Name: Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Découvrez une méthode rapide et économique pour analyser la population latérale dans les lignées de cellules tumorales solides. Cette technique permet d'isoler les cellules souches cancéreuses et d'étudier leurs propriétés de stemness.

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Ce travail a été financé par la Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 et 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Université de Nankai 63191153.

1. Préparation cellulaire
<ol><li>Digestion cellulaire et neutralisation<ol>
<li>Graines de cellules tumorales (telles que les cellules MDA-MB-231) dans une plaque à 6 puits, et les culturez dans un incubateur à 37 °C alimenté à 5% deCO2.</li>
		<li>Récoltez des cellules lorsque leur densité atteint environ 90%. Aspirer soigneusement le milieu de culture et laver les cellules 2x avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). REMARQUE: Pour examiner les effets des inhibiteurs de la voie de signalisation (par exemple, l’inhibiteur FRA1) ou des activateurs (par exemple, l’activateur STAT3) sur les caractéristiques de stemness des cellules tumorales, les cellules tumorales sont ensemencées dans une plaque de 6 puits et prétraitées avec des inhibiteurs ou des activateurs pendant un certain temps avant la récolte.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % à chaque puits de la plaque à 6 puits, placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 1 à 3 minutes (min) et taper doucement la plaque pour détacher les cellules. REMARQUE: Une digestion prolongée affectera le profil SP en raison de changements dans la viabilité cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 3 mL de PBS complétés par 2% de sérum fœtal bovin (FBS) à chaque puits de la plaque de 6 puits pour terminer la digestion et pipeter doucement les cellules de haut en bas 3-5x pour disperser les amas cellulaires.</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de suspension cellulaire à un puits d’une nouvelle plaque de 6 puits et l’examiner au microscope. Si des amas cellulaires sont observés, passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μM. Remarque : Il s’agit d’une étape facultative.</li>
		<li>Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Cellules centrifugeuses à 200 x g pendant 5 min aux cellules de granulés. Retirez le surnageant et ressuscitez-les dans 3 mL de PBS complétés par 2% FBS. Pipettez les cellules de haut en bas 3 à 5x pour bien mélanger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nombre de cellules<ol>
<li>Ajouter 50 μL de la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugation de 1,5 mL et le mélanger avec une solution de bleu trypan de 50 μL. Pipetter 10 μL du mélange pour compter le nombre de cellules vivantes en utilisant une méthode standard, telle qu’un hémocytomètre.</li>
		<li>Diluez les cellules dans PBS complété avec 2% FBS à une concentration finale de 1 x 106 cells/mL. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire à un tube à essai rond en polystyrène de 5 mL et préparer deux tubes échantillons.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coloration cellulaire avec Hoechst 33342
<ol><li>Ajouter Hoechst 33342 à un tube pour atteindre une concentration finale appropriée. NOTA : Par exemple, la concentration appropriée de Hoechst 33342 est de 3 μg/mL pour les cellules MDA-MB-231.</li>
	<li>Ajouter un bloqueur (p. ex. fumitrémorgine C, Vérapamil ou Réserpine) à un autre tube à une concentration finale appropriée et incuber le tube à 37 °C pendant 30 min avant d’ajouter la même concentration de Hoechst 33342 que celle décrite à l’étape 2.1. REMARQUE : Pour les cellules MDA-MB-231, le bloqueur approprié est la réserpine (40 μM). Reserpine est utilisé comme contrôle bloquant pour vérifier l’absence de cellules dans la zone SP fermée.</li>
	<li>Préparez plusieurs tubes contenant des cellules et ajoutez Hoechst 33342 à différents gradients de concentration. Après un test de cytométrie en flux, choisissez la concentration appropriée en fonction du profil et de la proportion de SP. REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative utilisée pour définir la concentration appropriée de Hoechst 33342.</li>
	<li>Préparer plusieurs tubes contenant des cellules, ajouter le bloqueur à différents gradients de concentration, incuber les tubes à 37 °C pendant 30 min, puis ajouter Hoechst 33342 à une concentration appropriée. Après l’essai de cytométrie de flux, choisissez la concentration appropriée en fonction de l’absence de cellules dans la zone SP fermée. Remarque : Il s’agit d’une étape facultative utilisée pour définir la concentration appropriée du bloqueur.</li>
	<li>Placez les tubes dans un incubateur à 37 °C et incuber pendant 60 min, en secouant les tubes toutes les 10 minutes. REMARQUE: Secouer soigneusement les tubes est important pour la coloration, car il assure un contact complet entre les cellules et le colorant pour de meilleurs résultats de coloration.</li>
	<li>Après l’incubation, centrifuger les cellules à 200 x g,4 °C pendant 5 min, et aspirer soigneusement le surnageant, car les cellules forment des pastilles très lâches et instables.</li>
	<li>Ressuscitez les cellules de chaque tube dans 1 mL de PBS glacé complété par 2% de FBS et pipettez les cellules de haut en bas 3 à 5x pour bien mélanger. Ajouter 1 μL d’iodure de propidium (IP) à 1 mg/mL à la suspension de chaque tube pour identifier les cellules mortes. REMARQUE: Toutes les procédures de cette étape doivent être effectuées à 4 ° C pour inhiber l’efflux de Hoechst 33342 des cellules tumorales. Les tubes doivent être protégés contre toute exposition directe à la lumière.</li>
</ol>3. Analyse par cytométrie de flux
NOTA : Les instructions d’utilisation du logiciel du cytomètre de flux (voir la table des matériaux)sont décrites dans cette section et dans les figures supplémentaires 1 à 10.
<ol><li>Dans le logiciel du cytomètre de flux, cliquez sur le bouton DOSSIER. Cliquez sur le bouton Experiment (Expérience), puis sur New Experiment (Figure supplémentaire 1A,B).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton OK. « Experiment_001 » apparaîtra sous le DOSSIER (Figure supplémentaire 2A,B).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Experiment_001 pour remplacer le nom du dossier par un nom spécifique (par exemple, « 20191118-SP »). Cliquez sur Entrée. Le nouveau nom (« 20191118-SP ») apparaîtra sous DOSSIER (Figure supplémentaire 3A,B).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Nouveau spécimen pour ajouter un spécimen au nouveau dossier d’expérience (« 20191118-SP »). Cliquez sur le bouton Nouveau tube pour ajouter un tube à l’échantillon. Cliquez sur le bouton Flèche (Figure supplémentaire 4A-C).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Parameters (Paramètres) et configurez les paramètres du cytomètre de flux(Figure supplémentaire 5).<ol>
<li>Utilisez un miroir dichroïque de 610 nm à passage court (DMSP) pour séparer les longueurs d’onde d’émission. Utilisez un filtre BP de 450/20 nm pour collecter la fluorescence bleue et un EFLP de 675 nm pour collecter la fluorescence rouge. REMARQUE: Hoechst 33342 est excité avec un laser UV à 355 nm et PI est excité à 488 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez les échantillons de cellules sur le cytomètre de flux. REMARQUE: Les cellules SP peuvent être triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) dans des conditions stériles. Un total de 100 000 à 500 000 cellules devrait être recueilli pour les expériences de suivi.<ol><li>Exécuter des cellules colorées avec Hoechst 33342 sur le cytomètre de flux.<ol>
<li>Placer des tubes contenant des cellules colorées avec Hoechst 33342 sur le cytomètre.</li>
			<li>Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, puis cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe Y et définissez-le sur "PI-A« . Affichez le diagramme à points de la zone d’impulsion de diffusion vers l’avant (FSC-A, axe X défini en mode linéaire) par rapport à la fluorescence PI (axe Y défini sur l’échelle logarithmique). Ajustez les tensions pour afficher les cellules vivantes dans le côté droit et les cellules non vivantes, qui sont brillamment colorées avec PI, dans le coin supérieur gauche. Ensuite, établissez une porte polygonale pour exclure les cellules mortes et les débris cellulaires(Figure 1A)en cliquant sur le bouton Porte polygonale pour griller le sous-ensemble P1, également connu sous le nom de sous-ensemble FSC-A, PI-A(Figure supplémentaire 6A,B).</li>
			<li>Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "FSC-W« . Affichez le diagramme à points de FSC-A (axe X) par rapport à la largeur d’impulsion de diffusion vers l’avant (FSC-W, axe Y). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, cliquez sur le bouton P1 sous le bouton Afficher les populations. Cliquez sur le bouton Grille rectangulaire pour créer une porte rectangulaire pour griller le sous-ensemble P2 (également appelé sous-ensemble FSC-A, FSC-W). Cela exclura les cellules avec de grands volumes(figure supplémentaire 7A-C et figure 1A).</li>
			<li>Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "SSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "SSC-W« . Affichez le diagramme à points de la zone d’impulsion de diffusion latérale (SSC-A, axe X) par rapport à la largeur d’impulsion de diffusion latérale (SSC-W, axe Y). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, puis cliquez sur le bouton P2 sous le bouton Afficher les populations. Cliquez ensuite sur le bouton Grille rectangulaire pour créer une porte rectangulaire pour griller le sous-ensemble P3 (également connu sous le nom de sous-ensemble SSC-A, SSC-W). On obtiendra ainsi une population cellulaire avec une granularité uniforme(figure supplémentaire 8A-C et figure 1A).</li>
			<li>Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur" Hoechst Red-A« ; cliquez sur l’axe Y et réglez-le sur "Hoechst Blue-A« . Affichez le diagramme à points de Hoechst Red-A (axe des X) par rapport à Hoechst Blue-A (axe des Y). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, cliquez sur le bouton P3 sous le bouton Afficher les populations. Cliquez sur le bouton Polygon Gate pour créer une porte polygonale pour gater le sous-ensemble P4 (également appelé sous-ensemble Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, cliquez sur le bouton Afficher la hiérarchie de population pour afficher la hiérarchie de population. REMARQUE : Le diagramme à points montrera trois populations différentes : 1) une population en phase G0-G1 près du centre du graphique; 2) une population en phase S-G2/M près du coin supérieur droit; 3) le SP. Le SP est ensuite activé pour une analyse plus approfondie(figure supplémentaire 9A-D et figure 1A). Si le diagramme à points de Hoechst Red-A par rapport à Hoechst Blue-A ne montre pas un profil sp similaire à celui illustré à la figure 1A,les tensions doivent être ajustées jusqu’à ce qu’un profil similaire soit vu. Pendant ce temps, ajustez toutes les portes ci-dessus en conséquence.</li>
			<li>Après avoir déterminé la région de porte des cellules SP, cliquez sur Acquérir des données pour collecter 20 000 à 100 000 événements de chaque échantillon afin d’analyser le pourcentage de cellules SP(Figure supplémentaire 10).</li>
		</ol></li>
		<li>Exécutez les cellules colorées hoechst 33342 traitées avec un bloqueur sur le cytomètre de flux.<ol>
<li>Placez des tubes contenant un bloqueur sur le cytomètre et faites fonctionner les cellules en utilisant les mêmes tensions et portes pour vérifier si les tensions et les portes sont sélectionnées de manière appropriée. REMARQUE: Par rapport à la coloration Hoechst 33342 seule, seule une très faible proportion de cellules, le cas échéant, devrait apparaître dans la zone fermée du SP(Figure 1B).</li>
			<li>Collectez 20 000 à 100 000 événements de chaque échantillon pour analyser le pourcentage de cellules SP.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse des données
NOTA : Les instructions d’utilisation du logiciel d’analyse de cytométrie en flux (voir la table des matériaux)sont décrites dans cette section et dans les figures supplémentaires 11à16.
<ol><li>Copiez les fichiers au format fcs sur un ordinateur, ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et faites glisser un fichier d’échantillon vers le logiciel(Figure supplémentaire 11A,B).
</li>
	<li>Cellules de porte et obtenir le pourcentage de cellules SP.<ol>
<li>Double-cliquez sur cet exemple de fichier, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe Y et définissez-le sur "PI-A« . Ensuite, créez une porte polygonale et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble FSC-A, PI-A(Figure supplémentaire 12A-E).</li>
		<li>Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble FSC-A, PI-A, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "FSC-W« . Ensuite, créez une porte rectangulaire et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble FSC-A, FSC-W(Figure supplémentaire 13A-E).</li>
		<li>Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble FSC-A, FSC-W, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "SSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "SSC-W« . Ensuite, créez une porte rectangulaire et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble SSC-A, SSC-W(Figure supplémentaire 14A-E).</li>
		<li>Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble SSC-A, SSC-W, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "Hoechst Red-A« ; cliquez sur l’axe Y et réglez-le sur "Hoechst Blue-A« . Ensuite, créez une porte polygonale et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A(Figure supplémentaire 15A-E).</li>
		<li>Ouvrez l’Éditeur de mise en page en cliquant sur le bouton Ouvrir l’éditeur de mise en page. Faites glisser le fichier de sous-ensemble SSC-A, SSC-W vers l’Éditeur de mise en page, puis cliquez sur le bouton Cliquez pour enregistrer la fenêtre de mise en page dans un fichier pour enregistrer les résultats del’image (Figure supplémentaire 16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrez l’espace de travail pour conserver les informations de contrôle lors de la fermeture du logiciel.</li>
	<li>Effectuez des analyses de test t avec un logiciel d’analyse statistique pour comparer la différence entre deux groupes. Une valeur de P < 0,05 a été définie comme statistiquement significative.</li>
</ol>

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<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+minor+groove-binding+ligands%3A+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il y a plusieurs points clés à garder à l’esprit pour le test SP. Le premier est la sélection d’un bloqueur approprié, tel que Vérapamil ou Réserpine, pour chaque lignée cellulaire, car l’emplacement « porte » des cellules SP est déterminé en fonction de la position à laquelle un grand nombre de cellules SP disparaissent après l’ajout du bloqueur. Pour la lignée cellulaire MDA-MB-231, Reserpine fonctionne bien. Cependant, pour d’autres lignées cellulaires, différents bloqueurs peuvent mieux fonctionner.
<p class="jov...

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont des sous-ensembles de cellules ayant une capacité d’autore renouvellement et un potentiel de différenciation multiple, qui jouent un rôle essentiel dans la croissance tumorale, les métastases et la récurrence1,2. Actuellement, les CSC ont été identifiés comme existant dans une variété de tumeurs malignes, y compris les cancers du poumon, du cerveau, du pancréas, de la prostate, du sein et du foie3,4,5,6,7,8,9. L’identification de CSCs dans ces tumeurs est principalement basée sur la présence des protéines de marqueur de surface, telles que l’expression haute et/ou basse de CD44, CD24, CD133, etSca-1 9,10,mais un marqueur unique qui peut distinguer CSCs de non-CSCs n’a pas été rapporté jusqu’ici. Actuellement, plusieurs techniques sont employées pour identifier et purifier des CSC dans le tissu tumoral ou les variétés de cellule tumorales. Ces techniques sont conçues en fonction des propriétés spécifiques des CSC. Parmi eux, les tests et le tri des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées.
Les cellules SP ont été découvertes à l’origine par Goodell et al.11,lorsqu’ils ont caractérisé les cellules souches hématopoïétiques dans les cellules de la moelle osseuse de la souris. Quand les cellules de moelle de souris ont été étiquetées avec le colorant fluorescent Hoechst 33342, un petit groupe de cellules de Hoechst 33342 faiblement-souillées est apparu dans le diagramme bidimensionnel de point d’une analyse cytometry d’écoulement. Hoechst 33342 est un colorant liant l’ADN et a au moins deux modes de liaison qui conduisent à des caractéristiques spectrales différentes. Lors de la visualisation de l’émission de fluorescence à deux longueurs d’onde en même temps, plusieurs populations peuvent être révélées12. Dans leur test, le Hoechst 33342 a été excité à 350 nm et la fluorescence a été mesurée à l’aide du filtre passe-bande (BP) de 450/20 nm et du filtre de bord de 675 nm passe-long (EFLP)11. Par rapport à toute la population de cellules de moelle osseuse, ce groupe de cellules a été enrichi en cellules souches hématopoïétiques appelées cellules SP11. Les cellules SP sont capables d’expulser rapidement Hoechst 33342. L’efflux de ce colorant est apparenté aux transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC)13,qui peuvent être inhibés par certains agents tels que la fumitrémorgineC14,le vérapamil et la réserpine15,16. Après cela, différentes proportions de cellules SP ont été détectées dans une variété de tissus, d’organes, de tissus tumoraux et de lignées cellulairestumorales 17,18,19. Ces cellules SP présentent de nombreuses caractéristiques des cellules souches17,19.
Ce manuscrit décrit le étiquetage et la coloration de Hoechst 33342 des cellules tumorales cultivées et l’analyse des cellules SP par cytométrie en flux. D’ailleurs, l’optimisation de la concentration de Hoechst 33342 et la sélection appropriée de bloqueur pour une variété de cellule spécifique de tumeur utilisant cette approche sont montrées. Enfin, les effets des signaux de promotion ou d’inhibition de stemness sur la proportion de SP dans les cellules tumorales sont démontrés. Les exemples expérimentaux démontrent que l’analyse du SP peut être employée pour explorer les effets de divers signaux, tels que l’expression de gène, les petits inhibiteurs, les activateurs, les cytokines, et les chemokines, sur le stemness de tumeur. Par rapport à d’autres méthodes d’isolement et de purification des CSC, telles que le tri de cd44+/CD24– population, l’analyse de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et les tests de formation de sphère tumorale, cette méthode est plus facile à manipuler et est rentable.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture cellulaire 6 puits</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9,5 cm2 (env.)</td></tr><tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal (FBS)</td><td>Biological Industries (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre</td><td>en flux BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRFortessa</td></tr><tr><td>Logiciel de cytométrie en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse par cytométrie en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimide H 33342 trichlorhydrate</td></tr><tr><td>Tube à essai à fond rond en polystyrène</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td>12 x 75 mm, 5 mL</td></tr><tr><td>Propidium iodure (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td></tr><tr><td>Reserpine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td>(3&beta ;, 16&beta ;, 17&alpha ;, 18&beta ;, 20&alpha ;)-11,17-Diméthoxy-18-[(3,4,5-triméthoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylique</td></tr><tr><td>SKLB816</td><td>Fourni par le Dr Shengyong Yang, Université</td><td></td><td></td>du Sichuan</tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de vérapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>5-[N-(3,4-Diméthoxyphényléthyl)méthylamino]
chlorhydrate de -2-(3,4-diméthoxyphényl)-2-isopropylvaléronitrine</td></tr></tbody></table>

analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une cause importante de croissance, de métastase, et de répétition de tumeur. L’isolement et l’identification de CSCs sont d’une grande importance pour la recherche de tumeur. Actuellement, plusieurs techniques sont utilisées pour l’identification et la purification des CSC à partir de tissus tumoraux et de lignées cellulaires tumorales. La séparation et l’analyse des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées. Les méthodes reposent sur la capacité des CSC à expulser rapidement les colorants fluorescents, tels que Hoechst 33342. L’efflux du colorant est associé aux transporteurs de cassette de liaison à l’ATP (ABC) et peut être inhibé par des inhibiteurs du transporteur ABC. Des méthodes pour souter les cellules cultivées de tumeur avec Hoechst 33342 et analyser la proportion de leurs cellules de SP par cytometry d’écoulement sont décrites. Ce test est pratique, rapide et rentable. Les données générées dans ce test peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.

Quatre analyses expérimentales de SP ont été exécutées selon cette méthode. Dans le premier, nous avons détecté la proportion de cellules de SP dans MDA-MB-231, qui est une variété de cellule humaine triple négative de cancer du sein, dans des conditions normales. Après comptage cellulaire, Hoechst 33342 a été ajouté dans un tube contenant 1 x 106 cellules à une concentration finale de 3 μg/mL. La réserpine et le hoechst 33342 ont été ajoutés à un autre tube à des concentrations finales de 40 μM et de 3 μg/mL,...

Une méthode pratique, rapide, et rentable pour mesurer la proportion de cellules de population latérale dans les variétés de cellule pleines de tumeur est présentée.

Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

L’analyse des cellules secondaires de la population est l’une des méthodes couramment utilisées pour isoler et identifier les cellules souches cancéreuses des tissus tumoraux et des lignées cellulaires tumorales. Ce test est pratique, rapide et rentable. Cette méthode peut contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.De nombreux facteurs peuvent influencer le pourcentage de cellules SP dans cette analyse, il est donc essentiel d’explorer les conditions appropriées avant l’expérience formelle. Ensemencez des cellules tumorales dans une plaque de six puits et incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius alimenté en dioxyde de carbone à 5%. Lorsque la densité cellulaire atteint environ 90%, aspirez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec trois millilitres de PBS.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de 0,25% trypsine-EDTA à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une à trois minutes. Appuyez doucement sur la plaque pour détacher les cellules, ajoutez trois millilitres de PBS complétés par 2% fbs à chaque puits, et pipettez les cellules de haut en bas trois à cinq fois pour disperser les amas cellulaires. Examinez la suspension cellulaire au microscope.Si des touffes cellulaires sont présentes, passez la suspension à travers une passoire de 70 micromètres. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ressuscitez les cellules dans trois millilitres de PBS complétés par 2% FBS, en canalisant les cellules de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger.Comptez les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre et diluez-les dans du PBS complété par 2% de FPS jusqu’à une concentration finale d’une fois 10 à six cellules par millilitre. Préparez deux tubes à essai à fond rond en polystyrène de cinq millilitres et ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire à chaque tube. Étiquetez un tube comme un tube à essai et l’autre comme un tube de commande de bloqueur.Préparer une solution de bloqueur en la diluant à la concentration appropriée. Ajoutez-le au tube de commande du bloqueur et mélangez bien, puis incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Agiter le tube toutes les 10 minutes.Préparer une solution de Hoechst 33342 en la diluant à la concentration appropriée. Ajoutez-le au tube à essai et au tube de commande du bloqueur séparément et mélangez bien, puis incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Agiter les tubes toutes les 10 minutes.Après l’incubation, centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 200 fois g et quatre degrés Celsius, puis aspirer soigneusement le surnageant. Ressuscitez les cellules dans chaque tube avec un millilitre de PBS glacé complété par 2% FBS, puis pipettez les cellules de haut en bas pour mélanger. Ajouter un microlitre d’iodure de propidium d’un milligramme par millilitre, ou PI, à chaque tube et mélanger.Cliquez sur l’onglet Paramètres dans le logiciel du cytomètre de flux. Tout d’abord, choisissez les paramètres de FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red et PI, respectivement. Ensuite, choisissez l’échelle logarithmique pour le paramètre PI.Enfin, choisissez des échelles de surface et de largeur pour les paramètres FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red et PI, respectivement. Exécutez d’abord les cellules du tube à essai, puis exécutez les cellules du tube de commande du bloqueur en utilisant les mêmes tensions et portes. Collectez 20 à 100 000 événements de chaque échantillon pour analyser le pourcentage de cellules SP.Cette méthode a été employée pour détecter la proportion de cellules de SP dans la variété de cellule humaine de cancer du sein MDA-MB-231. Le diagramme à points de FSC-A par rapport à PI-A a montré une population de cellules mortes, de débris cellulaires et la population principale de cellules pi négatives, qui a été soumise à une analyse plus approfondie. Une population unicellulaire fermée à partir du diagramme à points de FSC-A par rapport à FSC-W et le diagramme à points de SSC-A contre SSC-W a été utilisé pour analyser la proportion de cellules SP, qui était d’environ 0,9% dans les cellules non traitées et d’environ 0,09% dans les cellules traitées par réserpine.Différentes concentrations de souillure de Hoechst 33342 ont été examinées sur les cellules MDA-MB-435, et on l’a déterminé que deux microgrammes par millilitre étaient optimaux pour l’analyse de PS. Les basses concentrations ont rendu difficile de distinguer des cellules de SP d’autres populations, tandis que des concentrations élevées ont fait disparaître des cellules de SP. Le vérapamil et le reserpine ont été examinés pour déterminer le bloqueur approprié pour les cellules MDA-MB-435.Environ 0,4% de cellules ont expulsé le colorant après traitement de vérapamil, mais le rapport a chuté à environ 0,1% après traitement de reserpine, démontrant que le reserpine est un bloqueur plus approprié pour cette variété de cellule. Ce protocole a également été employé pour déterminer la proportion de cellules de SP dans les cellules humaines d’adénocarcinome de poumon A549 traitées avec la colivelin d’activateur STAT3 et dans les cellules humaines de cancer du sein de T47D traitées avec l’inhibiteur FRA1 SKLB816. Ce test fournit des indices sur l’effet régulateur des voies de signalisation sur les caractéristiques des cellules souches cancéreuses et facilite la découverte de nouveaux mécanismes, qui peuvent finalement guider le traitement ciblé des tumeurs.

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Le protocole suivant décrit une méthode permettant d’isoler la population latérale de cellules tumorales de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T (LAL-T), composée de cellules souches, à partir d’un poisson-zèbre adulte. La population latérale manque de marqueurs cellulaires proéminents et nous utilisons donc le test d’efflux de colorant Hoechst 33342 pour les isoler.

Dosage de la population latérale : une méthode pour isoler une population latérale de cellules tumorales du poisson-zèbre

Dans cette vidéo, nous décrivons l’isolement d’une sous-population de cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de carcinome épidermoïde de la tête et du cou à l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence ou FACS. La population latérale isolée de cellules peut être utilisée pour une analyse plus poussée en aval.

Essai de discrimination de la population du côté cancéreux : une méthode pour isoler des cellules souches cancéreuses à l’aide d’un test d’efflux de colorant de Hoechst

Des analyses approfondies des protéomes de cellules cancéreuses facilitent l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses et de biomarqueurs diagnostiques. Nous décrivons un flux de travail expérimental pour l’analyse quantitative des (phospho-)protéomes dans des sous-populations de cellules cancéreuses dérivées de tumeurs liquides et solides. Ceci est réalisé en combinant des stratégies d’enrichissement cellulaire avec la spectrométrie de masse quantitative basée sur Super-SILAC.

Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

Comprendre le rôle des cellules souches cancéreuses dans la récidive tumorale et la résistance aux thérapies est devenu un sujet de grand intérêt au cours de la dernière décennie. Cet article décrit l’isolement et la caractérisation de la sous-population de cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires de carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC).

Isolement et caractérisation d&#39;une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

Les méthodes permettant la caractérisation et l'isolement des populations de cellules souches à partir d'échantillons biologiques sont essentielles pour l'avancement des traitements ciblés par les cellules souches dans le cancer et au-delà. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches du cancer en utilisant le phénotype de la population latérale déclenchée par le colorant.

Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l&#39;ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons biologiques

Nous décrivons ici une technique pour isoler les cellules de la population de côté d'un modèle de poisson zèbre leucémie aiguë lymphoblastique T myc induite (T-ALL). Ce test de population côté est très sensible et est décrit pour T-ALL zebrafish, mais il peut être applicable à d'autres types de cellules malignes et non zebrafish malignes.

L&#39;isolement de la population latérale dans la leucémie lymphoblastique aiguë de cellules T induite par Myc dans le poisson zèbre

Nous avons développé un nouveau protocole pour étudier la dynamique de la population hétéro-cellulaire en réponse à des perturbations. Ce manuscrit décrit une plate-forme basée sur l'imagerie qui produit des jeux de données quantitatifs pour la caractérisation simultanée de multiples phénotypes cellulaires de populations hétéro-cellulaires de manière robuste.

Discrimination et caractérisation des populations hétéro-cellulaires à l&#39;aide de techniques d&#39;imagerie quantitative

Nous décrivons ici une méthode pour séparer et enrichir les composants du microenvironnement tumoral immunitaire et non immuns dans les tumeurs sous-cutanées établies. Cette technique permet l’analyse distincte d’infiltrat immunitaire de tumeur et fractions de tumeur non immuns qui peuvent permettre la caractérisation complète du microenvironnement immunitaire de la tumeur.

Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis

La caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) est un sujet populaire dans la recherche translationnelle. Ce protocole décrit un test semi-automatique d'immunofluorescence (IF) pour la caractérisation de PD-L1 et l'énumération des CTC dans les échantillons patients de cancer de poumon de non-petite cellule (NSCLC).

Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Ici, nous montrons que les lasers haute puissance de 375 nm et 405 nm peuvent exciter efficacement Hoechst 33342 et servir d’alternative viable au laser 355 nm pour la détection de cellules de population latérale (SP), élargissant ainsi la gamme de lasers disponibles dans les applications de cytométrie en flux.

Détection efficace des cellules de la population du côté de Hoechst par cytométrie en flux

Découvrez une méthode rapide et économique pour analyser la population latérale dans les lignées de cellules tumorales solides. Cette technique permet d'isoler les cellules souches cancéreuses et d'étudier leurs propriétés de stemness.

Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

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