Name: Surveillance des anticorps PD-1-Blocking liés aux lymphocytes T dérivés dune goutte de sang périphérique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour évaluer les anticorps bloquant le PD-1 sur les lymphocytes T à partir d'une goutte de sang périphérique. Cette technique permet d'identifier les sous-populations cellulaires impliquées dans les effets antitumoraux et les événements indésirables immunitaires.

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Ce travail a été soutenu par des subventions à S.K. de la Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) et de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (JP18cm0106335 et 19cm0106310).

L'échantillonnage a été effectué pendant les procédures cliniques courantes. Tous les échantillons humains ont été obtenus après que le consentement éclairé a été fourni par les sujets, conformément à la Déclaration d'Helsinki et avec l'approbation du comité d'examen éthique de l'École supérieure de médecine de l'Université d'Osaka, au Japon (15383 et 752).
1. Préparation d'échantillons de sang entier et coloration
<ol><li>Recueillir des échantillons de sang entier dans des tubes de collecte de sang contenant de l'acide tétratique de diaté-acétique (EDTA) contenant de l'acide tétratique de la diamine d'éthylène. REMARQUE : La collecte de sang peut être effectuée à l'aide d'une aiguille ordinaire ou d'une lancette sanguine.</li>
	<li>Transférer 20 l d'échantillons de sang entier dans des tubes de cytométrie à fond rond à fond rond de 5 ml. REMARQUE : Pour réduire la liaison non spécifique des cellules aux tubes, 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS) de 2 % dans la saline tamponnée en phosphate (PBS) est ajouté dans les tubes et vortexé pendant 10 s avant l'application aux échantillons.</li>
	<li>Ajouter 20 'L de 2% FBS dans PBS.</li>
	<li>Ajouter 10 L de réactif de blocage FcR spécifique à l'homme. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 500 l de tampon de lyse des globules rouges. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 4 ml de 2 % de FBS en PBS et faire tourner les cellules à 400 x g (1 500 tr/min) pendant 5 min à 4 oC. Enlever le supernatant par aspiration.</li>
	<li>Répétez le processus de lavage et d'aspiration décrit à l'étape 1.6.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 100 'L de 2% FBS en PBS et diviser en deux tubes de 50 'L chacun.</li>
	<li>Ajouter les anticorps marqueurs de surface (tableau 1). Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité. REMARQUE : Lors du profilage du statut immunitaire des lymphocytes T, le nombre de marqueurs peut être augmenté en fonction de la qualité de la machine de cytométrie de flux.</li>
	<li>Laver les échantillons 2x tel que décrit à l'étape 1.6.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 200 'L de 2% FBS dans PBS.</li>
</ol>2. Analyse cytométrique de flux
<ol><li>Insérez des tubes dans le cytomètre d'écoulement et acquérez des cellules, suivant essentiellement le protocole recommandé9.</li>
	<li>Enregistrez 10 000 événements comme la porte des lymphocytes (figure 1A) et les données sur les flux d'exportation sous forme de fichiers .fcs aux fins d'analyse.</li>
	<li>Ouvrez les fichiers dans le logiciel d'analyse. Visualisez les cellules sur une diffusion vers l'avant (FSC) (A) vs la dispersion latérale (SSC) (A) parcelle et les lymphocytes porte (Figure 1A).</li>
	<li>Après avoir sélectionné des cellules individuelles à l'aide de FSC (H) vs FSC (W) et SSC (H) vs SSC (W) (Figure 1B) et les afficher sur un CD3 vs CD8 ou CD3 vs CD4 parcelle, porte les cellules T CD8 et CD4 lymphocytes T, respectivement (Figure 1C).</li>
	<li>Après avoir sélectionné les cellules fermées et les avoir exposées sur une parcelle DP-1 vs Humaine IgG4, identifiez les cellules CD8 et CD4 liées par les anticorps PD-1-bloquants en fonction du contrôle de l'isotype (Figure 1D).</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Dans cet article, nous rapportons une méthode utilisant un cytomètre de flux pour détecter les anticorps de PD-1-bloquant lié aux cellules T dérivées d'une goutte de sang périphérique, que nous avons à l'origine développé pour la détection de nivolumab10. Bien que cette technique soit très simple et facile à exécuter, deux points importants doivent être notés afin d'obtenir des résultats précis. La première est que pour détecter les molécules de PD-1, un anticorps approprié qui est en concurrence ...

Les anticorps de blocage de PD-1 sont devenus le choix standard pour le traitement de divers types de cancer, y compris le cancer du poumon de non-petite cellule (NSCLC)1,2,3,4. Ils montrent un effet thérapeutique remarquable dans un sous-ensemble de patients cancéreux qui n'ont pas répondu aux chimiothérapies cytotoxiques conventionnelles. Cependant, les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (IIC), qui comprennent les anticorps de blocage de la DP-1, peuvent causer un spectre unique et distinct d'événements indésirables, appelés événements indésirables liés au système immunitaire (IRAE)5. Bien que les irAE peuvent affecter presque tous les tissus, ils sont le plus souvent observés dans le tractus gastro-intestinal, les glandes endocrines, la peau et le foie, et ils peuvent causer le prurit, éruption cutanée, nausées, diarrhée, et troubles thyroïdiens6,7. En général, la plupart des irAE apparaissent dans les 1 à 2 mois suivant le déclenchement des ICI. Cependant, dans certains cas, ils peuvent se produire plus tard que 1 an après le début du traitement ou même après l'arrêt du traitement6,7. Ils causent également divers symptômes qui peuvent être difficiles à distinguer d'autres pathologies. Ainsi, il peut être difficile de diagnostiquer rapidement irAEs et de les traiter de façon appropriée. irAEs peut affecter tous les tissus, et leur arrivée est fortement influencée par la circulation des cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-blocage. Par conséquent, une méthode simple et mini-invasive pour surveiller les lymphocytes T ciblés par les anticorps est importante dans les milieux cliniques.
Ici, nous avons développé une méthode simple pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T utilisant une goutte de sang entier périphérique des patients de cancer qui ont reçu le nivolumab ou le pembrolizumab. En utilisant cette approche, nous avons pu surveiller chacun des éléments suivants : 1) la durée de la liaison des anticorps aux lymphocytes T, 2) l'occupation des molécules De Lymph PD-1 par des anticorps thérapeutiques, et 3) l'état d'activation et les caractéristiques immunologiques des lymphocytes T. Cette méthode est une modification d'une technique précédemment rapportée8. La quantité de sang nécessaire est presque la même que celle nécessaire pour un test de glucose, et l'approche ne nécessite pas d'enrichissement cellulaire mononucléaire ou de co-culture avec des anticorps PD-1-blocage. Nous avons confirmé que cette méthode peut également être effectuée à l'aide d'échantillons congelés, y compris les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et les cellules de l'effusion pleurale, l'effusion péricardique, le liquide de lavage bronchoalveolar, et le liquide céphalo-rachidien, suggérant que cette stratégie puisse être utile dans le contexte d'une étude multicentrique. Cette méthode peut faciliter le diagnostic précoce des irAE, et également aider à déterminer les traitements immunosuppresseurs appropriés pour contrôler leurs symptômes et d'identifier les moments optimaux pour initier des thérapies ultérieures après inhibiteurs de PD-1.

<table><tbody><tr><td>10X Tampon de lyse RBC (multi-espèces)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD4 humain APC/Cyanine7</td><td>BioLegend</td><td>300518</td><td>Clone RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II Cytomètre</td><td>en flux BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 Anticorps CD8a anti-humain</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Saline tamponnée</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Falcon Tubes en polystyrène à fond rond</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>FcR Blocking Agent, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12676029</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Souris IgG1 monoclonale - Contrôle des isotypes</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale Anti-Humain IgG4 Fc</td><td>abcam</td><td>ab99825</td><td>Clone HP6025</td></tr><tr><td>Souris Bleu Pacifique Anti-Humain CD3</td><td>BD</td><td>BD 558117</td><td>Clone UCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Souris anti-Humaine CD279 (-1)</td><td>BD</td><td>561272</td><td>Clone EH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Souris IgG1 &kappa ; Contrôle d’isotype</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance des anticorps pd-1-blocking liés aux lymphocytes t dérivés d'une goutte de sang périphérique

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, y compris les anticorps de blocage de la DP-1, ont considérablement amélioré les résultats du traitement dans divers types de cancer. L'efficacité pharmacologique de ces immunothérapies est durable, s'étendant même au-delà de l'arrêt de leurs injections, en raison des concentrations persistantes de sang. Ici, nous avons développé un essai de cytométrie de flux simple pour évaluer l'état de liaison des lymphocytes T des anticorps PD-1-bloquant nivolumab et pembrolizumab. Comme un test de glucose, cet essai ne nécessite qu'une seule goutte de sang périphérique. La visualisation de la liaison des anticorps sur les lymphocytes T est plus fiable que la mesure des concentrations sanguines d'anticorps. En outre, si nécessaire, nous pouvons potentiellement analyser de nombreux marqueurs distinctifs liés au système immunitaire sur les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-bloquant. Ainsi, il s'agit d'une stratégie simple et mini-invasive pour analyser l'effet pharmacologique des anticorps de Blocage de PD-1-blocage dans les patients cancéreux.

La stratégie de gating et l'analyse de cytométrie de flux (figure 1) peuvent détecter la liaison d'anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T obtenues à partir d'une goutte de sang périphérique patient de NSCLC. Avant l'administration de l'anticorps PD-1-bloquant, il n'y a pas de cellules CD8 ou CD4 positives humaines, et l'expression PD-1 peut être confirmée par un anticorps de détection de PD-1 (EH12.1)(figure 2A). Après l'administration du niv...

Nous avons développé un essai simple de cytométrie de flux pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules De, exigeant seulement une goutte de sang périphérique des patients cancéreux.

Surveillance des anticorps PD-1-Blocking liés aux lymphocytes T dérivés d'une goutte de sang périphérique

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Puisque cette méthode détermine les cellules anticorps pd-1-bloquantes utilisant le sang périphérique des patients, le sous-ensemble spécifique responsable des effets antitumoraux et des événements défavorables immunisés-connexes peut être identifié. Cette méthode n’a besoin que d’une petite quantité d’échantillon de sang et le processus d’analyse est assez simple et rapide. Il a juste besoin d’une machine de cytométrie d’écoulement.Pour commencer, prélever des échantillons de sang entier dans des tubes de collecte de sang contenant de l’EDTA. Traitez chaque tube de cytométrie de flux de polystyrène rond de cinq millilitres avec un millilitre de sérum bovin fœtal de 2 % dans le PBS. Vortex pendant 10 secondes.Transférer ensuite 20 microlitres d’échantillons de sang entier vers les tubes ronds de fond traités de cinq millilitres. Ajouter 20 microlitres de 2%FBS dans PBS et 10 microlitres de récepteur FC spécifique à l’homme bloquant le réagent. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse de globule rouge. Bien mélanger et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter quatre millilitres de 2%FBS dans PBS et faire tourner les cellules à 400 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Retirez le surnatant par aspiration. Répétez le processus de lavage et d’aspiration. Resuspendez les cellules en 100 microlitres de 2%FBS dans PBS et divisez-les en deux tubes de 50 microlitres chacun.Ajouter des anticorps marqueurs de surface. Bien mélanger et incuber pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les échantillons deux fois dans 2%FBS dans PBS comme précédemment.Resuspendez les cellules dans 200 microlitres de 2%FBS dans PBS. Insérez les tubes dans le cytomètre d’écoulement et acquérez des cellules suivant le protocole recommandé. Enregistrez 10 000 événements comme la porte des lymphocytes et les données sur le flux d’exportation sous forme de fichiers FCS pour analyse.Ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse et cliquez sur le fichier de contrôle de l’isotype pour visualiser les cellules sur une parcelle de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de dispersion latérale et les lymphocytes de porte. Sélectionnez les cellules individuelles à l’aide de FSCH versus FSCW et SSCH versus SSCW et affichez-les sur un CD3 contre CD8 ou CD3 par rapport à l’intrigue CD4. Portez les lymphocytes T CD8 et les lymphocytes T CD4 respectivement.Sélectionnez les cellules fermées et affichez-les sur une parcelle PD-1 par rapport à l’intrigue humaine IgG4. Et puis basé sur le contrôle de l’isotype, sélectionnez Q3 pour identifier les lymphocytes CD8 et CD4 liés aux anticorps PD-1-bloquants. Dans cette étude, la stratégie de blocage et l’analyse de cytométrie de flux ont détecté la liaison d’anticorps pd-1-bloquant aux lymphocytes T obtenus à partir d’une goutte de sang périphérique patient.L’intrigue PD-1 versus human IgG4 montre l’état contraignant des anticorps bloquant le PD-1 sur les cellules T. Les points orange et les points noirs indiquent des taches anticorps anti-IgG4 et de contrôle de l’isotype respectivement. Avant que l’anticorps pd-1-bloquant ait été administré, aucun CD8 positif d’IgG4 humain ou T-cells CD4 n’était présent et l’expression de PD-1 a été confirmée par un anticorps de détection de PD-1.Après l’administration de nivolumab ou de pembrolizumab, IgG4 peut être détecté sur des T-cells par anticorps anti-IgG4 tandis que le PD-1 détectant l’anticorps EH12.1 ne reconnaît aucun PD-1 sur les T-cells. Les portes rouges, bleues et vertes indiquent une liaison complète, une liaison partielle et une perte de reliure respectivement. Après que les patients aient discontinué le nivolumab et le pembrolizumab, le statut de l’anticorps PD-1-bloquant se liant aux lymphocytes T CD8 a diminué.Il y a eu une perte partielle contraignante et finalement complète de liaison. S’il vous plaît assurez-vous de mélanger l’échantillon de sang avec la lyse RBC ainsi. En outre, le mélange de la lyse RBC avant la coloration des marqueurs de surface est l’étape clé de cette méthode.Si le chercheur a accès à une machine avancée de cytométrie de flux, les lymphocytes T pd-1-bloquants liés aux anticorps peuvent être évalués avec de plus en plus de marqueurs liés à cette stratégie peuvent être appliqués pour profiler les phénotypes de cellules T responsables des événements indésirables causés par les anticorps de blocage de PD-1. L’échantillonnage des patients présentant des événements indésirables développés est important pour évaluer l’utilité de cette stratégie.

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