Combiner la microdissection de capture laser et le QPCR microfluidique pour analyser les profils transcriptionnels des cellules uniques : une approche de biologie des systèmes à la dépendance aux opioïdes

Il s’agit d’une méthode très précise et rentable pour comprendre l’expression des gènes au niveau d’une seule cellule. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons adapter 96 échantillons en un seul lot. Ce nombre élevé d’échantillons nous permet d’identifier les sous-phénotypes cellulaires avec une spécificité anatomique.

Le pipeline de cette méthode peut être appliqué à n’importe quel problème biologique, n’importe quel système, n’importe quel tissu, afin de s’enquérir de la réponse cellulaire individuelle des neurones individuels ou d’autres types de cellules à la maladie ou à toute autre perturbation, n’importe quelle fonction. Et puis aller plus loin et se demander si ces réponses cellulaires ont une architecture anatomique. Retirez le cerveau de la boîte de collecte de tissus et placez-le sur le mandrin cryostatique.

Recueillir 10 sections de microns contenant le noyau central de l’amygdale ou d’une autre région cérébrale préférée en décongelant les sections de montage de 10 microns sur des toboggans en verre ordinaire. Placez immédiatement les glissières de verre sur une casserole métallique reposant sur de la glace sèche. Mettez les diapositives avec des sections cérébrales dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius dès que possible.

Pour effectuer une série de déshydratation à l’éthanol et au xylène, plongez d’abord les glissières dans 75 % d’éthanol pendant 30 secondes. Immédiatement après, trempez les glissières dans 95% d’éthanol pendant 30 secondes. Puis trempez les glissières dans 100% éthanol pendant 30 secondes.

Enfin, trempez les glissières directement dans un deuxième contenant de 100 % d’éthanol pendant 30 secondes. Après la série de déshydratation de l’éthanol, tremper les diapositives dans du xylène fraîchement versé pendant une minute. Immédiatement après, trempez les glissières dans un deuxième récipient de xylène pendant quatre minutes avant de sécher tel que décrit dans le protocole texte.

Utilisez la fluorescence pour identifier le type de cellule tachée et son noyau dans la région d’intérêt. Choisissez une cellule ou plusieurs cellules si vous faites des échantillons mis en commun à cellule unique. Marquez les cellules d’intérêt à l’aide d’une microdissection de capture laser ou d’un logiciel LCM.

Placez le bouchon LCM sur la tranche sur la région d’intérêt et faites fondre l’adhésif cap LCM sur la zone de la cellule unique sélectionnée telle que décrite dans le protocole de texte. Sélectionnez les cellules individuelles à collecter pour analyse à l’aide des outils logiciels LCM. Les cellules sélectionnées doivent se trouver dans la zone anatomique du noyau central de l’amygdale à partir de l’atlas du cerveau du rat et du bregma.

Les cellules doivent être d’au moins trois microns des noyaux tachés adjacents. Puis tirez le laser infrarouge pour recueillir les cellules individuelles identifiées. Placez le bouchon dans la station qc et visualisez-le pour vous assurer que seules les cellules désirées ont été sélectionnées.

Si d’autres cellules ont été sélectionnées par erreur, un laser ultraviolet peut être utilisé pour détruire les cellules indésirables pendant que le bouchon reste dans la station qc. Prenez une photo de la section tissulaire d’où la cellule a été recueillie pour documenter sa spécificité anatomique. Enregistrez la distance de la tranche par rapport au bregma, le cas échéant, à l’aide d’un atlas du cerveau de rat comme référence.

Retirez le bouchon LCM de la station QC et fixez le dispositif d’extraction de l’échantillon. Puis pipette 5,5 microlitres de tampon de lyse sur l’échantillon. Adaptez le dispositif d’extraction sur un tube de microcentrifugeuse de 0,5 millilitre et placez-le sur une plaque chaude à 75 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Faites tourner l’échantillon et le tampon de lyse pendant 30 secondes à basse vitesse et placez l’échantillon recueilli dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer la pré-amplification de l’ARNm à cellule unique pour une puce de réseau dynamique, ajoutez d’abord cinq microlitres de 5X VILO à chaque puits d’une nouvelle plaque PCR de 96 x 96. Retirez les échantillons de cellules simples LCM de moins 80 degrés Celsius et laissez-les décongeler brièvement.

Après centrifugation à basse vitesse, ajouter 5,5 microlitres des échantillons à cellules simples lysées à la plaque PCR en ajoutant chaque échantillon à son propre puits. Placez la plaque PCR avec les échantillons et VILO dans le thermocycleur et chauffez à 65 degrés Celsius pendant une minute et demie. Faites ensuite tourner la plaque pendant une minute à 1 300 fois g et quatre degrés Celsius et placez la plaque sur la glace.

Ajoutez 10 X cDNA synthesis master mix, T4 Gene 32 Protein, et tampon de suspension d’ADN à chaque puits. Placez la plaque PCR qui est la plaque d’échantillon un dans le thermocycleur et exécutez comme détaillé dans le protocole de texte. Après le cycle, ajouter neuf microlitres de solution de polymésase Taq à chaque puits dans la plaque PCR de 96 puits.

Neuf microlitres se composent de 7,5 microlitres de mélange principal de polymésase Taq et de 1,5 microlitres de la piscine d’amorce. Maintenant, placez la plaque PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme de pré-amplification détaillé dans le protocole de texte. Suivant le protocole de pré-amplification, ajoutez six microlitres de solution d’exonucléase à chaque puits dans la plaque PCR de 96 puits.

La solution d’exonucléase se compose de 0,6 microlitres de tampon de réaction exonuclease-one de 10X, de 1,2 microlitres d’exonuclease-un et de 4,2 microlitres de tampon de suspension d’ADN. Placez la plaque PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme indiqué dans le protocole texte. Enfin, ajoutez 54 microlitres de tampon TE à chaque puits de la première plaque d’échantillon.

Faites tourner la plaque PCR à 1 300 fois g pendant cinq minutes. Conserver à quatre degrés Celsius s’il continue immédiatement à passer à l’étape suivante. Dans une nouvelle plaque PCR de 96 puits qui est l’échantillon de la plaque deux, ajouter cinq microlitres de colorant liant l’ADN et la solution de mélange maître.

Ajouter trois microlitres d’échantillons pré-amplifiés de la première plaque d’échantillon dans les puits correspondants dans la deuxième plaque d’échantillonnage. Faites tourner la plaque PCR à 1 300 fois g, puis mettez la plaque sur la glace. Dans une nouvelle plaque PCR de 96 puits qui est la plaque d’essai deux, ajouter cinq microlitres de solution de chargement d’essai à chaque puits.

La solution de chargement d’essai se compose de 3,75 microlitres de 2X ge assay loading reagent et 1,25 microlitres de tampon de suspension d’ADN par puits. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres de 10 amorces qPCR micromolaires de la plaque d’essai un à son puits correspondant dans la plaque d’essai deux. Faites tourner la plaque PCR à 1 300 fois g pendant cinq minutes.

Pour charger et exécuter la puce de réseau dynamique, prime d’abord la puce avec le fluide de ligne de commande. Placez ensuite la puce dans un contrôleur IFC HX et exécutez le script prime 136X. Ajouter six microlitres de la plaque d’échantillonnage deux dans les puits d’échantillonnage correspondants dans la puce de réseau dynamique 96 par 96.

Maintenant, ajoutez six microlitres de la plaque d’essai deux dans les puits d’analyse correspondants dans la puce de tableau dynamique 96 par 96. Utilisez des aiguilles pour faire éclater des bulles d’air dans les puits de la puce de réseau dynamique 96 par 96. Placez ensuite la puce dans le contrôleur IFC HX et exécutez le script 136X du mélange de charge.

Ensuite, retirez la puce du contrôleur IFC HX. Placez la puce de réseau dynamique 96 par 96 dans une plate-forme rt-qPCR microfluidique et exécutez le protocole GE fast 96 by 96 PCR. La sélection des cellules individuelles a été validée visuellement et moléculairement. Visuellement, la morphologie cellulaire a été vue avant la collecte cellulaire.

On y voit des images représentatives d’une diapositive avec du cerveau antérieur à rat hémisecté contenant le noyau central de l’amygdale. Les images suivantes montrent la sélection des cellules simples et leur retrait du tissu pour l’analyse transcriptomique. Moléculairement, les marqueurs spécifiques de type cellulaire ont démontré l’expression accrue dans leur type de cellule respectif.

Plus précisément, l’expression accrue de NeuN a été observée dans les neurones, maf dans les microglies, et Gfap dans les astrocytes. La carte thermique montre l’expression de tous les échantillons à travers 40 gènes analysés. Les lignes sont des échantillons groupés tensiles, les nombres dénotent les grappes d’échantillons et les colonnes sont les gènes.

Les méthodes d’analyse multivariées montrent que les astrocytes dans le groupe de sevrage étaient le type de cellule le plus affecté. Sur la base de ces données dans le contexte d’autres études, les astrocytes jouent probablement un rôle clé dans l’inflammation dans le noyau central de l’amygdale pendant le sevrage des opioïdes. La chose la plus importante à retenir au sujet de cette technique est d’utiliser le pipetting approprié pour limiter le nombre de bulles d’air.

Les résultats transcriptionnels de ces expériences peuvent être validés à l’aide de méthodes de mesure des protéines telles que l’immunofluorescence ou la tache occidentale sur le même tissu.