Générer des paysages chimiques contrôlés et dynamiques pour étudier le comportement microbien

Cette méthode permet d’élucider l’écologie microscale et le comportement des micro-organismes naviguant dans les gradients chimiques dynamiques et de découvrir leurs compromis cachés, leur cinétique nutritive et leur dynamique des populations dans des microenvironnements écologiquement pertinents. En combinant la technologie microfluidique avec la photolyse, nous générons des impulsions chimiques contrôlées, où le chimioattractant localisé devient soudainement disponible à l’échelle micrométrique, pour mesurer la réponse chimiootactic des populations microbiennes d’abord exposées à des gradients chimiques instables. Concevez le canal à l’aide d’un logiciel CAO et imprimez-le sur un film transparent pour créer le masque photo.

Fabriquez le maître par lithographie douce dans une pièce propre, selon le manuscrit. Préparer un mélange PDMS en combinant l’élastomer avec son agent de séchage à un rapport de 10 pour un dans un bécher de 40 millilitres. À l’aide d’un couteau en plastique, mélanger vigoureusement jusqu’à ce que le liquide soit homogène.

Dégazer immédiatement le mélange PDMS dans une chambre à vide pendant 45 minutes à température ambiante. Pour accélérer le processus, relâchez périodiquement le vide afin d’éclater les bulles qui se forment à l’interface. Retirer la poussière de la surface du maître à l’aide d’un nettoyant pressurisé.

Verser ensuite le mélange de PDMS dégazé sur le maître et le cuire au four à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Couper le PDMS avec une lame autour des microstructures à une distance d’environ cinq millimètres, puis peler soigneusement le PDMS du maître. Percer des trous pour servir d’entrée et de sortie du microcanal.

Sceller le microcanal avec du ruban adhésif pour éviter l’accumulation de poussière. Concevez la forme 3D à l’aide d’un logiciel de conception 3D et imprimez le maître pour le moule PDMS avec une imprimante 3D haute résolution. Après avoir préparé et dégazé le mélange PDMS comme cela a été fait précédemment, nettoyez la surface du maître en tamponnant avec du ruban adhésif.

Mettez le maître sur une échelle. Ensuite, tout en évitant la région centrale du maître, versez 23,4 grammes de mélange PDMS non durci afin d’obtenir la hauteur désirée de PDMS en faisant correspondre la hauteur du maître à 0,5 millimètre. Retirez les bulles restantes à l’aide d’air comprimé.

Placer le PDMS jeté sur le maître dans un four à 45 degrés Celsius pour cuire au moins 12 heures. Ensuite, décollez doucement la couche de PDMS durcie, et perforez les trous d’entrée et de sortie pour l’injection de la suspension bactérienne. Activez à la fois la surface d’une boîte de Pétri et le moule PDMS avec du plasma d’oxygène pendant deux minutes.

Lier le moule PDMS sur la boîte de Petri en appuyant doucement sur le moule à la boîte de Pétri. Évitez de presser l’endroit où se trouvent les caractéristiques. Placer la boîte de Pétri collée au moule PDMS 3D dans un four à 45 degrés Celsius pendant au moins 12 heures pour renforcer le lien chimique.

Ensuite, activez la membrane nanoporeuse en polycarbonate dans une chambre plasmatique à oxygène pendant une minute à température ambiante. Sous un capot chimique, diluer une solution commerciale de 3 aminopropyltriethoxysilane dans l’eau déionisée à 1% en volume à l’aide d’un tube de polypropylène. Transférer la solution diluée de 3 aminopropyltriethoxysilane dans une boîte de Pétri et plonger la membrane activée dans la solution 3-aminopropyltriethoxysilane pendant 20 minutes.

Ensuite, retirez la membrane de la solution 3-aminopropyltriethoxysilane avec des pinces à épiler, et placez-la sur un lingette de pièce propre pour sécher. Pour la fabrication des canaux microfluidiques PDMS qui se trouveront sur la membrane et permettront le lavage de l’arène bactérienne, répétez la fabrication du dispositif microfluidique pour l’expérience d’impulsion chimique unique comme cela a été fait précédemment. Pour lier les canaux de lavage PDMS à la membrane fonctionnalisée, activez d’abord le canal de lavage PDMS et la membrane en polycarbonate avec une chambre plasmatique à oxygène pendant deux minutes.

Immédiatement après le traitement au plasma, mettre en contact la membrane fonctionnalisée et le canal de lavage PDMS en appuyant doucement sur le canal de lavage PDMS sur la membrane. Il est important de presser doucement ensemble le PDMS et la membrane, ou la membrane pourrait être irréversiblement collée au plafond du microcanal PDMS de 200 micromètres de hauteur. Ensuite, activez à la fois la membrane de polycarbonate de canal de lavage PDMS collée et le moule PDMS 3D précédemment collé à la boîte de Petri en les plaçant dans une chambre plasmatique à oxygène pendant deux minutes.

Sandwich de la membrane entre deux couches PDMS, et appuyez ensemble. Placer la boîte de Pétri collée à la structure du sandwich dans un four à 45 degrés Celsius pendant au moins 12 heures pour renforcer le lien chimique. Pour commencer, maintenir la chambre millifluidique sous vide pendant 20 minutes.

Ensuite, placez la boîte de Pétri contenant la chambre millifluidique sur une scène de microscope. À l’aide d’une pipette, remplir la chambre sous la membrane de la suspension bactérienne diluée du Vibrio ordalii fluorescent GFP dans une solution 4-méthoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate dans l’eau de mer artificielle. Après avoir rempli le canal avec la suspension bactérienne, sucer la solution en excès avec une serviette en papier, et sceller l’entrée et la sortie avec des bouchons PDMS en les appuyant doucement dans les trous.

Remplissez une seringue d’une solution artificielle d’eau de mer d’un millimolaire 4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate, et fixez le tube à l’entrée et à la sortie du canal de lavage au-dessus de la membrane. Connectez le tube à un réservoir de déchets et assurez-vous que le tube est entièrement immergé dans le réservoir de déchets liquides afin d’éviter les oscillations de pression. Réglez le débit de la pompe à seringues à 50 microlitres par minute.

Démarrez la pompe à seringues pour établir le débit dans le canal de lavage au-dessus de la membrane. Démarrez le logiciel contrôlant le faisceau LED et l’étape du microscope, et générer des séquences définies par l’utilisateur d’impulsions à différents endroits et avec des intensités différentes. Enregistrez la vidéo à l’aide d’un objectif 4x à intervalles réguliers sur une période de plusieurs heures et sur plusieurs endroits contigus pour couvrir une grande surface.

Dans cette étude, les dispositifs microfluidiques et millifluidiques ont été utilisés pour étudier la réponse chemotactique bactérienne et les profils d’accumulation dans des conditions nutritives dynamiques. Les projections d’intensité maximale montrent la position bactérienne, indiquée par des traces blanches, sur un intervalle de 0,5 seconde immédiatement après la libération de l’impulsion et 40 secondes après la libération de l’impulsion. Les trajectoires bactériennes ont également été montrées en noir 60 secondes après la libération de l’impulsion.

La région ombragée représente l’impulsion chimique libérée par photolyse à l’époque zéro seconde au milieu du champ de vision, qui s’est ensuite diffusée. La concentration bactérienne, ainsi que la dynamique temporelle de la vitesse de dérive radiale suite à une libération d’impulsion au centre du champ de vision sont montrés ici. Les valeurs négatives de la vitesse de dérive correspondent au mouvement chemotactic dirigé vers le centre de l’impulsion.

Les statistiques de natation sont présentées ici pour une population bactérienne en l’absence de gradients chimiques. Les trajectoires représentent les projections bidimensionnelles du mouvement bactérien tridimensionnel dans le microcanal. La distribution de probabilité de la vitesse bactérienne mesurée de natation a été adaptée par une distribution gamma.

Des trajectoires bactériennes, la répartition des probabilités du temps entre les réorientations successives a été extraite. Le modèle de réorientation, la répartition de la vitesse de nage et les statistiques de réorientation des organismes ont été utilisés pour éclairer un modèle individuel. Cette méthode a été testée sur la bactérie marine Vibrio ordalii effectuant des chimiotaxis vers le glutamate aux acides aminés, mais la méthodologie proposée s’applique largement à différentes combinaisons d’espèces et de chimioattractants, ainsi qu’aux processus biologiques au-delà de la chimiotaxis, tels que la dynamique de la population et de la communauté dans des conditions spatialement hétérogènes et dynamiques.

Les techniques classiques d’écologie microbienne et de microbiologie, telles que les croissances dans les cultures par lots ou les chemostats, ont largement ignoré les caractéristiques spatio-temporelles des habitats microbiens. La création quasi instantanée d’impulsions chimiques aux microscales par photolyse vise à reproduire le type d’impulsions nutritives que les bactéries marines rencontrent à l’état sauvage à partir d’un éventail de sources, par exemple, la propagation diffusive des panaches derrière l’enfoncement de particules organiques ou la propagation des nutriments à partir de cellules phytoplanctoniques lysées. La solution d’aminosilane est extrêmement toxique et doit être manipulée avec un soin extrême.

Nous travaillons exclusivement sous le capot de fumée et portons l’équipement protecteur comme le manteau de laboratoire, les lunettes de sécurité, et les gants. Nous nous occupons également des déchets que nous avons générés.