Name: Petits poissons, grandes questions : une collection de techniques modernes pour la recherche sur les tétras mexicains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 2 s
Description: Découvrez des protocoles modernes pour manipuler les gènes et analyser le comportement chez Astyanax mexicanus. Ces méthodes standardisées facilitent l'étude de la biologie du développement et de l'évolution.

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Les auteurs remercient le financement des National Institutes of Health (NH089934, DK108495). F. Leal et A. Powers sont remerciés pour l’édition.

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<li>McGaugh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Lyon, A., Powers, A. K., Gross, J. B., O'Quin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+-+Three+loci+control+scleral+ossicle+formation+via+epistasis+in+the+cavefish+astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Two - Three loci control scleral ossicle formation via epistasis in the cavefish astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 12, (2017).</li>
<li>Atukorala, A. D. S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+between+altered+tooth+and+eye+development+in+lens-ablated+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage between altered tooth and eye development in lens-ablated Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. , (2018).</li>
<li>Gore, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+mechanism+for+cavefish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration.</a> Nature Ecology & Evolution. 2, 1155-1160 (2018).</li>
<li>Sumner-Rooney, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kingdom+of+the+blind%3A+disentangling+fundamental+drivers+in+the+evolution+of+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">The kingdom of the blind: disentangling fundamental drivers in the evolution of eye loss.</a> Integrative and Comparative Biology. , (2018).</li>
<li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).</li>
<li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regressive+Evolution+in+the+Mexican+Cave+Tetra%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regressive Evolution in the Mexican Cave Tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17, 452-454 (2007).</li>
<li>Protas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-trait+evolution+in+a+cave+fish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus.</a> Evolution & Development. 10, 196-209 (2008).</li>
<li>Stahl, B. A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+Mc1r+gene+expression+are+associated+with+regressive+pigmentation+in+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Alterations in Mc1r gene expression are associated with regressive pigmentation in Astyanax cavefish.</a> Development Genes and Evolution. 225, 367-375 (2015).</li>
<li>McCauley, D. W., Hixon, E., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+pigment+cell+regression+in+the+cavefish+Astyanax%3A+A+late+step+in+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Evolution of pigment cell regression in the cavefish Astyanax: A late step in melanogenesis.</a> Evolution & Development. 6, 209-218 (2004).</li>
<li>Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+convergence+on+sleep+loss+in+cavefish+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations.</a> Current Biology. 21, 671-676 (2011).</li>
<li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13, 15(2015).</li>
<li>Jaggard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+line+confers+evolutionarily+derived+sleep+loss+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 284-293 (2017).</li>
<li>Jaggard, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocretin+underlies+the+evolution+of+sleep+loss+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Duboué, E. R., Borowsky, R. L., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-adrenergic+signaling+regulates+evolutionarily+derived+sleep+loss+in+the+mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">β-adrenergic signaling regulates evolutionarily derived sleep loss in the mexican cavefish.</a> Brain, Behavior and Evolution. 80, 233-243 (2012).</li>
<li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 9668-9673 (2015).</li>
<li>Riddle, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555, 647-651 (2018).</li>
<li>Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+adipogenesis+contributes+to+excess+fat+accumulation+in+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. , (2018).</li>
<li>Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Current Biology. 20, 1631-1636 (2010).</li>
<li>Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modularity+and+sense+organs+in+the+blind+cavefish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+and+Development%22%5BJournal%5D)">Modularity and sense organs in the blind cavefish, Astyanax mexicanus.</a> Evolution and Development. 8, 94-100 (2006).</li>
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<li>Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+the+Mexican+Tetra+Astyanax+mexicanus+for+Analysis+of+Post-larval+Phenotypes+and+Whole-mount+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Stahl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Gene+Function+in+Mexican+Cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
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<li>Frøland Steindal, I. A., Beale, A. D., Yamamoto, Y., Whitmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Astyanax+mexicanus+circadian+clock+and+non-visual+light+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the Astyanax mexicanus circadian clock and non-visual light responses.</a> Developmental Biology. , (2018).</li>
<li>Carlson, B. M., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+comparison+of+activity+profiles+exhibited+by+the+cave+and+surface+morphotypes+of+the+blind+Mexican+tetra%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Characterization and comparison of activity profiles exhibited by the cave and surface morphotypes of the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 208, 114-129 (2018).</li>
<li>Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E. R., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Measurements+of+Sleep+and+Locomotor+Activity+in+Mexican+Cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+in+feeding+posture+occurs+through+different+genetic+loci+in+independently+evolved+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16933-16938 (2013).</li>
<li>Worsham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Tracking+and+Neuromast+Imaging+of+Mexican+Cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Malgré un intérêt de longue date pour les origines de la diversité animale, nous avons une compréhension limitée des changements génétiques qui sous-tendent l’évolution de la morphologie, de la physiologie et du comportement. Le tétra mexicain, Astyanax mexicanus, est devenu un modèle puissant pour approfondir notre compréhension de l’évolution des traits. Cette espèce de poisson existe sous la forme de deux morphotypes, une forme de rivière à yeux (poisson de surface) qui est abondante dans les rivières du Mexique et du sud du Texas, et des formes de grottes sans yeux (poisson des cavernes) qui prospèrent dans les grottes calcaires perpétuellement sombres de la région de la Sierra del Abra dans le nord-est du Mexique1. Il existe 29 populations de grottes connues qui proviennent d’au moins deux invasions indépendantes de poissons de surface 2,3. Les métamorphoses de la grotte et de la rivière sont restés interfertiles et sont faciles à reproduire en laboratoire, ce qui permet aux chercheurs de cartographier génétiquement les traits qui évoluent en réponse aux pressions sélectives uniques dans la grotte. Par exemple, l’absence de lumière a entraîné une régression des yeux 4,5,6,7,8,9, de la pigmentation 10,11,12,13,14 et du sommeil 15,16,17,18,19 ; la limitation des nutriments a sélectionné pour la suralimentation20, la prise de poids21 et le stockage des graisses22 ; et la navigation dans l’obscurité a favorisé une capacité accrue à détecter l’environnement 23,24,25,26,27,28. Un nombre croissant de chercheurs exploitent ce poisson pour explorer les bases génétiques de l’évolution. Parce que certains traits adaptatifs chez les poissons cavernicoles sont préjudiciables chez les humains, le poisson des cavernes est également devenu attrayant pour la recherche biomédicale 21,29,30,31. Dans le but de promouvoir la reproductibilité et de fournir une plate-forme pour les nouveaux chercheurs, cette collection de méthodes JoVE fournit des techniques pour l’élevage, la mesure des caractères et l’examen de l’activité des gènes.
Comme point de départ, la procédure de fécondation in vitro démontrée par Peuß et al. 32 a plusieurs objectifs car il fournit une méthode pour obtenir 1) des hybrides de grotte/surface qui peuvent être difficiles à reproduire, 2) des embryons au stade unicellulaire pour les micro-injections, et 3) des échantillons appariés au stade pour l’analyse des phénotypes embryonnaires. A. mexicanus fraye généralement pendant la nuit. Peuß et al. Décrire un système permettant de modifier le cycle lumière-obscurité et d’obtenir des poissons qui sont prêts à être collectés pendant les heures normales de travail. Leur démonstration visuelle de la collecte des gamètes est particulièrement utile car cette étape nécessite une technique minutieuse. Leur article est essentiel pour un certain nombre d’applications en aval, y compris la comparaison des modèles d’expression génique au cours de l’embryogenèse.
Luc et al. 33 fournissent un protocole d’hybridation in situ robuste optimisé pour la visualisation de l’expression génique dans les embryons d’A. mexicanus . Ils simplifient cette procédure de plusieurs jours à l’aide d’une liste de contrôle (fournie sous forme de fichier supplémentaire) et partagent des directives de dépannage. En complément de cette méthode, Riddle et al. 34 montrent comment examiner l’expression des gènes et la localisation des protéines chez les poissons éclos à l’aide de l’immunohistochimie complète. Pour faire des comparaisons significatives entre les morphotypes après l’éclosion et le début de l’alimentation, il est nécessaire de contrôler les conditions de croissance. Ils montrent comment reproduire des adultes par ponte naturelle et élever des larves à des densités fixes avec un régime de rotifères qui présente des avantages considérables en termes de teneur en nutriments et de coût par rapport à d’autres sources de nourriture. Leur protocole d’immunocoloration reconnaît avec succès les antigènes dans le cerveau, l’intestin et le pancréas jusqu’à 12 jours après l’éclosion, ce qui permet d’interroger les derniers stades du développement et de la fonction des organes. Il est important de noter qu’ils fournissent une liste d’anticorps qui ont été utilisés avec succès chez A. mexicanus. Les méthodes combinées de Luc et al. et Riddle et al. sont utiles pour analyser les effets de la manipulation génétique.
Dans cette collection de méthodes, Stahl et al. 35 décrivent plusieurs façons de manipuler la fonction des gènes chez A. mexicanus , notamment : la micro-injection morpholino, la mutagenèse médiée par CRISPR-Cas9 et la transgenèse médiée par Tol2. En plus de démontrer la pico-injection et le criblage d’embryons injectés, ils fournissent des lignes directrices utiles pour la conception de morpholinos, d’ARN guides et de transgènes. Ils partagent des résultats qui valident chacune de ces techniques. Par exemple, le ciblage de l’hypocrétine/orexine (HCRT) à l’aide d’un morpholino bloquant l’épissage réduit l’activité locomotrice et augmente le sommeil chez les poissons cavernicoles ; l’édition d’Oca2 (le locus causal de l’albinisme des poissons cavernicoles) chez les poissons de surface à l’aide de CRISPR/Cas9 produit des poissons de surface albinos ; et l’insertion d’un indicateur calcique génétiquement codé piloté par un promoteur pan-neuronal de poisson-zèbre à l’aide de la transgenèse Tol2 permet d’obtenir une expression neuronale quasi omniprésente dans le tétra mexicain. Ils soulignent que de nombreux outils génétiques développés chez le poisson-zèbre peuvent être directement transférés aux poissons des cavernes en raison de leurs génomes similaires. Leur article est une ressource essentielle pour les chercheurs qui effectuent des études fonctionnelles chez A. mexicanus et complète les articles supplémentaires axés sur la mesure des phénotypes, y compris le comportement.
Les poissons des cavernes ont considérablement réduit le sommeil et altéré le rythme circadien 36,37,38. Il s’agit d’une opportunité passionnante d’étudier la contribution de la génétique et de l’environnement à la variation du sommeil chez un vertébré. Jaggard et al. 39 montrer comment construire un système à partir de matériaux peu coûteux qui peuvent être utilisés pour enregistrer le sommeil à différentes étapes de la vie et dans différents contextes. De plus, ils décrivent comment automatiser le suivi des poissons dans cette configuration et obtenir des mesures quantitatives pour le sommeil et la locomotion. Leur technique est applicable au dépistage génétique et médicamenteux à haut débit ainsi qu’aux études de cartographie génétique traditionnelles.
En plus de la réduction du sommeil, les poissons des cavernes ont développé des différences dans les activités locomotrices liées à la recherche de nourriture, y compris une modification de l’angle d’alimentation et de l’attraction des vibrations 16,30,40. Pour comprendre comment ces activités ont évolué, il est essentiel de les relier aux changements de développement. Worsham et al. 41 présenter des méthodes pour enregistrer les comportements et les corréler avec les changements dans les neuromastes ; structures mécanosensorielles externes qui réagissent à l’écoulement de l’eau. Ils montrent d’abord comment créer des chambres pour enregistrer l’attraction vibratoire et le sommeil, et fournissent une description détaillée de la façon de quantifier les comportements à l’aide de logiciels gratuits et de scripts personnalisables. Ensuite, ils démontrent comment visualiser les neuromastes chez des poissons adultes vivants à l’aide d’une coloration mitochondriale fluorescente et, à l’aide d’un logiciel libre, comment quantifier le nombre de neuromastes de manière semi-automatisée. L’attraction vibratoire et le nombre de neuromastes sont corrélés23 ; Leur méthode fournit un protocole étape par étape pour interroger cette relation. Les méthodes de Jaggard et Worsham peuvent être utilisées pour découvrir des comportements supplémentaires et peuvent également être appliquées à d’autres espèces de poissons. Ces méthodes produisent des résultats quantitatifs et cohérents qui sont essentiels à la découverte de la base génétique de l’évolution comportementale.
Les techniques modernes de mesure et de manipulation de la fonction des gènes ont fait passer les études évolutives du comparatif au mécanisme. Ensemble, les articles de cette collection de méthodes servent de guide pour mener à bien des recherches sur la fonction des gènes chez A. mexicanus. Bien que les chercheurs aient découvert des différences fascinantes de morphologie, de physiologie et de comportement entre les morphes de surface et les formes de grotte, de nombreux traits doivent encore être explorés en détail et probablement plus à découvrir. Au fur et à mesure que d’autres travaux seront effectués, ce petit poisson continuera d’avoir un impact important sur notre compréhension de l’évolution.

petits poissons, grandes questions : une collection de techniques modernes pour la recherche sur les tétras mexicains

Little Fish, Big Questions: A Collection of Modern Techniques for Mexican Tetra Research

Articles discutés :
Stahl, B. A. et al. Manipulation de la fonction des gènes chez les poissons cavernicoles mexicains. Journal des expériences visualisées. (146) (2019).
Peuß, R. et al. Collection de gamètes et fécondation in vitro d’Astyanax mexicanus. Journal des expériences visualisées. (147) (2019).
Worsham, M. et al. Suivi comportemental et imagerie neuromastique des poissons cavernicoles mexicains. Journal des expériences visualisées. (147) (2019).
Jaggard, J.B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E.R., Keene, A.C. Mesures automatisées du sommeil et de l’activité locomotrice chez les poissons cavernicoles mexicains. Journal des expériences visualisées. (145) (2019).
Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J.B. Hybridation in situ complète pour les embryons d’Astyanax. Journal des expériences visualisées. (145) (2019).
Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Élevage du Tetra mexicain Astyanax mexicanus pour l’analyse des phénotypes post-larvaires et l’immunohistochimie du montage entier. Journal des expériences visualisées. (142) (2018).

Petits poissons, grandes questions : une collection de techniques modernes pour la recherche sur les tétras mexicains

Articles discutés :
Stahl, B. A. et al. Manipulation de la fonction génique chez le poisson cavernicole mexicain. Journal of Visualized Experiments. (146) (2019).
Peuß, R. ...

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Découvrez des protocoles modernes pour manipuler les gènes et analyser le comportement chez Astyanax mexicanus. Ces méthodes standardisées facilitent l'étude de la biologie du développement et de l'évolution.

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