Name: Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Découvrez la génération de tumeurs pancréatiques orthotopiques et la caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes par cytométrie en flux. Cette méthode permet d'analyser les réponses immunitaires dans le cancer du pancréas.

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Nous tenons à remercier le Animal Technician Service et le Dr Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Royaume-Uni) pour leur aide lors de la chirurgie orthotopique. Nous tenons également à remercier la Dre Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Royaume-Uni) pour ses conseils en technique chirurgicale, la Dre Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Royaume-Uni) pour ses conseils sur la digestion tumorale et la Dre Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Royaume-Uni) pour ses conseils concernant les protocoles de stimulation des cellules T ex vivo. Nous tenons également à remercier le Conseil de recherches médicales (CRM), le Fonds de recherche sur le cancer du pancréas (PCFR) et L'Action contre le cancer de l'ovaire qui a financé cette recherche.

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<li>Tewari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+tumor-associated+lymphocytes+confers+a+good+prognosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+an+immunohistochemical+study+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays.</a> BMC Cancer. 13 (1), 436(2013).</li>
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<li>Winograd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+Immunity+Overcomes+Complete+Resistance+to+PD-1+and+CTLA-4+Blockade+and+Improves+Survival+in+Pancreatic+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma.</a> Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).</li>
<li>Beatty, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Agonists+Alter+Tumor+Stroma+and+Show+Efficacy+Against+Pancreatic+Carcinoma+in+Mice+and+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans.</a> Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).</li>
<li>Lutz, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+converts+nonimmunogenic+pancreatic+tumors+into+immunogenic+foci+of+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation.</a> Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).</li>
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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les modèles in vivo du cancer du pancréas fournissent des outils inestimables pour comprendre la progression de la maladie et évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques3. Le modèle orthotopic en particulier est un modèle rentable et reproductible qui peut être appliqué dans de grandes cohortes de souris simultanément4,27. Le modèle orthotopic fournit également le microenvironnement cognat et le système immunitaire intact pour la croissance de tumeur, le rendant plus approprié que les sous-cutanés et Les modèles de PDX. Cependant, nous avons constaté que certains éléments de l'infiltration immunitaire peuvent différer entre le modèle orthotopic et les souris KPC, le modèle murine de référenceor 10. Une raison pour ceci pourrait être la croissance accélérée de tumeur vue dans le modèle orthotopic. D'autres différences dans la densité des sous-ensembles de cellules immunitaires ont été décrites entre les modèles orthotopiques et sous-cutanés3,28. Par conséquent, bien que le modèle transgénique de KPC soit plus coûteux et variable6,les résultats principaux devraient être vérifiés dans une petite cohorte de souris de KPC si possible.
La préparation des cellules tumorales pour la chirurgie orthotopique est une étape critique dans le protocole. Les cellules doivent toujours être dans la phase de journal de la croissance et mycoplasma- et sans infection. La chirurgie orthotopic devrait être reportée s'il y a n'importe des soucis au-dessus de la croissance de cellules de tumeur. L'utilisation de la membrane de sous-sol améliore le taux d'incidence de tumeur au-dessus des cellules d'injection sans elle29 et réduit la fuite de cellules et ainsi la propagation péritonéale27. Cependant, une fois suspendues dans la membrane de sous-sol, les cellules de tumeur devraient être rapidement injectées (dans un délai de 2 heures) pour éviter n'importe quelle perte de cellules. Le nombre de cellules tumorales nécessaires pour générer des tumeurs est susceptible d'être dépendant de la lignée cellulaire, et une gamme de numéros de cellules doivent être testés (par exemple, de 100 à 100 000) qui peuvent également déterminer le temps d'atteindre le point final. Il est probable qu'il y aura une marge d'erreur lors de la préparation de 1000 cellules par souris pour l'injection; par conséquent, si plusieurs jours de chirurgie sont nécessaires, le traitement des groupes devrait être réparti également sur plusieurs jours pour contrôler les effets des lots. La plupart des étapes chirurgicales peuvent être modifiées en fonction des préférences; cependant, il faut prendre soin de ne pas déranger la membrane du sous-sol lors du remplacement du pancréas dans la cavité abdominale ou de la fermeture de la paroi péritonéale. La fuite de membrane de sous-sol peut causer la croissance de cellules de tumeur sur la paroi péritonéale, qui se forment rapidement et peuvent avoir à devoir sacrifier l'animal plus tôt.
Idéalement, les tumeurs pancréatiques devraient être rapidement digérées après la récolte et préparées pour la stimulation ex vivo immédiatement. Cependant, ceci pourrait ne pas être possible s'il y a un grand lot de tumeurs à récolter, dans ce cas les tumeurs devraient être maintenues sur la glace et digérées dans des lots. Le type, la concentration et la durée de l'exposition aux enzymes digestives ont tous été montrés pour affecter un grand nombre de molécules de surface sur les cellules immunitaires30,31,32. Le temps de digestion est également délibérément court pour limiter la mort cellulaire33. Les cellules digérées peuvent être congelées dans un milieu de congélation pour un stockage à long terme; cependant, une certaine perte de cellules se produira lors de la décongélation. Le processus de digestion peut être moins qu'optimal si les morceaux de tumeur ne sont pas suffisamment coupés en dés avant l'incubation de collagène et ceci sera évident car les morceaux durs de tumeur resteront dans le filtre après digestion. La concentration de collagène peut être abaissée si vous travaillez avec le pancréas sain ou les tumeurs à un stade précoce; rapports sur l'extraction des cellules canalaires pancréatiques saines emploient des concentrations significativement plus basses34. Un degré élevé de mort épithéliale de cellules est à prévoir pendant la digestion ; cependant, les cellules immunitaires devraient tolérer le processus bien. D'autres méthodes existent pour isoler les cellules épithéliales viables pour la croissance organoïde35 ou pour préserver l'architecture tissulaire36.
Les modifications au protocole de stimulation peuvent être apportées facilement, selon la lecture souhaitée et la cellule immunitaire analysée (par exemple, les macrophages ou les cellules B). L'utilisation de réactifs pan-stimulation PMA / ionomycine ne discrimine pas pour la spécificité TCR-antigène, ce qui le rend utile lorsque l'antigène n'est pas connu. Cependant, la production d'IFN est étroitement associée à l'engagement de TCR37 et la production d'IFN et de TNFMD sont essentielles dans les réponses antitumorales pDAC38. La stimulation de PMA/ionomycine reflète la capacité maximale des lymphocytes T pour produire des cytokines, qui pourraient ou pourraient ne pas être produites par les cellules T dans le microenvironnement de tumeur. La production endogène peut être mesurée sans besoin de stimulation; cependant, les niveaux peuvent être beaucoup plus bas ou indétectables. Il existe d'autres méthodes pour stimuler les lymphocytes T : les perles enduites d'anti-CD3/28, qui ne nécessitent pas non plus d'antigène ou même d'autres populations de cellules immunitaires. L'avantage de cette méthode est de permettre la quantification de la production de cytokine par des sous-ensembles spécifiques de cellules T sans avoir besoin de méthodes de séparation. D'autres marqueurs de cytotoxicité (granzyme B et Perforin A), d'activité (IL-2) ou d'immunosuppression (IL-10) peuvent également être ajoutés21. Cependant, les anticorps de cytométrie de flux de haute qualité ne sont pas disponibles pour détecter toutes les cytokines et les facteurs d'intérêt. Par conséquent, s'il existe d'autres applications telles que ELISA nécessaire la stimulation peut être effectuée sans l'inclusion de la brefeldine A / monensine, permettant la libération de cytokine dans le supernatant. Cependant, il convient de noter que cela permettra la libération totale de cytokine cellulaire et il ne sera pas possible de déterminer quelles populations cellulaires ont contribué.
La production d'IFN est une caractéristique dominante d'une réponse antitumorale de cellule T, souvent employée comme substitut à la reconnaissance de TCR-antigène37,38. D'autres méthodes in vivo qui définissent plus précisément les réponses spécifiques à l'antigène utilisent des cellules tumorales exprimant un antigène connu, comme l'Ovalbumin ou le SV40. L'antigène universel peut ensuite être utilisé ex vivo pour tester la reconnaissance des lymphocytes T ou en combinaison avec une souris hôte tCR-restreinte. Alternativement, lorsque l'antigène est inconnu, la quantification de l'expansion clonale des lymphocytes T peut être effectuée par séquençage en vrac-TCR, ou plus récemment un séquençage de TCR à cellule unique39,40. Pour bien comprendre l'état de la réponse intratumorale des lymphocytes T, les marqueurs indicatifs d'épuisement ou de récepteurs inhibiteurs doivent également être mesurés, y compris : CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Ainsi que des marqueurs de lymphocytes T effecteurs (CD44salut, CD62lo) et l'activité proliférante, Ki67ou CSFE dilution41,42,43,44. Dans l'ensemble, le modèle orthotopic fournit une plate-forme utile pour tester rapidement des stratégies thérapeutiques, en particulier qui peuvent moduler la réponse antitumorale de T-cell, qui peut ensuite être validée sur une plus petite cohorte de transgéniques, KPC, souris.

Cette méthode détaille, du début à la fin, la procédure chirurgicale pour produire des tumeurs pancréatiques orthopiques utilisant une quantité minimale de matériel cellulaire et la dissociation rapide suivante des tumeurs établies pour l'analyse complète de cytométrie de flux des populations immunisées de cellules, y compris l'analyse ex vivo de la fonction de cellule T.
L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est un carcinome agressif avec seulement 8 % des patients survivant 5 ans1. Comme moins de 20 % des patients sont admissibles à la résection chirurgicale2,les échantillons de patients frais ne sont pas facilement accessibles pour la recherche et, par conséquent, les modèles in vivo fournissent des outils essentiels pour étudier cette maladie. Il existe plusieurs modèles murins de PDAC : orthotopic, sous-cutané, transgénique, intraveineux et patient-dérivé xénogreffe (PDX), largement décrit ici3. Le modèle orthotopic décrit ici permet l'injection de cellules PDAC syngéniques dans le pancréas des souris immunocompétentes. Cela peut être effectué dans de grandes cohortes de souris sauvages ou mutantes, et fournit ainsi un modèle rentable et cohérent pour la comparaison des agents thérapeutiques. Fait important, le modèle orthotopic fournit le microenvironnement cognat pour la croissance des cellules tumorales et métastases dans nos mains et d'autres4 à des sites cliniquement pertinents (par exemple, le foie), ce qui le rend plus cliniquement pertinent que les modèles sous-cutanés ou induits chimiquement. Les tumeurs orthotopiques affichent les caractéristiques clés de PDAC, telles qu'une forte réaction desmoplastique avec une abondance de fibroblastes et de dépôt de matrice extracellulaire5. Les modèles transgéniques de PDAC sont l'étalon-or du modèle de la murine et le plus couramment utilisé est le modèle KPC, qui exprime mutant KrasG12D / et Trp53R172H / sous le pancréas spécifique Pdx-1-Cre promoteur6. D'autres modèles KPC et autres PDAC in vivo sont examinés ici7. Les souris de KPC développent spontanément des tumeurs pancréatiques avec une progression de la maladie qui reproduit fidèlement des dispositifs de PDAChumain 6. Cependant, comme pour tous les modèles transgéniques, le programme de reproduction est coûteux, la progression tumorale est variable et nécessite donc souvent de grandes cohortes de souris. Les modèles PDX utilisent des cellules tumorales ou des morceaux dérivés du patient qui sont ensuite cultivés soit orthotopiquement ou plus souvent sous-cutanéechez chez des souris immunodéprimées. Les modèles de xénogreffe fournissent des outils utiles pour le dépistage des composés thérapeutiques et tiennent compte de l'hétérogénéité du patient. Cependant, ils ne fournissent pas un microenvironnement immunitaire complet, limitant ainsi leurs applications8,9.
Une fois établies, les tumeurs orthotopiques prennent typiquement environ 1 mois ou plus pour se développer (selon la ligne cellulaire utilisée) et forment de grandes tumeurs qui peuvent être facilement imaged par ultrason ou MRI pour suivre la progression et déterminer l'efficacité de traitement4,5,10. Cependant, une fois dans la croissance exponentielle, la dernière phase de la croissance de tumeur peut être rapide, ainsi la plupart des régimes de traitement sont commencés relativement tôt (par exemple, 14 jours)11,12. Le système immunitaire joue un rôle critique dans le développement de tumeur, y compris dans PDAC, qui est caractérisé par une tumeur immunosuppressive s'infiltrer avec le manque relatif des cellules De et la présence fréquente des cellules myéloïdes13. Une forte présence de lymphocytes T dans pDAC confère un meilleur pronostic14,15. Cependant, en tant qu'agents simples, les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire qui soulagent l'immunosuppression de cellules T, tels que l'anti-CTLA-416 et anti-PD-L117,n'ont pas montré l'avantage clinique dans les patients de PDAC, probablement parce que la réactivité globale de cellule T est très basse. Cependant, les agents que les réponses principales de cellules T, telles que le vaccin anti-CD40, peuvent surmonter la résistance anti-PD-L1/CTLA-418,19 et la vaccination avec le vaccin allogeneic de PDAC de GM-CSF-sécrétant (GVAX) peut augmenter l'immunogénicité des tumeurs de PDAC20,indiquant que l'amélioration des réponses de cellules de T forme l'avenue thérapeutique importante.
Critique à une réponse antitumorale de cellule De est la reconnaissance des antigènes tumeur-dérivés par l'intermédiaire du récepteur de T-cell (TCR) et de la production suivante des cytokines et des granules cytotoxiques. Bien que la reconnaissance de l'antigène des lymphocytes T puisse être déterminée par le séquençage du TCR, cette approche est coûteuse et prend beaucoup de temps. Cependant, la quantification des sous-ensembles de cellules T infiltrants de tumeur fournit une bonne indication d'une réponse antitumoral. Un examen plus approfondi de l'activité des lymphocytes T ex vivo en termes de dégranulation, de production de cytokine et d'autres facteurs cytotoxiques fournit une analyse fonctionnelle plus approfondie. Ces essais peuvent être exécutés sur des échantillons frais de tumeur et beaucoup de paramètres de fonction de cellule T peuvent être mesurés rapidement par cytométrie de flux.
Les cellules CD8et CD4et T produisent des cytokines telles que les IFNMD et les TNMD pour potentialiser une réponse immunitaire21. IFN - induit la régulation MHCI sur les cellules cibles, induit la différenciation et le recrutement des cellules immunitaires et aide la mort cellulaire. La production d'IFNpar par les cellulesT CD8 est bien caractérisée pour faire partie d'une réponse antitumorale et est en corrélation avec la régression tumorale22,23. TNF est une autre cytokine proinflammatoire produite par les lymphocytes CD8et CD4T. Il améliore l'activation TCR-dépendante et la prolifération des lymphocytes T, aidant la réponse anti-tumorale. Lors de l'engagement TCR, cytotoxiques CD8- lymphocytes T peuvent subir la dégranulation, où les lysosomes sécréteurs préformés contenant des molécules cytotoxiques sont libérés dans la synapse immunologique pour causer la dégradation des cellules cibles21. Ces molécules comprennent la perforine, une protéine qui se lie à la membrane cellulaire cible, formant des pores qui perturbent ensuite l'intégrité de la membrane et permettent la diffusion21 ou l'endocytose24 d'autres molécules cytotoxiques, telles que Granzyme B, directement dans le cytoplasme de la cellule cible. Granzyme B est une protéase qui édicte la dégradation de protéines multiples dans la cellule cible, conduisant à la mort cellulaire21. La libération de ces molécules nécessite l'exocytose des endosomes à la surface cellulaire, où le marqueur endosomal CD107a (également connu sous le nom DE LAMP-1) est incorporé transitoirement dans la membrane cellulaire25.
La mesure de la sécrétion de cytokine par les lymphocytes T nécessite leur isolement par le tri des cellules assistées par le flux ou des tests de séparation à base de perles, qui ne peuvent pas être facilement effectués sur un grand nombre d'échantillons simultanément. Cependant, la mesure des cytokines intracellulaires ne nécessite aucune étape de pré-isolement et peut être facilement effectuée sur plusieurs échantillons à la fois, permettant une approche à haut débit. Comme les cytokines sont rapidement sécrétées par les lymphocytes T, les niveaux intracellulaires peuvent être indétectables et donc la cellule T nécessite une stimulation pour augmenter la production de cytokine basale. Pour évaluer la production de cytokine à l'antigène, l'antigène reconnu par le TCR doit être présenté à la cellule T par un APC apprêté in vitro. Dans les cas où la spécificité de l'antigène n'est pas connue, une approche de stimulation large est nécessaire. La stimulation de TCR peut être imitée utilisant des perles anti-CD3/28 qui fournissent l'activation et la costimulation de TCR, qui induit la production et la prolifération de cytokine. Cependant, une alternative plus rentable est l'utilisation de la PMA et de l'ionomycine, qui, ensemble, activent largement les voies de signalisation qui mènent à la synthèse et à la libération des cytokines intracellulaires. Plus précisément, la PMA active la protéine kinase C (PKC) et l'ionomycine soulève des ions intracellulaires Ca2, ce qui augmente la signalisation cellulaire. Afin de préserver le contenu intracellulaire des cytokines, cette stimulation peut être efficacement combinée avec des inhibiteurs du transport de protéines brefeldin A et monensine, qui bloquent les protéines dans le Golgi et empêchent ainsi la libération extracellulaire. L'utilisation de LA PMA/ionomycine est une méthode bien établie pour stimuler les lymphocytes T et il existe une forte corrélation entre les cytokines extracellulaires et intracellulaires26. La stimulation des lymphocytes T avec PMA et ionomycine augmente également le trafic de lysosome à la membrane cellulaire et ainsi CD107a devient transitoirement intégré sur la surface de la cellule avant d'être recyclé dans la cellule. En incluant un anticorps anti-CD107a pendant la stimulation, il est possible de l'utiliser comme marqueur de l'activité de dégranulation25.
Cette méthode digère rapidement les tumeurs pour fournir une suspension unicellulaire. À ce stade, les populations individuelles peuvent être directement tachées pour la cytométrie du débit ou purifiées par des méthodes en aval : tri cellulaire assisté par flux ou séparation des perles magnétiques. La préparation d'une suspension unicellulaire pour l'analyse de cytométrie de flux permet l'analyse à haut débit des populations de cellules immunitaires multiples et de leurs marqueurs phénotypiques, fournissant une quantification précise du nombre de cellules immunitaires et du phénotype.
Enfin, le protocole de digestion décrit ici empêche la perte de marqueurs de surface cellulaire et maintient la viabilité des cellules immunitaires, permettant aux cellules immunitaires de subir d'autres étapes de purification cellulaire et de la culture au besoin. Cependant, cette méthode n'a pas été testée pour dériver les cellules épithéliales de cette digestion.

<table><tbody><tr><td>Sutures résorbables en vicryl enduit de calibre 6/0</td><td>Ethicon</td><td>W9500T</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; crépine à cellules de la taille des pores</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Clips Clay Adams</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015A</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD107a PE (clone 1D4B)</td><td>Biolegend</td><td>121612</td><td>1:100 aux milieux de culture</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Utilisation à la dilution finale 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2)</td><td>Biolegend</td><td>46-0032</td><td>Utilisation à la dilution finale 1:50</td></tr><tr><td>anti-CD4 FITC (clone GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td>Utilisation à la dilution finale 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103140</td><td>Utilisation à la dilution finale 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100738</td><td>Utilisation à la dilution finale 1:100</td></tr><tr><td>anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2)</td><td>Biolegend</td><td>505826</td><td>Utilisation à la dilution finale 1:50</td></tr><tr><td>anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X)</td><td>Biolegend</td><td>506314</td><td>Utilisation à la dilution finale 1:50</td></tr><tr><td>BD Matrigel Matrice de membrane basale Haute concentration</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td>Aliquote sur glace et stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de stimulation cellulaire (500x) (phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et ionomycine)</td><td>eBioscience</td><td>00-4970-03</td><td>1x Concentration finale PMA 0.081 &mu ; M, ionomycine 1,34 &mu ; M</td></tr><tr><td>Clay Adams Applier Autoclip</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Clay Adams Autoclip remover</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type V de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9263</td><td>2 mg/mL en milieu</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glycémie élevée (4,5 g/L) avec L-Glutamine</td><td>PAA</td><td>E15-810</td><td></td></tr><tr><td>DNase (désoxyribonucléase I du pancréas bovin de type II-S) stock 10 mg/mL dans 0,15 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>Concentration finale dans le milieu de digestion 0,025 mg/mL</td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye 506 (FVD506)</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>Utilisation à 1:200 dans le PBS</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-104</td><td>10 % dans RPMI</td></tr><tr><td>Seringue Hamilton série 700, 25 &mu ; Volume L, pointe biseautée de l’aiguille de calibre 22 Fisher</td><td>Scientific</td><td>10100332</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fixation intracellulaire et tampon de perméabilisation intracellulaire</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td>Tampon de perméabilisation diluée à 1x dans H2O</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td>100 unités/mL Pénicilline, 100 &mu ; g/mL Cocktail d’inhibiteurs du transport des protéines de streptomycine</td></tr><tr><td>(500x) (brefeldin A et monesin)</td><td>eBioscience</td><td>00-4980-03</td><td>1x Concentration finale Brefeldin A 10.6 &mu ; M, monensin 2 &mu ; M</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (contenant 0,3 g/L de glutamine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel chirurgical n° 10</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Solution de trypsine-EDTA 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>594-18C</td><td>Trypsine (0,1 %) EDTA (0,4 %) concentration finale</td></tr><tr><td>Fond en U 96 Plaque de micropuits</td><td>VWR</td><td>734-2080</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs universels à pointe de coton - 6 pouce x 100</td><td>Medisave</td><td>UN982</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à micropuits 96 à fond en V</td><td>VWR</td><td>735-0184</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules t infiltrantes

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Les modèles in vivo du cancer du pancréas fournissent des outils inestimables pour étudier la dynamique des maladies, l'infiltration immunitaire et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le modèle orthotopic de murine peut être exécuté sur de grandes cohortes de souris immunocompétentes simultanément, est relativement peu coûteux et préserve le microenvironnement de tissu cognate. La quantification de l'infiltration de cellule T et de l'activité cytotoxique dans les tumeurs orthotopiques fournit un indicateur utile d'une réponse antitumorale.
Ce protocole décrit la méthodologie pour la génération chirurgicale des tumeurs pancréatiques orthopiques par injection d'un petit nombre de cellules syngeneic de tumeur rechargées dans la membrane de sous-sol de 5 l directement dans le pancréas. Les souris portant des tumeurs orthotopiques prennent approximativement 30 jours pour atteindre le point final, à quel point les tumeurs peuvent être moissonisées et traitées pour la caractérisation de l'activité de cellule T tumeur-infiltrante. La digestion enzymatique rapide utilisant la collagène et le DNase permet d'extraire une suspension à cellule unique des tumeurs. La viabilité et les marqueurs de surface cellulaire des cellules immunitaires extraites de la tumeur sont préservés ; par conséquent, il est approprié pour les applications en aval multiples, y compris le tri des cellules immunitaires assistées par flux pour la culture ou l'extraction de l'ARN, l'analyse de cytométrie de flux des populations de cellules immunitaires. Ici, nous décrivons la stimulation ex vivo des populations de lymphocytes T pour la quantification intracellulaire de cytokine (IFNMD et TNFMD) et l'activité de dégranulation (CD107a) comme mesure de cytotoxicité globale. Des digests entiers-tumoral ont été stimulés avec l'acétate de myristate de phorbol et l'ionomycine pendant 5 h, en présence de l'anticorps anti-CD107a afin de surréglementer la production et la dégranulation de cytokine. L'addition de brefeldin A et de monensine pour les 4 h finaux a été effectuée pour bloquer le transport extracellulaire et maximiser la détection de cytokine. La coloration extra- et intra-cellulaire des cellules a ensuite été effectuée pour l'analyse de cytométrie du débit, où la proportion de cellules IFNMD, TNFet et CD107a, CD4 et CD8et T ont été quantifiées. 
Cette méthode fournit une base de départ pour effectuer l'analyse complète du microenvironnement de tumeur.

Après l'injection de 1000 cellules TB32048 dans le pancréas, les tumeurs orthotopiques prennent environ 30 jours à se développer (Figure 1A,B). Les fuites de membrane de sous-sol pendant la chirurgie peuvent causer la formation de grandes tumeurs directement sur la paroi péritonéale, qui sont bien visibles à travers la peau (Figure 1C). Nous retirerions ces souris de l'étude. Cependant, avec de bonnes qualifications chirurgicales l'incidence de la fuite est réduite au minimum. Les tumeurs orthotopiques récoltées au point final peuvent atteindre une taille substantielle chez les souris de type sauvage C57BL/6 (Figure 1D). Les tumeurs orthotopiques récoltées nécessitent une digestion en collagène/DNase pendant 20 min afin d'obtenir une suspension unicellulaire (figure 2). À ce stade, les cellules dérivées de tumeur peuvent être plaquées dans une plaque U-bottomed à 2 x 106 cellules/puits. Le nombre de cellules plaquées peut être modifié en fonction de la prévalence des lymphocytes T dans l'échantillon; le nombre de cellules peut être abaissé si les lymphocytes T sont à haute densité. Des échantillons de rate de contrôle ou de ganglion lymphatique peuvent également être plaqués à ce stade pour la stimulation. Chaque puits est stimulé par PMA et ionomycine pendant 5 h et après 1 h d'incubation, la brefeldine A et la monensine sont ajoutées afin de bloquer la libération extracellulaire de cytokines (Figure 2). Après l'incubation, les échantillons sont tachés pour les épitopes extracellulaires et les cytokines intracellulaires pour analyse par cytométrie du débit (Figure 2).
Des échantillons de rate et de tumeurs des souris portant des tumeurs orthotopiques ont été analysés par cytométrie de flux. La stratégie de gating utilisée dans l'analyse de cytométrie de flux pour les tumeurs de rate et orthotopic exclut des débris utilisant FSC-A, SSC-A, doublets par FSC-A/FSC-H et SSC-A/SSC-W, alors morts ou cellules apoptotic comme positif pour le colorant de viabilité réparable (figure 3A). Les cellules immunitaires sont ensuite fermées sous le régime de CD45, et les lymphocytes T sont plus fermés sous le cD3, à partir desquels les sous-ensembles CD4 et CD8 sont définis ( Figure 3A). Une fluorescence moins un (FMO) est effectuée pour déterminer la fluorescence de fond pour le gating et un contrôle de brefeldin A/monensin seulement est exécuté pour déterminer la production basale des cytokines (figure 3B-D).
Pour l'IFN, l'incubation avec de la brefeldine A/monensin n'a eu comme conséquence aucune augmentation d'IFNMD au-dessus du contrôle de FMO dans les échantillons de rate et de tumeur. Cependant, l'ajout de PMA et d'ionomycine a augmenté le % de l'IFN intracellulaire, détectable dans les cellules CD4 spléniques et dérivées de tumeurs. 
Les lymphocytes Splenic CD4et CD8T, utilisés comme un contrôle positif, ont une production d'IFN relativement plus élevée que les sous-ensembles de lymphocytes T infiltrants par tumeur, avec une moyenne de 6,60 à 1,5 % et 12,97 à 3,4 % contre 4,81 à 1,0 % et 4,13 à 1,3 %, indiquant que l'immunosuppression se produit dans la tumeur(Figure 3B et 4A). En utilisant la même stratégie pour le TNMD, nous avons visualisé qu'un pourcentage élevé de cellules CD4et T spléniques sont positifs pour le TNF intracellulaire (65,93 - 2,3 %), comparativement aux cellules CD4et T infiltrants par tumeur (22,45 à 5,4 %). Les cellules CD8et T spléniques et infiltrantes par les tumeurs produisent des niveaux similaires de TNFMD (25,15 à 3,7 % et 19,91 à 5,1 %, respectivement) (Figure 3C, Figure 4B).
Enfin, CD107a est un marqueur endosomal qui s'exprime transitoirement sur la surface cellulaire pendant l'exocytose des granules cytotoxiques et des cytokines, en tant que tel, il est utilisé comme marqueur de substitution pour la cytotoxicité. L'avantage de la coloration pour CD107a pendant la stimulation est que tous les CD107a exprimés par la surface cellulaire transitoire seront capturés par l'anticorps fluorescent. Les niveaux basaux de CD107a sont montrés dans les cellules traitées de brefeldin A/monensin seulement. Pour les cellules Splenic CD8et T, la stimulation par PMA/ionomycine augmente le niveau de CD107a détecté, avec la plus forte upregulation dans les cellules CD8- qui étaient 23,95 - 3,5% CD107a, par rapport à 5,8 - 1,9 % dans lescellules CD8 infiltrant la tumeur, indiquant splenic CD8- avait un taux plus élevé de degranulation. D'autre part, cD4 splénique et infiltrant la tumeur- exprimé des niveaux comparables de CD107a 9,37 - 1,5 % et 11,50 - 1,8 % (Figure 3D et 4C).
Dans l'ensemble, ces résultats soulignent que les tumeurs orthotopiques peuvent être générées par l'injection d'un très faible nombre (1000) de cellules tumorales dans le pancréas. Ces tumeurs peuvent être rapidement digérées pour l'isolement des lymphocytes T pour la stimulation ex vivo. La détection des cytokines intracellulaires est possible et accentue le niveau basal d'immunosuppression des lymphocytes T infiltrants, comparéaux aux cellules T dans les organes lymphoïdes secondaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg"> Figure 1 : Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques. (A) Calendrier d'expériences in vivo. (B) L'aspect macroscopique des tumeurs orthopiques dans la cavité abdominale (à gauche) et après l'excision (à droite) où la tumeur montrée a été coupée en deux. (C) L'évidence de la fuite de membrane de sous-sol pendant la chirurgie peut causer des tumeurs pour se développer qui sont visibles par la peau (photo supérieure) et forment sur la paroi péritonéale (photo inférieure). (D) Poids pancréatiques orthopiques de tumeur moissonné s'est produit des souris qui avaient atteint le point final (n-22). Chaque point de données représente une souris individuelle, graphique à barres montre moyenne - SEM. Les données de ce chiffre ont été modifiées à partir de l'ouvrage publié précédemment10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg"> Figure 2 : Schématique de traitement des tumeurs orthotopiques pour la stimulation ex vivo de cellule T. Après la récolte, les tumeurs pancréatiques sont rapidement digérées dans la collagène (2 mg/mL) et le DNase (0,025 mg/mL) pendant 20 min à 37 oC. Par la suite, les cellules sont suspendues à 2 x 106/mL dans un support RPMI complet et plaquées dans une plaque à fond U. Un cocktail de stimulation de PMA et d'ionomycine est ajouté pour 5 h, à quel point l'anticorps anti-souris CD107a peut également être ajouté à la culture. Après 1 h d'incubation, les bloqueurs de transport intracellulaires, la brefeldine A et la monensine, sont ajoutés. Après la stimulation ex vivo, les cellules sont transférées dans une plaque à fond En V pour la coloration avec le colorant réparable de viabilité (en PBS) pendant 20 min 4 oC. Les cellules sont lavées dans le tampon FACS et incubées en anti-CD16/32 (bloc FcR) pendant 15 minutes (dans le tampon FACS) puis incubées avec des anticorps extracellulaires conjugués fluorescents pendant 30 min supplémentaires (dans le tampon FACS). Les cellules sont lavées à nouveau dans le tampon FACS et resuspend dans le tampon de fixation intracellulaire pendant 20 min. Après cela, les cellules sont lavées une fois dans le tampon FACS et une fois dans le tampon de perméabilisation 1x. Les cellules sont suspendues pendant 1 h à RT dans les anticorps intracellulaires conjugués fluorescents pendant 1 h (dans le tampon de perméabilisation de 1x). Les cellules sont lavées une fois dans le tampon de perméabilisation 1x et une fois dans le tampon FACS avant de se resuspendre dans le tampon FACS pour l'acquisition sur le cytomètre de flux dans les 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg"> Figure 3 : Analyse de cytométrie de flux des cellules T ex vivo stimulées par la rate et la tumeur. (A) Stratégie de gating de cytométrie de flux utilisée pour les échantillons de rate (contrôle positif) et de tumeurs orthotopiques. Les cellules sont discriminées à partir des débris utilisant FSC-A/SSC-A et les cellules individuelles sont plus isolées à l'aide de FSC-A/FSC-H et SSC-A/SSC-W. Les cellules mortes ou apoptotiques sont exclues à l'aide du colorant de viabilité réparable -FVD506 et les cellules immunitaires sont fermées par CD45. Suite à cela CD3et les sous-ensembles CD4et CD8et CD8 sont définis. Les données ont été acquises sur un BD Fortessa. (B) La stratégie de gating utilisée pour quantifier les cellulesIFNMD, CD4 et CD8et T. Un contrôle fluorescent moins un (FMO) est utilisé sur des échantillons entièrement stimulés (PMA/ionomycine/brefeldin A/monensin) pour déterminer la fluorescence de fond. Un contrôle de brefeldin A/monensin seulement (B-M seulement) est employé pour déterminer la production basale de cytokine. L'échantillon entièrement stimulé est ensuite utilisé pour calculer le % des cellulesT IFNMD. (C) La stratégie de gating utilisée pour quantifier les cellules TNFMDet CD4 et CD8 et T. Un contrôle FMO est utilisé sur des échantillons entièrement stimulés (PMA/ionomycine/brefeldin A/monensin) pour déterminer la fluorescence de fond. Un contrôle de brefeldin A/monensin seulement (B-M seulement) est employé pour déterminer la production basale de cytokine. L'échantillon entièrement stimulé est ensuite utilisé pour calculer le % de lymphocytesT DeNMD. (D) La stratégie de gating utilisée pour définir les cellules CD107aet CD4 et CD8et T. Un contrôle FMO est utilisé sur des échantillons entièrement stimulés (PMA/ionomycine/brefeldin A/monensin) pour déterminer la fluorescence de fond. Un contrôle de brefeldin A/monensin seulement (B-M seulement) est employé pour déterminer la dégranulation basale. L'échantillon entièrement stimulé est ensuite utilisé pour calculer le % de cellules CD107aet T. Toutes les données de cytométrie de flux ont été analysées sur FlowJo Version 10.6.1. Les données de ce chiffre ont été modifiées à partir de l'ouvrage publié précédemment10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg"> Figure 4 : Quantification de l'activité des lymphocytes T dérivées de la rate ex vivo et de la tumeur. La proportion de CD4et de CD8- lymphocytes T positifs pour (A)IFNMD (B) TNFet et (C) CD107a- a été quantifiée dans la rate (n -4) et la tumeur (n -7) des souris porteuses orthotopic-tutoltopiques. Chaque point de données représente une moyenne d'affichage de souris et d'erreurs individuelles - SEM. Importance statistique a été testée à l'aide d'un test t non apparié où le p-lt;0,05 et le p-lt;0,001. Toutes les données ont été analysées à l'aide de Prism 8. Les données de ce chiffre ont été modifiées à partir de l'ouvrage publié précédemment10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole décrit la génération chirurgicale des tumeurs pancréatiques orthopiques et la digestion rapide des tumeurs pancréatiques murines fraîchement isolées. Après la digestion, les populations viables de cellules immunitaires peuvent être employées pour l'analyse plus en aval, y compris la stimulation ex vivo des cellules de T pour la détection intracellulaire de cytokine par cytométrie d'écoulement.

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Cette méthode peut être utilisée pour asses comment de nouveaux agents thérapeutiques ou des stratégies, influencer ou augmenter la réponse cytotoxique des lymphocytes T pendant le cancer du pancréas. Cette technique permet aux tumeurs d’être rapidement digérées et stimulées in vitro, permettant l’analyse simultanée de plusieurs paramètres de la réponse des cellules T, qui peuvent être facilement adaptés pour d’autres applications. Pour commencer, utilisez des forceps, transférez la tumeur sur une boîte de Pétri.Conserver cinq millilitres de milieu de digestion dans un tube de 50 millilitres sur la glace pour empêcher l’activité enzymatique de commencer. Prenez un petit aliquot de cette solution, pour couvrir la tumeur sur la boîte de Petri. Utilisez un scalpel stérile et des forceps pour couper la tumeur en petits morceaux, à peu près moins de trois millimètres de longueur.Gratter les morceaux de tumeur dans le tube, et inverser doucement le tube jusqu’à ce que tous les morceaux sont immergés dans les supports de digestion. Transférer le tube sur un dispositif de secousse pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour digérer. Assurez-vous que tous les morceaux de tumeur sont submergés, et non collés au bord du tube.Immédiatement après l’étape de digestion, placez le tube sur la glace pour ralentir l’activité enzymatique. Ajouter EDTA pour atteindre une concentration finale de 20 millimolaires, et vortex brièvement l’échantillon à mélanger afin de ralentir davantage l’activité enzymatique. Ouvrez le tube et rincez n’importe quel digest de tumeur du couvercle du tube avec le milieu frais de RPMI.Ensuite, préparez une passoire de 70 microns, placez-la sur un tube ouvert de 50 millilitres sur la glace. Pré-mouiller le filtre avec moyen. Resuspendez les cellules digérées et lavez les côtés du tube à l’aide d’une stripette de 25 millilitres ou plus.L’ouverture plus large de la Stripette permet au digest épais de passer facilement. Transférer tout le digest sur la passoire à l’aide de la Stripette de 25 millilitres. Écraser de haut en bas de la tumeur sur le dessus du filtre à l’aide d’un piston de seringue d’un millilitre.Lavez continuellement les cellules à travers la passoire avec RPMI. Assurez-vous de laver avec suffisamment de force pour pousser les cellules à travers. Continuer le lavage jusqu’à ce que toutes les cellules soient passées à travers la passoire.Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 300 fois G, et quatre degrés Celsius. Resuspendez soigneusement la pastille cellulaire, et complétez rpmi, et passez directement par un autre filtre pour enlever n’importe quelle matrice extracellulaire, ou de grandes touffes de cellules qui ne peuvent pas être adéquatement résuspendées. Si aucune stimulation n’est nécessaire, tacher immédiatement les cellules isolées pour l’analyse de cytométrie de flux, ou les resuspendre dans le milieu de congélation de 10%DMSO et FBS, et stocker à moins 80 degrés Celsius.Pour effectuer la stimulation, comptez d’abord les cellules. Diluer les cellules dans un milieu complet pour atteindre une concentration de deux fois dix à six pour 100 microlitres. Plaque 100 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de puits à fond U 96.Ajouter 100 microlitres de milieu complet, contenant une préparation 2X de PMA, et Ionomycine. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius, mais 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Puis, à 20 microlitres d’une préparation 10X de Brefeldin A, et Monensin, et les médias complets pour atteindre une concentration finale de 1,06 micromolaire, et 2,0 micromolaire, respectivement.Remettre la plaque dans l’incubateur pendant encore quatre heures. Après avoir injecté 1000 cellules TB32048 dans le pancréas, les tumeurs orthotopiques prennent environ 30 jours pour se développer. Après digestion et stimulation des tumeurs orthotopiques récoltées, une fluorescence moins une a été exécutée pour déterminer la fluorescence de fond pour le gating.Et Brefeldin A Monensin seul contrôle a été effectué pour déterminer la production basale de cytokines. Pour l’incubation d’interféron-gamma avec Brefeldin A et Monensin, n’a eu comme conséquence aucune augmentation du gamma d’interféron au-dessus du contrôle de FMO, dans la rate et les échantillons de tumeur. Cependant, l’addition de PMA et d’ionomycine, a augmenté le pourcentage de gamma intracellulaire d’interféron détectable dans les cellules T positives et CD8 positives de CD4 splenic et tumeur-dérivées.Les lymphocytes T positifs CD4 et CD8 spléniques, utilisés comme contrôle positif, ont une production gamma d’interféron relativement plus élevée que les sous-ensembles de cellules T infiltrant les tumeurs. L’immunosuppression indique se produit dans la tumeur. Utilisant la même stratégie pour TNF alpha, un pourcentage élevé de lymphocytes T positifs CD4 spléniques étaient positifs pour l’alpha intracellulaire de TNF.Comparé aux lymphocytes T positifs CD4 tumeur-infiltration. Les lymphocytes T positifs CD8 spléniques et tumoraux ont produit des niveaux similaires d’alpha TNF. Assurez-vous que la tumeur est suffisamment hachée, et que tous les morceaux sont immergés dans les supports de digestion.Lors de la purée de la tumeur, assurez-vous d’être doux, et laver les cellules à travers bien. Le protocole de digestion tumorale peut être combiné avec le tri cellulaire assisté par flux, pour purifier les sous-ensembles individuels de cellules immunitaires pour une analyse supplémentaire, fonctionnelle ou d’expression génique. Nous avons utilisé cette méthode pour caractériser la façon dont les cellules B façonnent la réponse immunitaire pendant le cancer du pancréas, générant des tumeurs orthotopiques chez les souris à cellules B et les souris appauvries par cellules B.

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Cet article décrit la technique de stimulation ex vivo des lymphocytes T pour augmenter la concentration intracellulaire de cytokines telles que l’interféron-gamma ou l’IFN-gamma et le facteur de nécrose tumorale-alpha ou TNF-alpha dans le lymphocyte T. Ces cytokines interviennent dans une réponse antitumorale efficace et peuvent avoir un rôle thérapeutique dans la tumeur.

Stimulation ex vivo des lymphocytes T dans la tumeur pancréatique : une méthode pour augmenter la production de cytokines dans les lymphocytes T

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Une meilleure compréhension de la biologie du cancer du pancréas est critique nécessaire pour permettre le développement de meilleures options thérapeutiques pour traiter le cancer du pancréas. Pour répondre à ce besoin, nous démontrons un modèle orthotopique de cancer du pancréas qui permet une surveillance non invasive de la progression du cancer à...

Modèle Orthotopique bioluminescente la progression du cancer du pancréas

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Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

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Implantation orthotopique guidée par ultrasons de l'adénocarcinome ductal pancréatique murine

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Un modèle murin de résection orthotopique du cancer du pancréas

Ici, nous présentons un protocole de transplantation tumorale pour la caractérisation des lymphocytes infiltrés tumoraux inhérents à la tumeur et dérivés de la périphérie dans un modèle tumoral murin. Le traçage spécifique de l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur avec cytométrie en flux révèle la dynamique des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules au cours des réponses immunitaires antitumorales.

Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris

Ce protocole décrit la préparation de cultures en tranches organotypiques (OTSC). Cette technique facilite la culture ex vivo de tissus multicellulaires intacts. Les OTSC peuvent être utilisés immédiatement pour tester leur réponse respective aux médicaments dans un environnement multicellulaire.

Cultures de coupes organotypiques en tant que modèles précliniques du microenvironnement tumoral dans le cancer du pancréas primitif et les métastases

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Génération d’une xénogreffe orthotopique de cellules cancéreuses du pancréas par injection guidée par ultrasons

Les allogreffes orthotopiques syngéniques de souris d’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) récapitulent la biologie, les phénotypes et les réponses thérapeutiques des sous-types de maladies. En raison de leur progression tumorale rapide et reproductible, ils sont largement utilisés dans les études précliniques. Ici, nous montrons des pratiques courantes pour générer ces modèles, en injectant des cultures PDAC murines syngéniques dans le pancréas.

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Nous décrivons une méthode permettant d’utiliser des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) de souris par cytométrie en flux pour le transfert de cellules adoptives. Ce protocole vise à vérifier la cytotoxicité spécifique des TIL contre les tumeurs dans un modèle murin syngénique de cancer du pancréas, fournissant ainsi des informations sur le développement de thérapies cellulaires adoptives pour le cancer du pancréas.

Isolement par cytométrie en flux et évaluation thérapeutique de lymphocytes infiltrant la tumeur dans un modèle murin de cancer du pancréas

Découvrez la génération de tumeurs pancréatiques orthotopiques et la caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes par cytométrie en flux. Cette méthode permet d'analyser les réponses immunitaires dans le cancer du pancréas.

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