendritiques pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 membre de la sous-famille B 1 qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase, qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L'autre gène est le déshydrogénase aldéhyde 1 membre de la famille A2 qui code la déshydrogénase rétinienne 2, qui catalyse physiologiquement la synthèse de la PR. Ce protocole peut être utilisé pour l'étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.

Les cellules de DC-CYP-ALDH ont exprimé la quantité sensiblement accrue de 1-hydroxylase. Pour déterminer si les cellules DC-CYP-ALDH générées à partir de BMDCs ont exprimé une quantité significativement accrue de cellules de 1-hydroxylase, les BMDC ont été transduisés avec le virus lenti-CYP-ALDH pour produire des cellules DC-CYP-ALDH dérivées de la moelle osseuse (cellules BMDC-CYP-ALDH). Par la suite, les cellules bMDC-CYP-ALDH ont été examinées pour l'expression de 1-hydroxylase par FACS. Nos données...

Ici nous présentons un protocole pour l'augmentation in vivo de l'induction réglementaire de cellule T d'intestin-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et de la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA) de novo.

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Ce protocole décrit une stratégie thérapeutique potentiellement nouvelle qui peut être facilement modifiée pour des applications humaines. Cette technique améliore directement l’induction des lymphocytes T régulation gut-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques et peut être habilement mis en œuvre, même dans des environnements hautement pro-inflammatoires. Ces techniques peuvent également être utilisées pour étudier le rôle de la vitamine D active et de la vitamine A dans le système immunitaire périphérique.Cette démonstration visuelle fournira des instructions étape par étape pour la génération de cellules dendritiques d’ingénierie de haute qualité qui sont essentielles au succès de cette technique. Commencez par ensemencer une fois 10 aux sept cellules 293T dans 20 millilitres de milieu de culture cellulaire CM-10-D en 150 par 25 plaques de culture millimétriques pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajoutez 1,62 millilitres de solution HBS fraîchement préparée à deux concentrés, 9,5 microgrammes de plasmide d’enveloppe, 17,5 microgrammes de plasmide d’emballage et 27 microgrammes du plasmide LENTI-CYP-ALDH à un tub

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