Test d’hémocompatibilité des implants de contact sanguin dans un modèle de boucle de flux imitant le flux sanguin humain

Ce protocole présente un modèle pour l’enquête sur l’hémocompatibilité des dispositifs de contact avec le sang conformément aux lignes directrices de l’Organisation internationale standard. Le modèle est idéal pour imiter les conditions physiologiques qui correspondent à l’implant puisque le faible fond pour les événements thrombotiques et la faible concentration d’anticoagulants permettent une large analyse du paramètre sanguin. Cette méthode est idéale pour la recherche sur les biomatériaux car elle fournit un moyen simple d’évaluer l’hémocompatibilité.

En outre, il peut être utilisé pour des études précliniques. Pour la charge d’héparine, mélangez d’abord 5 000 unités internationales d’héparine non diluée avec du chlorure de sodium de 0,9 % pour obtenir une concentration internationale de 15 unités par millilitre d’héparine. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de la solution d’héparine diluée à trois monovettes neutres et trois monovettes réservées par donneur et stockez les monovettes chargées d’héparine à quatre degrés Celsius.

30 minutes avant la collecte de l’échantillon de sang, placer les monovettes à température ambiante. Lorsque les monovettes se sont réchauffées, recueillir neuf millilitres de sang dans chacune des trois monovettes par donneur avant de mettre en commun les 27 millilitres de sang de chaque donneur dans un seul récipient en plastique. Pour préparer la boucle d’écoulement, chargez au moins un tube par condition avec l’implant neurovasculaire découpé au laser d’intérêt et placez une extrémité de chaque tube dans un réservoir rempli de chlorure de sodium à 0,9 %.

Placez un tube déchargé dans le réservoir et connectez tous les tubes à la tête de la pompe. Insérez ensuite l’autre extrémité de chaque tube dans un cylindre de mesure et ajustez les réglages de la pompe périssaltique à un débit de 150 millilitres par minuterie tout en vérifiant le niveau de remplissage dans le cylindre de mesure. Pour les tests d’hémocompatibilité, utilisez une seringue de 12 millilitres pour remplir chaque tube de six millilitres de sang.

Après avoir formé un circuit, utilisez une longueur de 0,5 centimètre de tube de raccordement en silicone pour fermer les tubes étroitement et placer les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ensuite, commencez le tube de 60 minutes. Pour l’analyse de la numération sanguine entière, ajouter 1,2 millilitres de sang non perfusé ou 1,2 millilitres de sang de chaque tube après la perfusion dans des monovettes individuelles contenant de l’EDTA.

Inversez soigneusement les monovettes cinq fois et chargez les flacons dans un analyseur de sang pour une analyse de la numémie de chaque échantillon. À la fin de l’analyse, placez les monovettes sur la glace pendant 15 à 60 minutes. Pour la collecte de plasma de citrate, remplissez les monovettes contenant du citrate de 1,4 millilitres de sang non perfusé ou perfusé et inversez soigneusement chaque monovette cinq fois.

Séparez le plasma par centrifugation et transférez trois aliquots de 250 microlitres de la fraction plasmatique en tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre. Congelez ensuite les échantillons de plasma dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur analyse. Pour la collecte de plasma EDTA, après l’incubation de quatre degrés Celsius après la mesure du nombre de sang, séparez le plasma par centrifugation et transférez trois aliquots de 250 microlitres de la fraction plasmatique en tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre.

Congelez ensuite les échantillons de plasma dans de l’azote liquide pour un stockage de moins 20 degrés Celsius. Pour la collecte de plasma CTAD, remplissez les monovettes contenant du CTAD de 2,7 millilitres de sang fraîchement dessiné ou perfusé et inversez soigneusement les tubes cinq fois. Placer les monovettes sur la glace pendant 15-60 minutes avant de recueillir le plasma par centrifugation.

Transférer 700 microlitres de chaque fraction de plasma moyen dans des tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre et centrifugeuses les tubes de réaction remplis à nouveau. Ensuite, transférez deux aliquots de 100 microlitres de la fraction moyenne en tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre et congelez les tubes dans de l’azote liquide pour leur stockage à moins 20 degrés Celsius. Pour mesurer les niveaux de TAT dans les échantillons de plasma de citrate, ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon ELISA dans chaque puits d’une plaque inférieure plate de 96 puits et 50 microlitres de plasma standard, de contrôle plasmatique et d’échantillons de plasma non dilués en doublons aux puits appropriés de la plaque.

Après avoir scellé la plaque, incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes avec des secousses douces. À la fin de l’incubation, lavez la plaque trois fois avec 300 microlitres de solution de lavage par puits avant d’ajouter 100 microlitres d’anticorps TAT conjugués à chaque puits. Après une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius avec secousses, lavez la plaque trois fois avec 300 microlitres de solution de lavage frais par puits.

Après le dernier lavage, ajouter 100 microlitres de solution chromogène fraîchement préparée par puits pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits et lire la densité optique sur un photomètre à 490 à 500 nanomètres en utilisant les données de courbe standard comme ligne de tendance pour calculer la concentration de TAT de chaque échantillon. Pour préparer les implants à la numérisation de la microscopie électronique, utilisez des forceps pour enlever les implants des tubes et rincer brièvement chaque implant trois fois dans du chlorure de sodium frais de 0,9 % par lavage.

Après le dernier lavage, conserver les implants dans des contenants individuels de 2% de glutaraldehyde dans PBS sans calcium et magnésium pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, incuber les implants dans des contenants individuels de PBS pendant 10 minutes avant de déshydrater les implants dans des concentrations ascendantes d’éthanol pendant 10 minutes par concentration comme indiqué. Directement après la collecte de sang et la perfusion, aucun changement n’est détecté dans le nombre de globules blancs ou rouges ou dans les valeurs hématocritiques.

Cependant, une diminution des niveaux d’hémoglobine est détectée après perfusion dans le système de boucle d’écoulement. On observe également une diminution du nombre de plaquettes, qui est augmentée lorsqu’un endoprocent non encolé est présent dans le tube. Notamment, cette perte est réduite lorsque le sang est incubé avec un enfilent recouvert de fibrine-héparine.

La concentration complexe de TAT est légèrement augmentée en réponse à la perfusion. Toutefois, lorsqu’un stent en métal nu est ajouté, une augmentation significative du TAT est détectée, ce qui indique une activation profonde du système de coagulation. L’utilisation d’un stent enduit de fibrine-héparine empêche cette activation.

La perfusion conduit à une activation accrue de la cascade de compliments qui n’est pas affectée par la présence d’endonts non enrobés ou recouverts de fibrine-héparine. De même, les granulocytes de neutrophile sont activés comme démontré par la quantification des niveaux polymorphonuclear d’elastase de neutrophile. La visualisation par microscopie électronique à balayage révèle que la présence d’un réseau dense de cellules sanguines et de protéines à la surface de l’endoprocent non encodé après perfusion qui n’est pas observée sur les endoprocents enduits de fibrine-héparine.

Il est de la plus haute importance de confirmer que le sang remplit les critères d’inclusion pour l’obtention d’échantillons et d’utiliser du sang fraîchement prélevé aussi rapidement que possible. Le sang humain peut contenir des virus transmissibles par le sang et d’autres agents et comporte le risque d’infection alors assurez-vous de toujours porter des EPI appropriés lors de la manipulation des échantillons.