Name: Préparation des propagations méiotiques de chromosome des spermatocytes de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez la préparation de chromosomes méiotiques de spermatocytes de Danio rerio par étalement nucléaire. Cette méthode permet de visualiser l'architecture chromosomique en prophase I par microscopie super-résolution.

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Nous remercions Trent Newman et Masuda Sharifi pour leurs commentaires sur le manuscrit et An Nguyen pour avoir aidé à optimiser les méthodes de propagation et de coloration des chromosomes des méiocytes de poissons zèbres. Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM079115 attribué à S.M.B.

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li>
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<li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li>
<li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+recombination+in+human+males%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li>
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<li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li>
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<li>Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+by+breaking+and+repairing%3A+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Journal%22%5BJournal%5D)">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li>
<li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li>
<li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).</li>
<li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+chiasmata+and+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li>
<li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li>
<li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Ici nous décrivons des méthodes pour sonder l’emplacement des télomères et des protéines chromosome-associées dans les écarts de surface nucléaire des spermatocytes isolés des testicules de poisson zèbre. Nous nous attendons à ce que ces méthodes soient applicables pour l’analyse des spermatozoïdes chez d’autres espèces de téléostéos avec ajustement à la taille du testicule.
Alors que seulement quelques anticorps ont été élevés aux protéines méiotiques de poisson zèbre, nous avons eu du succès...

La reproduction sexuelle se poursuit par la combinaison de deux gamètes haploïdes, chacun portant la moitié du complément chromosomique d’une cellule somatique. La méiose est une division cellulaire spécialisée qui produit des gamètes haploïdes à travers une série de réplication de l’ADN et deux cycles successifs de ségrégation chromosomique. Dans la prophase I, les chromosomes homologues (homologs) doivent subir l’appariement, la recombinaison et la synapse, ce dernier étant caractérisé par la formation du complexe synaptonemal qui comprend deux axes homologués pontés par le filament transversal, Sycp1 (Figure 1A,B). Le défaut d’exécuter correctement ces processus peut conduire à la production de gamètes aneuploid, qui sont une cause principale de fausses couches chez l’homme1. Notre connaissance de la coordination entre l’appariement, la recombinaison et la synapse a été facilitée par des études dans un large éventail d’organismes, tels que la levure, C. elegans, la souris, et la drosophile, entre autres2. Tandis que le processus général de l’appariement homologue de chromosome suivi de la ségrégation est bien conservé, sa dépendance à la recombinaison et à la synapse et l’ordre de ces événements varie.
La formation de rupture à double brin méiotique (DSB), qui initie une recombinaison homologue, se produit près des télomères regroupés dans le bouquet pendant le leptotene et la synapse s’ensuit peu après3,4. Cette configuration de la formation de l’ASD et de l’initiation à la synapse est également une caractéristique de la méiose masculine chez l’homme, mais pas chez la souris5,6,7,8, suggérant que le poisson zèbre peut servir de modèle pour la spermatogénèse humaine. Il y a également plusieurs avantages pratiques d’étudier la méiose de poisson zèbre. Les mâles et les femelles subissent la gamétogenèse tout au long de l’âge adulte, leurs gonades sont facilement accessibles, et des centaines de descendants sont générés à partir d’une seule croix. En outre, les embryons sont transparents et se développent à l’extérieur, ce qui facilite la détection précoce des aberrations dans le développement embryonnaire en raison de gamètes aneuploides3,9. Les inconvénients de l’utilisation du poisson zèbre sont qu’ils sont lents à atteindre la maturité sexuelle (environ 60 jours) et la quantité de matière nécessaire pour les écarts de surface nucléaire doit être recueillie à partir d’animaux adultes de 10 à 20, selon leur taille.
Les préparations de propagation de chromosome méiotique sont un outil essentiel pour étudier la dynamique de chromosome à travers tous les organismes modèles, puisque les signatures clés de la dynamique méiotique de chromosome peuvent être sondées. Chez le poisson zèbre, les aspects clés de la progression du programme méiotique et de l’organisation nucléaire ont été disséqués par le biais de l’enquête sur les propagations de surface nucléaire, appelées ici les propagations chromosomiques, avec des anticorps pour la détection d’immunofluorescence des protéines et/ou des acides nucléiques par FISH3,4,9,10,11,12. En effet, la localisation polarisée des télomères groupés dans le bouquet peut être préservée dans la préparation de la propagation (Figure 1C). Récemment, nous avons utilisé des propagations du chromosome spermatocyte du poisson zèbre ainsi que des méthodes de détection de fluorescence et de microscopie à super résolution pour élucider la progression détaillée de la dynamique des télomères du poisson zèbre, de l’appariement chromosomique homologue, de la localisation des ruptures à double brin et de la synapse lors des transitions méiotiques clés3. Ici nous présentons des méthodes pour préparer des écarts de chromosome des spermatocytes des testicules de poisson zèbre et par la suite les tacher avec des sondes fluorescentes d’acide nucléique de peptide (PNA) aux séquences répétées de telomere et à la détection d’immunofluorescence des protéines associées de chromosome.

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger de 1,5 mL</td><td>Plusieurs marques commerciales disponibles</td> Support de tubes de microcentrifugation de <td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Plusieurs marques commerciales disponibles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 % de formaldéhyde, sans méthanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2 mL</td><td>Plusieurs marques commerciales disponibles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre de 24 x 50 mm</td><td>Corning</td><td>2980-245</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 mm verrelamelles</td><td>VWR International</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>363696</td><td></td></tr><tr><td>Sac autoclave</td><td>Plusieurs marques commerciales disponibles</td><td></td><td>Utilisé pour fabriquer des lamelles en plastique.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td>Préparer une solution mère de 100 mg/ml dans de l’eau distillée stérile.</td></tr><tr><td>Crépine cellulaire, 100 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CF405M chèvre anti-poulet IgY (H+L), hautement adsorbé</td><td>croisé Biotium</td><td>203775-500uL</td><td>Utilisation à 1:1000</td></tr><tr><td>Poulet anti-zfSycp1</td><td>Généré par le laboratoire Burgess</td><td>N/A</td><td>Utilisation à 1:100</td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Coplin pot</td><td>Plusieurs marques commerciales disponibles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I, grade II à partir du pancréas bovin</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10014CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>Deux sont nécessaires pour disséquer les testicules.</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf, 5 mL</td><td>VWR International</td><td>89429-308</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire IgY (H+L) anti-poulet pour chèvre, Alexa Fluor 488 ThermoFisher</td><td></td><td>Scientific A-11039</td><td>Utilisation à 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire IgY (H+L) anti-poulet pour chèvre, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11042</td><td>Utilisation à 1:1000</td></tr><tr><td>Chèvre anti-hDMC1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8973</td><td>Ne fonctionne pas entre nos mains</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-lapin IgG (H+L) à adsorption croisée de chèvre, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Utilisation à 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire à adsorption croisée (H+L) anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11012</td> Utilisation <td>à 1:1000</td></tr><tr><td>Sérum</td> <td>de chèvreSigma-Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sel sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’humidité</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-3683</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>VWR International</td><td>230401V (Modèle 5420)</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Modèle Classic C25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimerbly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>Utilisé pour la chambre d’humidité</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Plusieurs marques commerciales disponibles</td><td></td><td>Tout microscope standard capable d’un grossissement d’au moins ~1,65X est suffisant.</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-hamsterSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Ne fonctionne pas dans nos mains</td></tr><tr><td>Souris anti-hMLH1</td><td>BD Biosciences</td><td>550838</td><td>Ne fonctionne pas dans nos mains</td></tr><tr><td>Souris anti-hRPA</td><td>Sigma-Alrich</td><td>MABE285</td><td>Ne fonctionne pas dans nos mains</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &middot ; 7 H2O</td><td>Fisher</td><td>Scientific S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Solution Photo-Flo 200</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert en plastique</td><td>Plusieurs marques commerciales disponibles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PNA TelC-Alexa647</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1013</td><td>Préparer selon le fabricant' .</td></tr><tr><td>PNA TelC-Cy3</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>Préparer selon les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Couche de montage anti-effacement ProLong Diamond</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>Couche anti-décoloration ProLong Diamond avec DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-hRPA</td><td>Bethyl</td><td>A300-244A</td><td>Utilisation à 1:300</td></tr><tr><td>Lapin anti-hSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab150292</td><td>Utilisation à 1:200</td></tr><tr><td>Lapin anti-hRad51</td><td>GeneTex</td><td>GTX100469</td><td>Utilisation à 1:300</td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Supercut, angle 30&deg ;, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-353</td><td>Peut également utiliser n’importe quelle paire de petits ciseaux.</td></tr><tr><td>Kit Sylgard</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9897184</td><td>Préparez selon les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Diluer dans de l’eau distillée stérile pour obtenir une solution de travail à 20 %. Conserver à température ambiante. Le Triton X-100 forme un précipité lorsqu’il est dilué dans l’eau ; Le précipité se dissout pendant la nuit.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LS003708</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de trypsine à partir du blanc d’œuf de poule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td>Diluer dans de l’eau distillée stérile pour obtenir une solution de travail à 20 %. Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas - 4 mm (micro ciseaux)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>15018-10</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des propagations méiotiques de chromosome des spermatocytes de poisson-zèbre

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

La méiose est le processus cellulaire clé nécessaire pour créer des gamètes haploïdes pour la reproduction sexuelle. Les organismes modèles ont joué un rôle déterminant dans la compréhension des événements chromosomiques qui ont lieu pendant la prophase méiotique, y compris les événements d’appariement, de synapse et de recombinaison qui assurent une ségrégation chromosomique appropriée. Bien que la souris ait été un modèle important pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus, tous les événements méiotiques de ce système ne sont pas analogues à la méiose humaine. Nous avons récemment démontré le potentiel passionnant du poisson zèbre comme modèle de spermatogénèse humaine. Ici nous décrivons, en détail, nos méthodes pour visualiser les chromosomes méiotiques et les protéines associées dans les préparations de propagation de chromosome. Ces préparations ont l’avantage de permettre l’analyse à haute résolution des structures chromosomiques. Tout d’abord, nous décrivons la procédure pour disséquer des testicules du poisson zèbre adulte, suivi de la dissociation cellulaire, de la lyse, et de la diffusion des chromosomes. Ensuite, nous décrivons la procédure pour détecter la localisation des protéines méiotiques de chromosome, par détection d’immunofluorescence, et séquences d’acide nucléique, par hybridation in situ de fluorescence (FISH). Ces techniques constituent un ensemble utile d’outils pour l’analyse cytologique de l’architecture de la chromatine méiotique dans le système de poisson zèbre. Les chercheurs de la communauté des poissons zèbres devraient être en mesure de maîtriser rapidement ces techniques et de les intégrer dans leurs analyses standard de la fonction reproductrice.

Nous avons décrit une méthode pour préparer et visualiser les préparations de propagation de spermatocyte salèbre. Lorsqu’elle est exécutée correctement, notre procédure donne des noyaux bien répartis et non superposés. Pour récupérer de tels noyaux, il est important d’avoir la quantité appropriée de matériel de démarrage (c.-à-d. les testicules), traiter les testicules pour une durée suffisante dans la trypsine et un nombre suffisant de traitements DNase I. Ces tartinades peuvent ensuite...

Les écarts de surface nucléaires sont un outil indispensable pour étudier les événements chromosomiques pendant la méiose. Ici nous démontrons une méthode pour préparer et visualiser des chromosomes méiotiques pendant la prophase I des spermatocytes de poisson zèbre.

Préparation des propagations méiotiques de chromosome des spermatocytes de poisson-zèbre

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish émerge comme un excellent modèle vertébré pour étudier les événements chromosomiques de la méiose, y compris l’appariement des chromosomes homologues, la synapse et la recombinaison. Ce protocole de propagation de surface nucléaire nous a permis de visualiser les caractéristiques clés de l’architecture chromosomique méiotique à l’aide d’une microscopie à super résolution. Les chercheurs peuvent s’attendre à des centaines de noyaux bien répandus par toboggan avec moins de débris que les autres protocoles de propagation du poisson zèbre.La partie la plus difficile techniquement de cette procédure est la dissection des testicules de poisson zèbre car il est à proximité de la peau et est également attaché à d’autres organes. La visualisation de la procédure de dissection permettra aux chercheurs de savoir à quoi s’attendre lorsqu’ils verront la gonad encastrée dans le tissu de l’animal. Après avoir euthanasié le poisson zèbre mâle, décapiter un poisson à la fois avec de petits ciseaux, puis utiliser des micro ciseaux pour couper le long de la ligne médiane ventrale pour exposer la cavité corporelle.Placer le poisson dans une boîte de Pétri recouverte de silicone et couvrir d’

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Génétique

C'est une méthode pour générer des embryons de poisson zèbre gynogénétiques diploïde (embryons dont la seule contribution génétique vient de la mère) en bloquant la seconde division méiotique immédiatement après la fécondation avec la lumière ultraviolette inactivé sperme. EP embryons ne sont pas entièrement homozygotes due à la recombinaison lors de la première division méiotique, cependant elles sont homozygotes à tous les loci qui n'ont pas été séparés de leur centromère par recombinaison.

Faire Zebrafish diploïdes gynogénétiques par Pression Early

Un protocole est décrit pour la préparation de disséminations de chromosomes végétaux mitotiques de haute qualité par une méthode de largage rapide à sec à l’air adaptée à la détection FISH de sondes d’ADN à copie unique et à copie élevée.

Un air sec Chromosome Dropping rapide Méthode de préparation adéquate pour les poissons dans les usines

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Un protocole modifié pour la manipulation ploïdie utilise un choc thermique pour induire un décrochage d'un cycle cytokinèse dans l'embryon précoce. Ce protocole est mise en évidence chez le poisson zèbre, mais il peut être applicable à d'autres espèces.

Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

La méiose est le processus de développement par lequel les gamètes sont constituées par une seule tournée de réplication de l’ADN et de deux cycles successifs de la ségrégation des chromosomes. La méiose chez les mammifères peut être examinée en utilisant une technique pour préparer les tartinades méiotique. Ici, nous démontrons une méthode de préparation des étalements de noyaux de spermatocytes de souris.

Préparation des chromosomes à la méiose se propage de Spermatocytes de souris

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.

Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.

Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

Ici, nous présentons une méthode simple pour séparer les cellules folliculaires et les ovocytes dans les follicules ovariens de poisson zèbre, qui facilitera des investigations du développement ovarien dans le poisson zèbre.

Séparation des cellules folliculaires et des ovocytes dans les follicules ovariens du poisson zèbre

Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

Les erreurs méiotiques dans les synapses et la recombinaison sont courantes chez les ovocytes de mammifères. Une analyse rigoureuse des protéines impliquées dans ces processus est essentielle pour comprendre comment et pourquoi l’ovogenèse tourne souvent mal. Les techniques présentées ici permettent un suivi complet de la recombinaison et des synapses pour évaluer la qualité des ovocytes chez la souris.

Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison

Découvrez la préparation de chromosomes méiotiques de spermatocytes de Danio rerio par étalement nucléaire. Cette méthode permet de visualiser l'architecture chromosomique en prophase I par microscopie super-résolution.

Préparation des propagations méiotiques de chromosome des spermatocytes de poisson-zèbre

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