Test de thérapies ciblées dans le cancer à l’aide de l’analyse structurale de l’altération de l’ADN et des Xénogreffes dérivées du patient

Le protocole décrit ici vise à démontrer un algorithme pour tester l’efficacité du traitement à l’aide de modèles de cancer in vivo. Le protocole se compose d’une combinaison de plusieurs techniques. Le bio-séquençage du génome entier des spécimens de tumeurs humaines est utilisé pour identifier les altérations génomiques.

Il s’agit à la fois de réarrangements génétiques et de changements de numéro de copie génétique. Ainsi, l’analyse des altérations identifiées est effectuée afin de sélectionner les changements potentiellement médicamentables. Les médicaments sélectionnés sur la base de l’analyse génomique sont ensuite utilisés pour le traitement in vivo des tumeurs correspondantes cultivées chez les souris immunocompromisées.

L’algorithme développé représente une approche prometteuse pour aider les décisions de traitement pour les soins aux patients atteints de cancer. Utilisez l’outil Panda ou un logiciel analogue pour identifier les modifications cibles. Nous pouvons énumérer les gènes qui ont été identifiés par microséquencing a résulté comme un fichier délimité simple onglet à l’aide de symboles génétiques acceptés standard.

Ajoutez le signe de livre à l’en-tête de la liste pour s’assurer que l’en-tête de table est transféré au niveau de voie U du logiciel. Téléchargez le fichier en cliquant sur l’onglet navigation correspondant. Attribuez une seule icône pour représenter les données sous-jacentes en cliquant sur l’icône de choix, puis en cliquant sur l’onglet finaliser.

Une fois les fichiers d’un patient téléchargés, prévisualisez la page pour identifier une colonne qui affiche le nombre de gènes annotés par voie. C’est la dernière colonne à droite. Utilisez un filtre de voie en haut à gauche de la fenêtre principale pour limiter le nombre de voies affichées à ceux qui contiennent les gènes d’intérêt.

Pour identifier les voies qui ont plus de gènes annotés que ce à qui on pourrait s’attendre par hasard, utilisez une fonction située sous l’onglet enrichissement. Une colonne est ensuite ajoutée au tableau principal qui affiche la valeur p correspondante du test exact d’un Fisher. Sélectionnez la base de données pour afficher les gènes pharmacables potentiels à partir de l’annotation prédéfinis en vérifiant une icône appropriée à gauche de la fenêtre principale.

Pour sélectionner une voie de visualisation, cliquez sur son nom affiché dans la page de visionneuse de voie. Les icônes représentant chaque ensemble d’annotation s’affichent à côté du gène associé. En cliquant sur n’importe quel gène de la voie ouvrira la page des cartes génétiques correspondantes.

Sélectionnez les voies qui ont montré des gènes annotés d’intérêt et frappe pour les médicaments potentiels pour une analyse plus approfondie. Effectuez le travail tissulaire dans une hotte d’écoulement laminaire pour maintenir des conditions stériles. Déposer le tissu tumoral dans un plat contenant du PBS froid ou des supports de culture tissulaire, tels que RPMI, DMEM, contenant des antibiotiques.

Identifier et isoler le matériel tumoral viable du tissu normal et nécrotique adjacent avec l’aide d’un pathologiste. Utilisez des forceps stériles et du scalpel pour enlever le matériel nécrotique souligné par un pathologiste. Pour effectuer l’engraftment sous-cutané, coupez le tissu tumoral avec des forceps stériles, du scalpel ou des ciseaux chirurgicaux en petits fragments, d’environ 2 x 2 x 2 millimètres de taille.

Transférer le tissu fragmenté dans une boîte de Pétri pré-réfrigérée sur la glace. Laissez le matrigel froid dans le plat avec le tissu fragmenté, environ 200 microlitres par 10 morceaux de tissu. Bien mélanger et laisser tremper les fragments de tissu dans le matrigel pendant 10 minutes.

Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles et des forceps pour faire une incision cutanée verticale de 5 à 10 millimètres sur les deux flancs d’une souris. Insérez doucement des forceps droits dans l’espace sous-cutané pour créer une poche suffisamment grande pour qu’un fragment tumoral soit placé sous la graisse. Utilisez des forceps droits stériles pour insérer des fragments de tumeur dans la poche précédemment préparée chez chacune des cinq souris.

Fermer l’incision cutanée à l’aide de colle tissulaire. Après implantation, pour inhiber la prolifération des lymphocytes, injecter à chaque souris 100 microlitres de rituximab. Préparez la souris au gavage oral en pinçant la peau du dos et en la pliant vers l’arrière afin que la tête et les lèvres de la souris soient immobilisées.

Insérez la sonde de gavage à l’arrière de la gorge de la souris jusqu’à ce que la sonde atteigne l’œsophage. Assurez-vous que la sonde n’est pas insérée trop loin que les poumons de la souris peuvent perforer causant la mort. Le flotteur représentatif du génome illustre le paysage des changements génomiques dans une tumeur.

Typique pour les tumeurs de séroubtype de haut grade, les lignes bleues multiples de gains et les lignes rouges de pertes, ont été identifiées indiquant des niveaux élevés d’instabilité génomique. L’altération supérieure de tendance pour l’intervention thérapeutique dans la tumeur d’OC101 était une amplification au chromosome 17, impliquant ERBB2, un gène qui code pour le récepteur HER2. Pour valider les résultats au niveau de l’ADN, plusieurs ensembles d’amorce spécifiques ont été conçus pour les bords de la région amplifiée.

Et PCR a été réalisé. Aucun produit d’amplification n’a été absorbé quand l’ADN humain de contrôle a été employé. Des bandes spécifiques ont été identifiées pour l’ADN de tumeur d’OC101.

Dans une autre tumeur variante, T14, de nombreux gains d’ADN ont été observés. Ceux-ci comprenaient AKT2 dans les gènes RICTOR. La validation effectuée au niveau des protéines, à l’aide de l’immunoblotting a montré des niveaux élevés d’AKT dans RICTOR.

Une réduction significative de la charge de tumeur a été observée dans le groupe traité de chimiothérapie à la fin de la semaine six. Il y avait un avantage supplémentaire au-dessus de la chimiothérapie seule dans les groupes qui ont reçu un traitement combiné. Le tissu de tumeur a été rassemblé pour l’analyse moléculaire de la réponse de traitement à la fin de l’essai de traitement.

Les niveaux totaux et phosphorylatés de S6, D’AKT, et de mTOR ont été déterminés utilisant l’immunoblotting. La comparaison des niveaux de ces protéines dans un traitement, chimiothérapie-traité, et traité avec l’inhibiteur d’AKT ou de mTOR a montré une diminution marquée pour les deux derniers. L’approche présentée est très utile pour mener l’essai clinique dans les modèles PDX.

Il tire parti des caractéristiques moléculaires de la tumeur obtenues par le profilage génomique pour déterminer le meilleur choix de médicaments pour le test.