Name: Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Préparation pour létude fonctionnelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Apprenez à isoler des artérioles et capillaires hippocampiques chez la souris pour étudier la signalisation vasculaire ex vivo par myographie de pression et immunofluorescence. Cette méthode élimine les effets hors cible des tissus environnants.

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Les auteurs tient à remercier Jules Morin pour ses commentaires perspicaces sur le manuscrit. Cette recherche a été financée par des prix de l'organisme à but non lucratif CADASIL Together We Have Hope, du Center for Women's Health and Research et du NHLBI R01HL136636 (FD).

Toutes les expériences ont été approuvées par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université du Colorado, Anschutz Medical Campus et ont été effectuées selon les directives des National Institutes of Health.
1. Solutions
<ol><li>Utilisez la saline tamponnée MOPS pour la dissection et pour conserver les échantillons à 4 oC avant leur utilisation. Ne pas gazer la solution. Préparer moPS tamponné saline avec composition suivante: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glucose, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM pyruvate, 10 mg/mL sérique albumin, pH 7,3 à 4 oC.</li>
	<li>Utilisez le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) comme solution de bain et de pipette. Gaz aCSF et Ca 2 -aCSF libre avec 5% CO2, 20% O2, et N2 solde. Préparer la solution avec la composition suivante: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM glucose, 2 mM CaCl2, pH 7,3 (avec aération avec 5% CO2, 20% O2, et N2 équilibre).</li>
	<li>Obtenir la dilatation maximale en nominalement Ca2-free aCSF (0 mM [Ca2 '] o, 5 mM EGTA).</li>
</ol>2. Préparation de chambre d'organe
<ol><li>Insérer des capillaires en verre borosilicate (diamètre extérieur de 1,2 mm; diamètre intérieur à 0,69 mm; longueur de 10 cm) dans un tire-verre. Tirez le capillaire pour faire une pointe longue et mince à une extrémité.</li>
	<li>D'un côté de la chambre, ajoutez une canule qui peut se connecter à une pompe péristtaltique miniature pour pressuriser le navire. Sous un microscope de dissection, casser la pointe de la canule de sorte qu'il soit assez petit pour s'adapter au récipient d'intérêt, mais assez grand pour permettre aux solutions de circuler à travers la pointe. Assurez-vous que la pointe a un diamètre d'environ 10 à 15 m.</li>
	<li>Remplissez la canule à l'aide d'une seringue à l'aide d'un filtre de 0,22 m attaché avec de l'aCSF oxygéné. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air ou de débris dans la canule.</li>
	<li>Ajouter deux autres canules de l'autre côté de la chambre. Ne cassez pas leurs pourboires.</li>
</ol>3. Dissection et isolement d'Hippocampe
<ol><li>Euthanasier et décapiter une souris. Pour cette expérience, utilisez une souris C57BL6/J de 8 semaines pour comparer les différences entre les mâles et les femelles. Injecter la souris avec du pentobarbital et décapiter avec des ciseaux chirurgicaux.</li>
	<li>À l'aide de petits ciseaux de dissection, couper la peau le long de la ligne médiane au sommet de sa tête. Déplacez la peau sur les côtés.</li>
	<li>À partir du côté caudal du crâne, couper le crâne le long de la ligne médiane jusqu'à ce que les ampoules olfactives sont atteints. Enlever les parties du crâne jusqu'à ce que le cerveau soit exposé.</li>
	<li>Enlevez lentement le cerveau, en commençant près du nez de la souris. Séparez le cerveau des ampoules olfactives, des nerfs crâniens et de la moelle épinière en coupant à travers les structures avec les petits ciseaux de dissection.</li>
	<li>Placez le cerveau dans une plaque de dissection avec une solution MOPS suffisante pour le submerger complètement. À l'aide d'un microscope à dissection, placez le cerveau au centre de la plaque de dissection avec le côté ventral vers le bas.</li>
	<li>À l'aide d'une lame de rasoir, couper le cerveau en deux le long de la fissure longitudinale. Maintenez la lame de sorte que le bord tranchant soit parallèle au fond de la plaque de dissection. Appuyez la lame à travers le cerveau d'un seul coup. Déplacer un hémisphère sur le côté de la plaque.</li>
	<li>Effectuez les étapes suivantes pour chaque hémisphère séparément ou en parallèle.<ol>
<li>Placez un hémisphère au centre de la plaque de sorte que la ligne médiane est orientée vers le bas. Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour couper le long de la fissure transversale pour enlever le cervelet et le tronc cérébral. Poussez la lame directement à travers le tissu.</li>
		<li>Faites pivoter l'hémisphère de sorte que le côté médial soit orienté vers le haut (Figure 1A). Utilisez une spatule pour maintenir le cerveau en place. À l'aide d'une deuxième spatule, insérez la pointe sous le corpus callosum et pellez en dessous pour enlever le thalamus, le septum et l'hypothalamus, couvrant l'hippocampe (figure 1B).</li>
		<li>Assurez-vous que l'hippocampe est maintenant visible sous forme de structure incurvée près du côté postérieur du cerveau. À l'aide d'une spatule pour maintenir le cerveau en place, utiliser la deuxième spatule pour extraire l'hippocampe du cerveau (Figure 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer l'hippocampe dans une nouvelle plaque de dissection remplie à mi-chemin de la solution MOPS. Jetez le reste du cerveau.</li>
</ol>4. Isolement artériole hippocampal
<ol><li>Complétez les étapes suivantes pour chaque hippocampe.<ol>
<li>Épinglez l'un des hippocampi à l'aide de petites broches à chaque extrémité de la section. L'artère hippocampique est orientée vers le haut.</li>
		<li>À l'aide de forceps très pointus, étirer délicatement de petites sections de l'hippocampe. Cela va desserrer le tissu entourant les artérioles, ce qui rend plus facile de les disséquer.</li>
		<li>Rechercher à travers le tissu hippocampique dorsal pour identifier l'artère transversale externe (Figure 1C)16,27.</li>
		<li>Saisissez doucement l'artère transversale externe et éloignez-la lentement du tissu pour recueillir les artérioles et les capillaires perfusant la région CA3 de l'hippocampe.</li>
		<li>Une fois qu'il n'y a plus de vaisseaux à enlever du tissu, jetez l'hippocampe. Gardez les navires sur la glace dans des plaques pendant qu'ils ne sont pas utilisés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hippocampal capillaire-parenchymal arteriole cannulation
<ol><li>Trouvez une artériole avec une branche qui se termine par des capillaires. Transférez-le à la chambre d'orgue. Assurez-vous que l'artériole est d'environ 15-30 m lorsqu'il est complètement dilaté (Figure 1D).</li>
	<li>Montez soigneusement le vaisseau sanguin en poussant la pointe de la canule à travers la paroi artériole en dessous de la zone cible. Faites glisser soigneusement le récipient sur la canule jusqu'à ce qu'il y ait assez de tissu pour placer la cravate.</li>
	<li>Faire un noeud lâche avec 12-0 sutures en nylon de sorte qu'il s'adapte sur le vaisseau sanguin et la canule. Utilisez un demi-noeud pour fixer les liens. Puis tirez les extrémités pour serrer le noeud et fixer l'artériole à la canule. Retirez toutes les branches de navire extra-terrestres sous la cravate en les tirant doucement avec des forceps.</li>
	<li>Faites une autre cravate et fixez-la à l'autre extrémité de l'artériole pour la sceller.</li>
	<li>Baisser la canule avec le récipient attaché jusqu'à ce qu'elle soit plate contre la glissière de couverture au fond de la chambre. Veillez à ne pas abaisser la canule trop ou il se cassera.</li>
	<li>À l'aide d'une canule de l'autre côté de la chambre, abaissez-la de sorte que le point de celui-ci épingle la cravate à l'extrémité de l'artériole.</li>
	<li>Utilisez la troisième canule pour épingler la branche capillaire à la couverture. Placez la pointe près de l'extrémité de la branche tout en laissant les extrémités des capillaires exposés (pas sous la canule).</li>
</ol>6. Myographie de pression
<ol><li>Déplacez la chambre de la portée de dissection au microscope avec le logiciel d'enregistrement.</li>
	<li>Connectez l'entrée et le tube d'écoulement à la chambre pour la perfusion. Démarrer la perfusion avec un aCSF chauffé (37 oC) à un débit de 4 ml/min.</li>
	<li>Fixez la canule pressurisante à une pompe péristaltique jumelée à un transducteur de pression et amenez la pression interne à 20 mm Hg.</li>
	<li>Démarrez le logiciel d'enregistrement. Ajustez les réglages du microscope et de l'imagerie pour obtenir l'image la plus claire possible. Commencez l'enregistrement une fois que les paramètres sont optimisés pour le logiciel de détection.</li>
	<li>Augmentez la pression du navire jusqu'à 40 mm Hg tout en enregistrant le diamètre artériel avec un logiciel de détection des bords.</li>
	<li>Laisser la solution MOPS de 15 à 20 min pour laver la solution MOPS de la chambre avec aCSF, et laisser la préparation HiCaPA pour équilibrer et développer le ton myogénique.</li>
	<li>Pour vérifier la viabilité d'un navire, appliquez une solution NS309 de 1 M À la perfusion du bain (voir la figure 2A,B et la section Résultats représentatifs). Le segment artériolaire doit se dilater, démontrant environ 30-40% de tonalité myogène comme précédemment décrit3,14,20.</li>
</ol>7. Stimulation focale des extrémités capillaires
<ol><li>Une fois que le ton de base pour l'artériole a été établi et la fonction endothéliale évaluée, testez la réponse de la stimulation capillaire.</li>
	<li>À l'aide d'un tire-lait en verre, faire des canules afin qu'il y ait un point fin à une extrémité. Briser la pointe d'une canule de sorte que le médicament testé peut circuler à travers la pointe en douceur à 5 psi.</li>
	<li>Remplissez la canule avec la solution médicamenteuse d'intérêt et ajoutez-la à un micromanipulateur à 3 axes attaché au microscope. Connectez le tube du système d'éjection de pression à la canule.</li>
	<li>Abaissez lentement la canule dans le bain près des capillaires, en prenant soin de ne pas heurter une partie du navire ou du matériel dans la chambre. Manœuvrer la pointe de la canule à côté des extrémités des capillaires sans les toucher. Gardez la pointe de la canule juste à l'écart de la glissière de couverture pour empêcher le navire d'être stimulé si la canule fuit.</li>
	<li>Lorsque vous êtes prêt à stimuler les capillaires, abaisser la canule à la couverture et juste à côté des capillaires. Activer le système d'éjection de pression avec le temps d'éjection souhaité (ici 20 s). Une fois la stimulation terminée, soulevez légèrement la canule pour éviter une stimulation supplémentaire.</li>
	<li>Répétez la stimulation au besoin. Modifier la canule du système d'éjection de pression pour tester différents composés médicamenteux.</li>
	<li>Pour confirmer que seuls les capillaires sont stimulés, remplissez la canule d'une solution NS309 de 1 M et répétez les étapes ci-dessus. REMARQUE : Les cellules endothéliales capillaires n'expriment pas les canaux Ket Activés par NS309, de sorte que l'artériole ne doit pas répondre à la stimulation. Si l'artériole se dilate, la canule devra être repositionnée ou le diamètre du trou devra être plus petit (voir la figure 2A,B et la section Résultats représentatifs).</li>
</ol>

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<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La préparation sous pression HiCaPA (artériole capillaire-parenchymale hippocampal) décrite dans le présent manuscrit est une extension de notre procédure bien établie pour isoler, pressuriser et étudier les artérioles parchymales29. Nous avons récemment rapporté que les canaux Kir2.1 dans les cellules endothéliales capillaires du cerveau sentent des augmentations dans [K'] o associés à l'activation neurale, et génèrent un signal hyperpolarisant ascendant qui dilate les artér...

La circulation piale à la surface du cerveau a fait l'objet de nombreuses études, en partie en raison de son accessibilité expérimentale. Cependant, la topologie de la vascularisation cérébrale crée des régions distinctes. Contrairement au solide réseau pial riche en anastomoses avec une capacité substantielle pour rediriger le flux sanguin, les artérioles parenchymales intracérébrales (PA) présentent un approvisionnement collatéral limité, chacun d'eux perfusant un volume discret de tissu nerveux1,2. Cela crée un effet de goulot d'étranglement sur le flux sanguin qui, combiné avec des caractéristiques physiologiques uniques3,4,5,6,7,8, fait artérioles intracérébrales un site crucial pour le flux sanguin cérébral (CBF) régulation9,10. Malgré les défis techniques inhérents à l'isolement et à l'annulation des AP, la dernière décennie a vu un intérêt accru pour les études fonctionnelles ex vivo à l'aide de navires pressurisés11,12,13,14,15,16,17. Une des raisons de cet intérêt accru est l'effort considérable de recherche mené sur le couplage neurovasculaire (NVC), le mécanisme soutenant l'hyperémie fonctionnelle de cerveau18.
À l'échelle régionale, le CBF peut augmenter rapidement après l'activation neuronale locale19. Les mécanismes cellulaires et les propriétés de signalisation contrôlant NVC sont incomplètement compris. Cependant, nous avons identifié un rôle précédemment imprévu pour les capillaires de cerveau pendant NVC en sensibilisant l'activité neurale et en la traduisant dans un signal électrique hyperpolarisant pour dilater les artérioles en amont20,21,22. Potentield d'action23,24 et l'ouverture des canaux de grande conductance Ca2-activéK(BK) sur les pieds d'extrémité astrocytiques25,26 augmentent la concentration interstitielle d'ions de potassium [K-]o, qui a comme conséquence l'activation des canaux intérieurs forts de rectifier K(Kir) dans l'endothelium vasculaire des capillaires. Ce canal est activé park externe mais aussi par hyperpolarisation elle-même. Se propageant à travers les jonctions d'écart, le courant hyperpolarisant se régénère alors dans les cellules endothéliales capillaires adjacentes jusqu'à l'artériole, où il provoque la relaxation de myocyte et l'augmentation de CBF20,21. L'étude de ce mécanisme nous a menés à développer une préparation pressurisée d'artériole capillaire-parenchymal (CaPA) pour mesurer le diamètre artériolar pendant la stimulation capillaire avec des agents vasoactifs. La préparation de CaPA est composée d'un segment d'artériole intracérébrale cannulated avec une ramification capillaire intacte et en aval. Les extrémités capillaires sont comprimées contre le fond de verre de la chambre par une micropipette, qui occludes et stabilise toute la formation vasculaire20,21.
Nous avons précédemment fait des innovations instrumentales en imagerie des préparations CaPA à partir du cortex de souris20,21 et les artérioles du rat amygdale13 et hippocampe16,17. Comme la vascularisation hippocampal reçoit plus d'attention en raison de sa susceptibilité aux conditions pathologiques, ici nous fournissons une méthode étape par étape pour la préparation de CaPA de l'hippocampe de souris (HiCaPA) qui peut non seulement être employée dans les études fonctionnelles de NVC mais également dans la biologie moléculaire, l'immunochimie, et l'électrophysiologie.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m Filtres pour seringues</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 Nylon (12cm) Noir</td><td>Microsurgery Instruments, Inc</td><td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur automatique de température</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté D.E. : 1,2 mm, D.I. : 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &mdash ; Pompe complète avec entraînement et tête de pompe MS/CA 4-12</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EGTA Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-eau en ligne</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade ; Miltex&commerce ; Pince à tissus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133</td><td>chlorhydrate Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - Systèmes de distribution par micro-injection intracellulaire, 2 canaux</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Servocontrôleur de pression avec pompe péristaltique</td><td>Systèmes vivants</td><td></td> Instrumentation PS-200 <td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>Pince super fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette vertical</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole préparation pour l'étude fonctionnelle

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Des altérations comportementales subtiles à la démence de phase tardive, l'affaiblissement cognitif vasculaire se développe typiquement suivant l'ischémie cérébrale. L'aVC et l'arrêt cardiaque sont des maladies dimorphiques remarquablement sexuellement, et les deux induisent l'ischémie cérébrale. Cependant, les progrès dans la compréhension de l'affaiblissement cognitif vasculaire, et puis développant des traitements sex-spécifiques, ont été en partie limités par des défis en étudiant la microcirculation de cerveau des modèles de souris dans les études fonctionnelles. Ici, nous présentons une approche pour examiner la signalisation capillaire-à-arteriole dans un artériole capillaire-parenchymal ex vivo (HiCaPA) préparation du cerveau de souris. Nous décrivons comment isoler, canuler, et pressuriser la microcirculation pour mesurer le diamètre artériolaire en réponse à la stimulation capillaire. Nous montrons quels contrôles fonctionnels appropriés peuvent être utilisés pour valider l'intégrité de préparation HiCaPA et afficher des résultats typiques, y compris l'essai de potassium comme agent de couplage neurovasculaire et l'effet de l'inhibiteur récemment caractérisé de la famille de canaux de potassium rectifiant s'intériorisent Kir2, ML133. En outre, nous comparons les réponses dans les préparations obtenues des souris mâles et femelles. Bien que ces données reflètent des études fonctionnelles, notre approche peut également être utilisée dans les études de biologie moléculaire, d'immunochimie et d'électrophysiologie.

Les canaux endothélial de petite conductance (SK) et de conduite intermédiaire (IK) Ca2'sensiblesK', exercent une influence dilatoire sur le diamètre des AP. L'application de bain de 1 M NS309, un agoniste synthétique de canal IK et SK, a causé la dilatation presque maximale (figure 2A,B). Cependant, les cellules endothéliales capillaires manquent de canaux IK et SK et n'ont pas hyperpolarisé en réponse à NS309<sup class...

Le présent manuscrit détaille comment isoler les artérioles et les capillaires hippocampiques du cerveau de la souris et comment les pressuriser pour la myographie sous pression, l'immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Préparation pour l'étude fonctionnelle

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Notre méthode permet l’étude des vaisseaux sanguins situés dans des structures qui seraient autrement difficiles à imager à Vivo, comme l’hippocampe. Puisque les vaisseaux sanguins sont enlevés du tissu cérébral, la signalisation entre les capillaires et l’artériole peut être étudiée sans effets hors cible sur le tissu environnant. Pour isoler l’hippocampe, utilisez de petits ciseaux de dissection pour couper la peau le long de la ligne médiane en haut de la tête de la souris et déplacer la peau sur les côtés.À partir du côté caudal du crâne, couper le crâne le long de la ligne médiane jusqu’à ce que les bulbes olfactifs sont atteints et enlever des parties du crâne jusqu’à ce que le cerveau soit exposé. À partir du nez de la souris, retirez lentement le cerveau, en utilisant les ciseaux pour couper à travers les bulbes olfactifs, les nerfs crâniens et la moelle épinière. Submergez le cerveau, côté ventral vers le bas dans mops tamponné saline, au centre d’une plaque de dissection, et placez la plaque sous un microscope de dissection.En tenant le bord tranchant parallèle au fond du plat, utilisez la lame de rasoir pour couper le cerveau en deux le long de la fissure longitudinale en un seul coup. Placez un hémisphère au centre de la plaque avec la ligne médiane orientée vers le bas et poussez la lame de rasoir directement à travers le tissu le long de la fissure transversale pour enlever le cervelet et le tronc cérébral. Faites pivoter l’hémisphère de sorte que le côté médial soit orienté vers le haut et utilisez une spatule pour maintenir le cerveau en place.Insérez la pointe d’une deuxième spatule sous le corpus callosum, en ramassant sous le tissu pour enlever le thalamus, le septum et l’hypothalamus de l’hippocampe. L’hippocampe doit maintenant être visible comme une structure incurvée près du côté postérieur du cerveau. À l’aide d’une spatule pour maintenir le cerveau en place, utilisez la deuxième spatule pour sortir l’hippocampe du cerveau.Ensuite, transférez l’hippocampe dans une nouvelle plaque de dissection, remplie à mi-chemin d’une nouvelle solution MOP. Pour l’isolement hippocampal d’artériole, placez de petites broches à chaque extrémité d’un hippocampe pour fixer le côté hippocampal d’échantillon vers le haut. À l’aide de forceps très tranchants, étirer délicatement de petites sections de l’hippocampe pour desserrer le tissu entourant les artérioles.Et fouiller dans les tissus hippocampaux dorsal pour identifier les artères transversales externes. Lorsque l’artère a été localisée, saisir l’artère transversale externe de l’hippocampe et lentement l’éloigner du tissu pour recueillir les artérioles et capillaires. L’artère de chaque hippocampe est enlevée séparément.Lorsqu’il n’y a plus de vaisseaux à enlever, placez les échantillons sur la glace et jetez le tissu hippocampal restant. Pour la cannulation des artérioles, localiser et artériole avec une branche qui se termine par des capillaires et placer l’artériole dans une chambre d’orgue. Poussez soigneusement la pointe de la canule à travers la paroi artériole sous la zone cible pour monter le vaisseau sanguin.Ensuite, glissez soigneusement le récipient sur la canule jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de tissu sur lequel placer la cravate. Utilisez des sutures en nylon 12-0 pour faire un nœud lâche qui s’adaptera au-dessus du vaisseau sanguin et de la canule, et utilisez un demi-nœud d’attelage pour fixer les traverses, tirez les extrémités pour serrer le noeud pour fixer l’artériole à la canule. Fixez une autre cravate à l’autre extrémité de l’artériole pour la sceller.De l’autre côté de la chambre, abaisser une deuxième canule jusqu’à ce que le point de la canule épingle la cravate à l’extrémité de l’artériole. Ensuite, utilisez une troisième canule pour épingler la branche capillaire à la couverture, en plaçant la pointe près de l’extrémité de la branche, tout en laissant les extrémités des capillaires exposés. Comme la microcirculation du cerveau est extrêmement fragile, assurez-vous de minimiser l’étirement et la manipulation des vaisseaux pendant la procédure de cannulation pour assurer la survie des artérioles.Pour l’analyse de la myographie sous pression, transférez la chambre à un stade de microscope léger avec un logiciel d’enregistrement et connectez le tube d’entrée et de sortie à la chambre pour profusion. Commencez la profusion avec 37 degrés Celsius Fluide céphalo-rachidien artificiel à une vitesse d’écoulement de quatre millilitres par minute, et fixez la canule de pression à la pompe périssaltique jumelée à un transducteur de pression. Apportez la pression interne à 20 millimètres de Mercure et démarrez le logiciel d’enregistrement.Ajustez le microscope et les paramètres de l’image pour obtenir l’image la plus claire possible. Et utilisez le logiciel Edge Detection pour vérifier que l’artériole mesure environ 15 à 30 micromètres de diamètre lorsqu’il est entièrement dilaté. Une fois les paramètres optimisés, commencez l’enregistrement et augmentez la pression intravasculaire dans le vaisseau jusqu’à 40 millimètres de Mercure, tout en enregistrant le diamètre de l’artériole avec le logiciel edge detection.Ensuite, profuse de la chambre pendant 15 à 20 minutes pour laver la solution MOP. Pour tester la viabilité du navire, appliquer une solution micromolaire NS309 à la profusion de bain, le segment artériole devrait se dilater, démontrant un ton myogénique de 30 à 40%. Une fois que le ton de base pour l’artériole a été établi, utilisez un tireur de verre pour faire des canules avec un point fin à une extrémité, et utilisez des forceps pour briser la pointe de chaque canule, de sorte que le médicament d’intérêt peut couler en douceur à travers la pointe à cinq livres de pression par pouce carré.Remplissez la canule avec le médicament d’intérêt. Et chargez la canule sur un micromanipulateur à trois axes fixé au microscope. Connectez le tube du système d’éjection de pression à la canule, et abaissez lentement la canule dans le bain près des capillaires, en prenant soin de ne frapper aucune partie du navire ou de la chambre.Pour stimuler les capillaires, abaissez la canule au coverslip juste à côté des capillaires et activez le système d’éjection de pression avec le temps d’éjection désiré. À la fin de la stimulation, augmenter légèrement la canule pour éviter d’autres stimulations. Pour confirmer que seuls les capillaires étaient stimulés, remplissez la nouvelle canule d’un micromolaire de la solution NS309 et stimulez les capillaires comme démontré.Obtenez ensuite la vasodilatation maximale en baignez la préparation avec la solution sans calcium. L’application de bain d’un micromolar NS309 cause une dilatation presque maximale de l’artériole due aux canaux potassium calcium-sensibles dans l’endothélium. Les cellules endothéliales capillaires, cependant, manquent de canaux de conductance intermédiaires et petits et ne hyperpolarisent pas en réponse à l’agoniste, par conséquent, stimuler les extrémités capillaires avec NS309, ne provoque pas de dilatation artériar en amont, ce qui indique que NS309 n’a pas atteint l’artériole, et peut être utilisé comme un contrôle pour accéder à la restriction spaciale du composé appliqué sur les capillaires par éjection de pression.Utilisant la préparation parenchyle parenchymale hippocampale d’arteriole comme démontré, l’application d’un fluide céphalo-rachidien artificiel complété avec le potassium de millimolar aux extrémités capillaires, a comme conséquence une dilatation artéririolaire en amont qui ne diffère pas entre les préparations des souris mâles et femelles. En outre, l’ajout de l’inhibiteur Kir2 ML 133, abolit pratiquement la dilatation artériole induite capillaire, en réponse à 10 millimolaires de potassium dans les préparations de souris mâles et femelles. Lors du montage de la véselle sanguine, limitez les interactions directes avec le vaisseau sanguin afin de minimiser les dommages et d’accroître la viabilité du vaisseau.Une fois que le vaisseau sanguin a été isolé, différents composés de drogue peuvent être examinés ou le vaisseau sanguin peut être davantage traité pour la biologie oléculaire, l’immunochimie, ou les études d’électrophysiologie.

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Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Cet article décrit une méthode par laquelle l’architecture vasculaire du cerveau peut être quantifiée à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo et ex vivo.

Quantification de l&#39;architecture vasculaire cérébral en utilisant la microscopie à deux photons dans un modèle de souris de la neuro-inflammation induite par le VIH

Ce manuscrit décrit un protocole simple et reproductible pour l’isolement des artérioles intracérébrales (un groupe de vaisseaux sanguins englobant les artérioles parenchymateuses, les artérioles pénétrantes et les artérioles précapillaires) chez la souris, à utiliser dans la myographie de pression, l’immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.

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Alors que l’imagerie multiphotonique n’est efficace qu’à des profondeurs limitées de la surface du tissu, il est possible d’obtenir une imagerie d’une résolution de 3 μm à n’importe quelle profondeur via pCLE. Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser une imagerie pCLE pour mesurer la dynamique microvasculaire dans l’hippocampe de souris ictales et de souris de type sauvage.

Endomicroscopie confocale préclinique à balayage laser couplée à des fibres in vivo (pCLE) des capillaires de l’hippocampe chez des souris éveillées

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

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Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

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Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.

Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe

La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca2+] et membranaire.

Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Le protocole fournit ici un échantillonnage dynamique détaillé en temps réel du liquide extracellulaire de l’hippocampe de rats éveillés à l’aide d’un système de microdialyse.

Collecte dynamique en temps réel de liquide extracellulaire hippocampique de rats conscients à l’aide d’un système de microdialyse

Apprenez à isoler des artérioles et capillaires hippocampiques chez la souris pour étudier la signalisation vasculaire ex vivo par myographie de pression et immunofluorescence. Cette méthode élimine les effets hors cible des tissus environnants.

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Préparation pour l'étude fonctionnelle

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