Name: Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Découvrez un protocole d'inoculation retardée pour créer des infections chroniques de plaies par Pseudomonas aeruginosa chez des souris immunocompétentes sans suppression immunitaire ni implant étranger.

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Le vecteur de construction luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 était un cadeau gracieux de J. Hardy. Des schémas ont été créés avec BioRender.com. Nous remercions le laboratoire de G. Gurtner pour leurs conseils sur le modèle d’infection des plaies. Nous remercions également T. Doyle du Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging pour son expertise technique. Ce travail a été soutenu par des subventions R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, et des subventions de Stanford SPARK, le Falk Medical Research Trust et la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) à P.L.B. C.R.D a été soutenu par T32AI007502. Une bourse d’études supérieures Gabilan Stanford pour les sciences et l’ingénierie et une bourse d’études supérieures interdisciplinaires Lubert Stryer Bio-X Stanford ont soutenu J.M.S.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stanford.
1. Préparation et croissance des bactéries
<ol><li>Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les animaux avec des précautions BSL-2 selon le comité institutionnel de biosécurité du chercheur et les lignes directrices du comité d’utilisation des animaux. Faites toutes les étapes décrites ici impliquant P. aeruginosa, y compris l’inoculation de souris, dans un coffret de biosécurité.</li>
	<li>La souche luminescente PAO1:lux de P. aeruginosa est disponible dans notre laboratoire sur demande. Streak PAO1, stocké sous forme de stock de glycérol congelé, sur l’agar Lysogeny Broth (LB). Pour la souche luminescente PAO1:lux, l’agar LB doit contenir des antibiotiques sélectifs (100 'g/mL carbenicilline et 12,5 'g/mL kanamycin). Cultivez à 37 oC pendant la nuit dans un incubateur bactérien.</li>
	<li>Choisissez une colonie isolée et poussez pendant la nuit à 37 oC dans un milieu lb de 3 ml, pH 7,4. Pour les souches luminescentes, le bouillon doit contenir 100 og/mL de carbenicilline. Cultivez dans des conditions aérobies tremblantes.</li>
</ol>2. Préparation de la procédure
<ol><li>Demandez à tout le personnel effectuant la chirurgie de porter une robe propre/manteau de laboratoire, un masque de visage, un filet de cheveux, et des gants.</li>
	<li>Autoclave tous les outils chirurgicaux, y compris les ciseaux et les forceps. Utilisez une technique aseptique pour stériliser les outils entre les animaux.</li>
	<li>Nettoyez la table chirurgicale avec de l’éthanol et préparez un champ chirurgical propre.</li>
</ol>3. Enlèvement de cheveux
<ol><li>Anesthésiez les souris C57BL/6J de 8 à 12 semaines à l’aide d’isoflurane de 1 % à 3 %. Les enquêteurs devraient suivre les directives du personnel vétérinaire de leur établissement pour l’anesthésie lors de l’utilisation de l’isoflurane.<ol>
<li>Commencez l’anesthésie en livrant 1% - 3% isoflurane et ajuster le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Placez la souris dans la chambre d’induction.</li>
		<li>Pincez l’orteil de la souris pour évaluer la profondeur de l’anesthésie. Lorsque la souris ne réagit plus à la stimulation, retirez-la de la chambre d’induction et placez-la sur le banc chirurgical avec son nez dans le cône de nez isoflurane.</li>
		<li>Appliquer un lubrifiant oculaire sur les deux yeux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peser la souris pour obtenir un poids de base avant la procédure.</li>
	<li>Placez la souris en position couchée. Injecter la souris sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préréchauffé de 0,9 %, 250 l à chaque flanc pour un total de 500 l.</li>
	<li>Raser la zone dorsale de la souris à l’aide d’un rasage électrique. Le rasage devrait se produire à un endroit différent de celui de la station chirurgicale pour prévenir la contamination des cheveux de la plaie.</li>
	<li>Appliquer une fine couche de lotion d’épilation. Laisser la lotion s’asseoir pendant 20 à 60 s. Enlever les cheveux et l’excès de lotion avec de la gaze humidifiée dans de l’eau chaude. Après l’épilation, procéder à la procédure de blessure excisional.</li>
</ol>4. Chirurgie excisional de blessure d’épaisseur complète
<ol><li>Injecter de la buprénorphine à libération soutenue 0,6 à 1 mg/kg sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 25 G à la mi-dorsale de la souris. La buprénorphine à libération lente soulage la douleur sur 48 à 72 h.</li>
	<li>Désinfecter le site chirurgical. Essuyez la surface dorsale à l’œil d’un tampon stérile de bêtadine. Essuyez l’excès de bêtadine à l’œil d’un tampon d’alcool stérile. Ceci doit être exécuté 3 fois (en alternance entre la bêtadine et l’alcool), écouvillonnant en se déplaçant du centre d’une manière circulaire au bord. Laisser sécher la zone.</li>
	<li>Créez un drapé entourant le site chirurgical à l’aide de gaze stérile ou d’une pellicule d’accrochage en plastique.</li>
	<li>Étirer la peau tendue caudally. Utilisez un poinçon stérile de biopsie de la peau de 6 mm de diamètre pour faire une incision initiale à travers l’épiderme dorsal gauche. Répéter sur l’épiderme dorsal droit.</li>
	<li>Utilisez des forceps pour tenter la peau du centre de la zone de la plaie décrite à gauche. Excisez les couches épidermiques et cutanées à l’aide de ciseaux. Répétez sur la zone de la plaie décrite à droite pour créer des blessures excisionales symétriques.</li>
	<li>Laver les plaies avec 50 l de salin stérile. Laissez sécher le site chirurgical et la peau environnante. Ensuite, couvrez les plaies et dorsum avec un pansement de film transparent.</li>
	<li>Placez la souris dans une cage propre. Maison 1 animal par cage.</li>
	<li>Placez la cage sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce que la souris se réveille.</li>
	<li>Lors de l’exécution de la chirurgie ci-dessus sur plusieurs animaux, utilisez un stérilisateur de perles chaudes pour nettoyer tous les instruments chirurgicaux entre les animaux.</li>
	<li>Laisser 24 h pour les souris de récupérer de la procédure chirurgicale et pour la formation d’une matrice de plaie provisoire sur les plaies avant de procéder à l’inoculation avec des bactéries.</li>
</ol>5. Inoculation avec P. aeruginosa
<ol><li>Diluer la culture PAO1:lux de nuit à OD600 - 0,05 dans 75 mL de support LB contenant 100 'g/mL de carbenicilline et de développer les bactéries jusqu’à ce que la culture est en phase exponentielle précoce (OD600 - 0,3). Cela devrait prendre environ 2 à 3 h.</li>
	<li>Diluer PAO1:lux dans PBS à une concentration de (7,5 à 2,5) x 102 CFU/mL. Assurez-vous de préparer l’inoculum excédentaire pour assurer un volume suffisant et pour permettre le placage après l’expérience. Si vous transportez entre les installations (c.-à-d. du laboratoire au vivarium), utilisez un double confinement dans une boîte à contre-preuves de fuites clairement marquée Biohazard.</li>
	<li>Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les souris à l’aide d’équipement de protection individuelle approuvé dans un coffret de sécurité biologique approuvé par le niveau de biosécurité animale 2 (ABSL-2). L’équipement réutilisable tel que la balance de pesage doit être recouvert d’un soudure pour éviter la contamination.</li>
	<li>Anesthésier à l’aide de 3% isoflurane comme décrit ci-dessus. Pesez la souris et enregistrez le poids. Injecter la souris sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préréchauffé de 0,9 %, 250 l à chaque flanc pour un total de 500 l.</li>
	<li>Si le pansement transparent de la souris s’est éteint pendant la nuit, retirez soigneusement toute croûte résultante et mettez sur un nouveau pansement.</li>
	<li>Utilisez une seringue de bouchon de sécurité de 500 l à tubercule 27 G pour injecter 40 l de la suspension PAO1:lux à travers le pansement transparent dans chaque plaie. Différentes souris devraient être utilisées pour les contrôles des plaies non inoculés/PBS afin d’éviter la contamination croisée du côté contralatéral.</li>
	<li>Placez la souris dans sa cage sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce qu’elle se réveille. Toutes les souris doivent être logées individuellement dans des cages séparées afin d’éviter la contamination croisée.</li>
	<li>Fournir une pâte de supplément nutritionnel riche en calories pris en sandwich entre les granulés de nourriture sur le plancher de la cage.</li>
	<li>Utilisez l’inoculum restant pour strier une plaque d’agar LB. Compter les colonies pour confirmer le nombre de bactéries administrées.</li>
</ol>6. Imagerie in vivo des plaies infectées
<ol><li>Suivez les protocoles de confinement BSL-2 pour le transport des souris à et depuis l’instrument d’imagerie, y compris l’utilisation d’un conteneur secondaire. Veillez à ne pas transférer ou laisser tomber une litière animale pendant le transfert de la souris à la chambre d’induction ou à l’instrument d’imagerie.</li>
	<li>Induire l’anesthésie de la souris avec l’isoflurane inhalé de 1% à 3% dans une chambre d’induction comme décrit à l’étape 3.1.</li>
	<li>Une fois que la souris est anesthésié, placez-la en position couchée dans la chambre d’imagerie d’un système d’imagerie optique avec le nez dans le cône nasal isoflurane.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel.</li>
	<li>Les paramètres d’acquisition varient en fonction du nombre d’animaux photographiés simultanément et de l’intensité de la bioluminescence. Les paramètres de base à définir comprennent le temps d’exposition, le binning, f/stop et le champ de vision (FOV). Nos paramètres de démarrage par défaut sont le temps d’exposition 30 secondes, binning faible (2), f/ arrêt 1.2, et FOV 25. Ajustez ces paramètres au besoin en fonction des besoins du chercheur.</li>
	<li>Analyser les données de luminescence à l’aide d’un programme d’imagerie (voir Tableau des matériaux). Luminescence sera représenté comme une image pseudo-couleur superposée sur une photographie couleur des souris.<ol>
<li>Créer une région d’intérêt (ROI) sur le site de la plaie et mesurer le flux moyen (photons/seconde) détecté. Notez que les données peuvent également être signalées comme rayonnement (photons/seconde/cm2/steradian), mais tant que la distance de la plate-forme d’imagerie de la caméra reste constante entre l’imagerie, le flux est suffisant.</li>
		<li>Mesurer l’arrière-plan en créant un retour sur investissement à une zone aléatoire sur la plate-forme d’imagerie. Soustrayez le nombre d’arrière-plan des photons/seconde.</li>
		<li>Exporter les données vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer l’imagerie comme décrit ci-dessus aussi souvent que tous les jours pour suivre la progression de l’infection.</li>
</ol>7. Gestion postopératoire
<ol><li>Surveillez les souris selon les lignes directrices fixées par le protocole IACUC du chercheur. Nous surveillons toutes les souris tous les jours pendant les 4 premiers jours, puis tous les deux jours jusqu’à la fin de l’expérience. Peser les souris une fois par jour pendant les 4 premiers jours après la chirurgie dans un BSC. Injecter 250 l de chlorure de sodium de 0,9 % sous-cutané les jours 1 et 2 après l’infection.</li>
	<li>Vérifiez les signes de douleur/détresse chez les souris, y compris la posture voûtée, le pelage débraillé, la léthargie, la difficulté à respirer, la grimace faciale et la perte de poids.</li>
	<li>Si les animaux présentent des signes de détérioration de leur santé, consultez un vétérinaire. Toute souris qui semble montrer des signes d’aggravation de la douleur / détresse et une perte de poids de 20% ou plus devrait être euthanasié.</li>
</ol>8. Excision de blessure
<ol><li>À la fin de l’expérience, sacrifiez les souris en utilisant l’inhalation de CO2, suivie d’une luxation cervicale. Disposer de la carcasse de l’animal selon les protocoles ABSL-2 de l’institution.</li>
	<li>Lits de plaie d’accise utilisant des ciseaux stériles et des forceps dans un BSC. Placez chaque lit de blessure dans 1 ml de PBS stérile dans un tube de polypropylène de 1,5 ml. Émincer le tissu de la plaie avec des ciseaux. Toutes les plaies doivent être traitées comme ASBL-2, même si elles ne sont pas considérées comme infectées.</li>
	<li>Incuber sur un shaker à 300 tr/min pendant 2 h à 4 oC. Vortex chaque tube pour 10 s et diluer en série les effluents bactériens dans PBS. Plaquer les effluents bactériens dilués sur l’agar LB pour énumérer la charge bactérienne.</li>
	<li>Considérez les plaies infectées si le signal luminescent dans la plaie est au-dessus de la luminescence de fond et plus de bactéries sont détectées dans l’effluent de blessure que dans les blessures inoculées avec PBS comme contrôle.</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa%3A+epidemiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li>
<li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Rice, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+life+cycle+and+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+dependent+on+a+filamentous+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage.</a> The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).</li>
<li>Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+lung+disease+with+transition+to+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection.</a> Scientific Reports. 6, 35838(2016).</li>
<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à divulguer.

Nous avons développé un nouveau modèle retardé d’infection de blessure de P. aeruginosa d’inoculation. La stratégie de retarder l’inoculation avec des bactéries jusqu’à 24 h après la blessure excisional permet l’évaluation des infections de blessure sur une période d’une semaine. En utilisant une souche luminescente de P. aeruginosa, il est possible de suivre la progression de l’infection tout au long du cours de l’infection. Le cours plus long de l’infection par rapport à d’autres modèles d’infection <...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est une bactérie en forme de tige Gram-négative avec une pertinence croissante pour la santé humaine et la maladie. Il est responsable de la morbidité et de la mortalité étendues dans les arrangements nosocomiaux, particulièrement impliquant des infections de blessure dans les patients immunocompromis1,2. L’émergence de souches multirésistantes de cet agent pathogène a donné une impulsion supplémentaire pour l’investigation sur les facteurs contribuant à la virulence de P. aeruginosa, les mécanismes de la résistance aux antibiotiques De P. aeruginosa, et de nouvelles méthodes pour la prévention et le traitement de cette infection mortelle3. En tant que tel, le besoin de modèles animaux de l’infection chronique des plaies comme outils pour étudier ces questions de recherche n’a jamais été aussi grand.
Malheureusement, de nombreux modèles animaux de l’infection à P. aeruginosa ont tendance à simuler une infection aigue avec une résolution rapide de l’infection ou un déclin rapide dû à la septicémie4,5, qui ne simule pas adéquatement la nature souvent chronique de ces infections. Pour remédier à cet inconvénient, certains modèles utilisent l’implantation de corps étrangers tels que les perles d’agar, les implants en silicone, ou les gels d’alginate6,7,8. D’autres modèles utilisent des souris qui sont immunocompromised en raison de l’âge avancé, l’obésité, ou le diabète, ou par des moyens pharmacologiques tels que la neutropénie induite par cyclophophosphamide9,10,11,12. Cependant, l’utilisation de matériaux étrangers ou d’hôtes immunodéprimés modifie probablement le processus inflammatoire local, ce qui rend difficile d’acquérir une compréhension de la physiopathologie impliquée dans les infections chroniques des plaies chez les hôtes avec un système immunitaire autrement normal.
Nous avons développé un modèle chronique de P. aeruginosa infection de blessure chez les souris qui implique l’inoculation retardée avec des bactéries après blessure excisional. L’inoculation retardée permet des expériences évaluant la charge bactérienne s’étendant jusqu’à au moins 7 jours. Ce modèle ouvre de nouvelles possibilités d’étudier à la fois la pathogénie et les nouveaux traitements des infections chroniques de P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium injectable à 0,9 %</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 aiguille stérile</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 aiguille stérile</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Tampon imbibé d’alcool</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura Imaging Software</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td> C57BL/6J <td></td></tr><tr>souris<td>mâles</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie jetable, 6mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins - Carbure de tungstène</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur à sec de billes de verre</td><td>Appareil Harvard</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>Gélose granulée</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Milliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline avec aiguille 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X Imaging System</td><td>Spectral Instruments Imagerie</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Leur-Lok 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Animal Trimmer</td><td>Wahl Professional</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair Lotion dépilatoire à l’huile pour bébé</td><td>Church et Dwight</td><td>n/a</td><td>Disponible dans n’importe quelle pharmacie</td></tr><tr><td>Octagon Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Press and Seal Cling Wrap</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline SafetyGlide avec aiguille de 30 g</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline Safetyglide, 1/2 mL, 30 g x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Supplément nutritionnel supplique</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est un agent pathogène nosocomial majeur de plus en plus pertinent pour la santé humaine et la maladie, en particulier dans le cadre d’infections chroniques des plaies chez les patients diabétiques et hospitalisés. Il est urgent de mettre au point des modèles d’infection chronique pour aider à l’étude de la pathogénie des plaies et au développement de nouvelles thérapies contre cet agent pathogène. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie l’inoculation retardée 24 heures après la blessure excisional pleine épaisseur. L’infection de la matrice provisoire de blessure présente à ce moment-là prédise le dégagement ou la diffusion rapide de l’infection et établit plutôt l’infection chronique durant 7-10 jours sans avoir besoin d’implantation de matériaux étrangers ou de suppression immunitaire. Ce protocole imite un cours temporel typique de l’infection postopératoire chez l’homme. L’utilisation d’une souche luminescente de P. aeruginosa (PAO1:lux) permet l’évaluation quotidienne quantitative de la charge bactérienne pour des infections de blessure de P. aeruginosa. Ce nouveau modèle peut être un outil utile dans l’étude de la pathogénie bactérienne et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques de plaie de P. aeruginosa.

À l’aide d’une souche luminescente de PAO1 avec un plasmide codant le système de journaliste luxABCDE (PAO1:lux), nous avons effectué des blessures excisionales sur des souris, inoculé ces blessures avec p. aeruginosa planctonique 24 h plus tard, et mesuré la charge bactérienne au fil du temps(Figure 1 et Figure 2). Une image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que ce modèle entraîne ...

Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Ce protocole est significatif parce qu’il décrit un modèle pour l’infection chronique de blessure d’aeruginosa de Pseudomonas sans avoir besoin de l’implantation étrangère de matériel ou de la suppression immunisée. Inoculation retardée avec Pseudomonas aeruginosa 24 heures après l’épaisseur complète excisional blessure prosterne le dégagement rapide et la diffusion de la bactérie, établissant une infection qui dure sept à dix jours. Ce modèle unique sera un outil utile pour les études de la pathogénie bactérienne, les interactions avec les pathogènes hôtes, et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques des plaies pseudomonas aeruginosa.M’aider dans une démonstration de l’intervention sera Dan Liu, un étudiant en médecine du Laboratoire Bollyky. Avant de commencer la procédure, pesez une souris anesthésiée de huit à 12 semaines pour obtenir un poids de base et placer la souris dans la position couchée. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, injectez subcutanément à la souris 250 microlitres de chlorure stérile préchauffé de 0,9 % de sodium sur chaque flanc.Utilisez un rasoir électrique pour enlever les cheveux de la zone dorsale de la souris et appliquer une fine couche de crème depilatory sur la peau exposée. Après 20 à 60 secondes, retirer les cheveux et l’excès de lotion avec de la gaze humidifié dans de l’eau chaude. Pour la chirurgie excisionnelle de blessure de pleine épaisseur, utilisez d’abord une aiguille de calibre 25 pour injecter sous-cutanéement 0,6 à un milligramme par kilogramme de buprénorphine à libération soutenue à la zone mi-dorsale de la souris et essuyer le site chirurgical d’une manière circulaire avec trois bêtadine stériles alternatifs et des écouvillons d’alcool.Placez un drap d’enveloppement en plastique sur le site chirurgical et étirez la peau tendue caudally. Lorsque la peau a séché, utilisez un poinçon stérile de six millimètres de diamètre biopsie de la peau pour faire une incision initiale à travers l’épiderme dorsale gauche, suivie d’une deuxième incision sur l’épiderme dorsale droite. Utilisez des forceps pour tenter la peau à partir du centre de la zone de plaies tracées à gauche et utilisez des ciseaux pour exciser les couches épidermiques et cutanées.Après avoir répété l’incision sur la zone de blessure décrite à droite pour créer des blessures excisionnelles symétriques, laver les deux blessures avec 50 microlitres de solution saline stérile. Lorsque le site chirurgical et la peau environnante ont séché, couvrir les plaies et le dorsum avec un pansement transparent film et placer la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la récumbence complète. 24 heures après la chirurgie, peser à nouveau la souris réanthésiée et injecter l’animal sous-cutanée avec 250 microlitres de chlorure stérile préchauffé de 0,9 % de sodium dans les deux flancs.Ensuite, chargez 100 microlitres de la suspension de souche luminescente P.aeruginosa dans une seringue de bouchon de sécurité tuberculine de 500 microlitres équipée d’une aiguille de calibre 27 et injectez 40 microlitres de suspension bactérienne à travers le film transparent qui s’habille dans chaque plaie. Assurez-vous que la suspension bactérienne est bien mélangée et que la vinaigrette transparente est intacte. Assurez-vous de perforer la vinaigrette transparente une seule fois avec la lunette d’aiguille vers le haut.Puis retourner la souris dans sa cage sur une page de chauffage avec surveillance et de fournir une pâte de supplément nutritionnel riche en calories pris en sandwich entre les granulés alimentaires sur le sol de la cage. Plaquez le reste de l’inoculum sur une plaque d’agar LB et comptez les colonies pour confirmer le nombre de bactéries qui ont été administrées. Pour l’imagerie in vivo des plaies infectées, suivez les protocoles de confinement de niveau de biosécurité deux pour le transport des souris vers et depuis l’instrument d’imagerie et placez la souris anesthésiée dans la position couchée dans la chambre d’imagerie.Dans le logiciel d’imagerie, définissez le temps d’exposition, le binning, le f-stop et le champ de vision au besoin pour l’expérience. Ensuite, créez une région d’intérêt sur le site de la plaie et mesurez le flux moyen détecté en photons par seconde. Pour mesurer l’arrière-plan, créez une région d’intérêt sur une zone aléatoire sur la plate-forme d’imagerie et soustrayez le nombre de photons par seconde.À la fin de l’expérience, dans une armoire de biosécurité, utilisez des ciseaux stériles et des forceps pour exciser les lits enroulés et placer chaque lit dans un millilitre de PBS stérile dans un tube de polypropylène de 1,5 millilitre. Hacher le tissu enroulé avec des ciseaux et incuber les morceaux de tissu sur un shaker à quatre degrés Celsius en 300 rotations par minute pendant deux heures. À la fin de l’incubation, vortex chaque tube pendant 10 secondes avant de diluer en série les effluents bactériens dans PBS et de placage des effluents bactériens dilués sur l’agar LB pour quantifier la charge bactérienne.Cette image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que ce modèle entraîne une luminescence détectable. Dans cette expérience, l’infection a culminé au jour trois post-inoculation et a persisté sept jours après l’inoculation basée à la fois sur la bioluminescence et le nombre de colonies. La culture des bactéries isolées de la plaie démontre en outre que la colonie quantifiée formant des unités par plaie est corrélée avec la luminescence détectée.Bien qu’il y ait une perte de poids rapide initiale immédiatement après l’injection, les injections salines et la nutrition supplémentaire peuvent restaurer les souris à leur poids initial. La dose calculée d’inoculation dont 50 % des plaies seront gravement infectées a été déterminée à environ 7,7 fois 10 à la deuxième colonie formant des unités par millilitre. Des doses plus élevées qu’une fois de 10 à la quatrième colonie formant des unités par millilitre entraînent un taux d’infection de 100 %.Divers traitements topiques et systémiques peuvent être appliqués après les procédures de blessure et d’inoculation pour étudier de nouvelles thérapies potentielles pour Pseudomonas aeruginosa. Tous les travaux avec Pseudomonas aeruginosa et les souris infectées devraient être menés avec des précautions de sécurité BSL-2 conformément aux directives du comité institutionnel de biosécurité et d’utilisation des animaux du chercheur.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : de Vries, C. R., et.al. Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie de Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’inoculation retardée de Pseudomonas aeruginosa luminescente dans une souris portant deux plaies dorsales d’épaisseur complète recouvertes d’un pansement de film transparent. Cela facilite la formation de biofilms et l’établissement d’infections chroniques. Un suivi régulier de la bioluminescence permet de quantifier la charge...

Développement d’un modèle murin d’infection cutanée chronique de Pseudomonas aeruginosa 

Nous décrivons la méthode agar-perles d'établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

Nous avons développé un modèle de lésions pulmonaires chez la souris par injection intra-trachéale de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ce modèle imite les lésions pulmonaires lors d’une pneumonie et est cliniquement pertinent.

Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

Alors que l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène permet de caractériser des réponses immunitaires spécifiques, des modèles in vivo sont nécessaires pour observer les effets de réponses complexes. En utilisant l’exposition à Candida albicans suivie d’une infection pulmonaire médiée par Pseudomonas aeruginosa, nous avons établi un modèle murin des interactions microbiennes impliquées dans la pathogénicité de la pneumonie associée à la ventilation assistée.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.

Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

Nous décrivons ici un protocole qui permet l’analyse histologique et moléculaire des échantillons de peau après injection intradermique de Candida albicans . Ce protocole permet la localisation des cellules immunitaires tissulaires-résident ou nouvellement recrutés, mais aussi la distribution de l’agent pathogène et maintient l’intégrité structurale de la peau.

Profonde cutanée Injection comme un modèle d’Infection de la peau de Candida albicans pour les Analyses histologiques

Les blessures chroniques sont développées des blessures aigues sur un modèle diabétique de souris en induisant des niveaux élevés de stress oxydatif après une blessure cutanée pleine épaisseur. La plaie est traitée avec des inhibiteurs pour la catalase et le peroxidase de glutathion, ayant pour résultat la guérison altérée et le développement de biofilm par les bactéries présentes dans le microbiome de peau.

Protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris diabétiques

L’infection de l’articulation périprothétique (PJI) causée par des agents pathogènes dangereux est fréquente en orthopédie clinique. Les modèles animaux existants ne peuvent pas simuler avec précision la situation réelle de PJI. Ici, nous avons établi un modèle murin de PJI associé au biofilm de Candida albicans pour la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la PJI.

Un modèle d’infection à Candida albicans d’articulation périprothétique chez la souris

Les plaies chroniques résistantes aux antibiotiques constituent une menace majeure pour le système de santé. Les infections par biofilm sont tenaces et hostiles et peuvent entraîner une fermeture fonctionnelle déficiente de la plaie. Nous rapportons un modèle porcin cliniquement pertinent de plaies chroniques de pleine épaisseur infectées par un biofilm. Ce modèle est puissant pour les études mécanistiques ainsi que pour tester des interventions.

Modèle porcin d’infection par biofilm et de plaies invisibles

Il existe actuellement un manque de modèles in vivo permettant le dépistage de médicaments contre les infections bactériennes chroniques. Ici, nous décrivons un protocole d’infection de la plaie par un isolat clinique de Pseudomonas aeruginosa pour générer une infection persistante chez les larves de poisson-zèbre.

Modélisation de l’infection persistante à Pseudomonas aeruginosa chez les larves de poisson-zèbre blessées

Découvrez un protocole d'inoculation retardée pour créer des infections chroniques de plaies par Pseudomonas aeruginosa chez des souris immunocompétentes sans suppression immunitaire ni implant étranger.

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

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