Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa
18 mars 2020
L’objectif global de ce protocole est d’instruire comment extraire, maintenir et dissocier les cellules astrocytes murines et microglies du système nerveux central, suivies d’une infection par des parasites protozoaires.
Ce protocole décrit une méthode qui est axée sur l’extraction en parallèle des deux populations de cellules gliales les plus abondantes, les astrocytes et les microglies, à partir de souris postnatales. Notre méthode diffère des autres protocoles précédemment décrits pour l’isolement des astrocytes et des microglies parce que nous nous concentrons sur l’obtention et l’isolement des deux types de cellules dans la même extraction à la même condition, optimisant ainsi l’utilisation d’animaux expérimentaux et améliorant l’étude des rôles relatifs pour ces cellules dans des contextes immunologiques. Ce protocole peut être utile pour mieux étudier les rôles des microglies et des astrocytes dans de nombreux contextes et maladies du système nerveux central tels que la maladie d’Alzheimer, Parkinson et les infections par exemple les parasites ou les virus protozoaires.
L’obtention et l’isolement des deux types de cellules à partir de la même extraction sont souhaitables pour évaluer le rôle comparatif de chaque cellule sous-ensemble contextes immunologiques tels que l’infection ou l’inflammation. Les gens devraient être prudents en particulier lors de l’ablation du cerveau et des lavages de tissus nerveux, mais je crois qu’avec ce protocole et la vidéo tournée, les gens ne lutteront pas. Ce protocole peut être long en fonction du nombre d’animaux pour extraire les cortices alors soyez prêt à passer environ quatre heures ou plus.
Le premier jour, préparez du HBSS pur et du HBSS plus 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Préparez le DMEM F12 complété et filtrez-le avec un filtre de 0,22 micron. Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave et utiliser 70% d’éthanol pendant l’intervention.
Mettez les souris nouveau-nées dans une chambre scellée contenant du coton imbibé d’isoflurane pendant cinq minutes pour une anesthésie profonde. Vaporiser le chiot de souris avec 70% d’éthanol et décapiter l’animal avec des ciseaux. Faire une coupe sagittale avec des ciseaux le long du crâne pour l’ouvrir et exposer le cerveau.
Retirez le cerveau à l’aide d’une micro spatule pour maintenir l’intégrité du cerveau. Placer le cerveau dans une boîte de Pétri sèche de six centimètres de diamètre. À l’aide d’une micro spatule, retirer l’ampoule olfactive et le cervelet.
Déplacez le cortex vers une autre boîte de Pétri contenant deux millilitres de HBSS plus 10%FBS. Couper le tissu cérébral en petits morceaux avec des ciseaux stériles et à l’aide d’une micropipette P1000, transférer chaque tissu cérébral avec HBSS plus 10%FBS à différents tubes coniques de 15 millilitres. Si nécessaire, utilisez HBSS plus 10%FBS pour remplir le volume final à deux millilitres.
Lavez le tissu cérébral coupé avec trois millilitres de HBSS plus 10%FBS pour chaque tube. Après la décantation, retirer soigneusement le surnatant. Répétez le lavage avec HBSS plus 10%FBS trois fois supplémentaires.
Puis laver avec trois millilitres de HBSS pur trois fois. Après la décantation, retirer soigneusement le surnatant. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine et placez le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant doucement les tubes toutes les cinq minutes.
Cela digère les tissus recueillis. Évitez les bulles. Pour inactiver la trypsine, lavez le tissu avec trois millilitres de HBSS plus 10%FBS et après décantation du tissu, retirez soigneusement le supernatant.
Répétez ce lavage trois fois. Ensuite, lavez le tissu avec trois millilitres de HBSS pur et répétez deux fois supplémentaires. Après décantation du tissu, retirer soigneusement le surnatant.
Ajouter sept millilitres de HBSS pur et homogénéiser le tissu à travers des passages successifs en pipettes, d’abord avec une pipette sérologique de 10 millilitres, suivie d’une pipette de cinq millilitres, et enfin avec une micropipette P1000. Après homogénéisation, centrifuger les tubes à 450 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille avec quatre millilitres de HBSS plus 10%FBS pour chaque tube.
Transférer les cellules dans un flacon T75 prétraité commercialement pour une adhérence optimale à la culture cellulaire. Placez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes pour l’observance. Ajoutez ensuite 10 millilitres de DMEM F12 complété au flacon et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux nuits.
Le troisième jour, retirez sept millilitres de milieu de culture du flacon T75 et ajoutez sept millilitres de DMEM F12 fraîchement complété. Remettre le flacon à l’incubateur. Le cinquième jour, pour enlever les débris et les cellules non adhérentes, échangez tout le milieu de la fiole T75 avec 14 millilitres de DMEM F12 fraîchement complété.
Puis toutes les 48 heures, retirer six millilitres du supernatant et ajouter sept millilitres de DMEM F12 frais complété moyen jusqu’au jour 14 de la culture. Le jour 14, après avoir enlevé six millilitres de supernatant et ajouté sept millilitres de milieu DMEM F12 frais complété, fermez les flacons T75 hermétiquement avec un emballage en plastique. Placez-les dans le shaker orbital de plancher à 200 RPM et 37 degrés Celsius pendant la nuit pour dissocier mécaniquement les microglies des astrocytes.
Le jour 15, prenez les flacons du shaker et lavez-les vigoureusement avec leur propre milieu afin d’optimiser la dissociation cellulaire et de récolter le nombre maximum de microglies. Puis recueillir le supernatant et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajouter quatre millilitres de trypsine à chaque flacon et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius afin de détacher les astrocytes.
Ajouter ensuite cinq millilitres de DMEM F12 complété pour inactiver la trypsine. Laver les flacons avec leur propre milieu et transférer le contenu dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse tous les tubes contenant des microglies ou des astrocytes dissociés à 450 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Jeter le surnatant. Resuspendez la pastille de microglie dans un millilitre de DMEM F12 complété et les astrocytes dans 10 millilitres de DMEM F12 complété. Procéder au comptage cellulaire dans une chambre Neubauer ou un compteur de cellules automatique.
Plaquez les cellules avec le DMEM F12 complété à la densité désirée dans une plaque plate prétraitée de culture de cellules de fond plat. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour leur permettre de s’attacher. Le 14ème jour, la culture glial de cellules a subi la dissociation mécanique.
Il a été observé avec une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies. Les astrocytes et les microglies des souris C57BL6 ont été infectés par T.cruzi Y.After deux heures, 48 heures, et 96 heures, les chambres ont été fixées avec le méthanol et tachées avec le marqueur de nucléase cellulaire DAPI et anti-GFAP. L’utilisation de parasites génétiquement modifiés exprimant des reporters fluorescents ou des parasites étiquetés avec des anticorps fluorescents spécifiques a amélioré la microscopie d’immunofluorescence puisqu’ils sont mieux distingués du noyau cellulaire.
Deux exemples sont présentés ici. La souche T.gondii RH exprimant constitutivement la souche YFP et T.cruzi Y tachée d’anticorps monoctone non commercial 2C2 anti-SSP4. Il est important de laver soigneusement les cellules pour ne pas perdre d’agrégats cellulaires.
Après l’infection de cellules gliales, d’autres paramètres peuvent être évalués tels que ELISA pour la production de cytokine présente dans le supernatant, ballonnement occidental pour l’expression de protéine, et PCR quantitatif en temps réel pour l’évaluation de transcription d’ARN. De nombreuses questions liées à la fonction des cellules gliales, par exemple leur métabolisme, leur réponse immunitaire et la biologie cellulaire elle-même peuvent être abordées et bénéficier de cette technique. Tous les parasites protozoaires sont capables d’infecter les cellules humaines ainsi que les cellules de souris de culture, il est donc important d’être prudent lors de la manipulation de ce parasite.
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Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé pour l'extraction, la culture et l'infection parallèles d'astrocytes et de microglies primaires murins à partir de cortices de souriceaux nouveau-nés. La méthode permet aux chercheurs d'obtenir les deux types de cellules gliales à partir d'une même extraction, facilitant ainsi des études comparatives de leurs rôles dans les infections du système nerveux central (SNC), notamment avec des parasites protozoaires tels que Trypanosoma cruzi et Toxoplasma gondii. Le protocole comprend des étapes d'isolement cellulaire, de maintien en culture, de phénotypage, d'infection et d'analyse des taux d'infection par microscopie à fluorescence.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroimmunologie
- Biologie cellulaire
- Parasitologie
Contexte
- Les astrocytes et les microglies sont les cellules gliales les plus abondantes dans le SNC, essentielles pour le soutien physiologique et l'homéostasie.
- Les deux types cellulaires jouent un rôle important dans la réponse immunitaire aux infections du SNC.
- Des méthodes améliorées d'isolement et d'étude de ces cellules sont nécessaires afin de mieux comprendre leurs réponses aux agents pathogènes.
- Les infections protozoaires, telles que celles provoquées par T. cruzi et T. gondii, peuvent avoir un impact significatif sur la fonction du SNC.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole reproductible et efficace pour l'extraction et la culture simultanées d'astrocytes et de microglies à partir de cortices de souris.
- Permettre des études comparatives des réponses des cellules gliales aux infections protozoaires.
- Faciliter les analyses en aval de la fonction des cellules gliales durant l'infection.
Méthodes utilisées
- Extraction des cortèxes de souriceaux en conditions stériles.
- Dissociation enzymatique et mécanique du tissu cérébral afin d'obtenir des suspensions monocellulaires.
- Culture in vitro de cellules gliales avec remplacement périodique du milieu pendant 14 jours.
- Dissociation mécanique pour séparer les microglies des astrocytes.
- Phénotypage des populations cellulaires par cytométrie en flux.
- Infection des cellules cultivées par les parasites T. cruzi et T. gondii.
- Évaluation des taux d'infection par microscopie à fluorescence à l'aide de parasites génétiquement modifiés ou marqués par anticorps.
Résultats principaux
- Le protocole permet d'obtenir des populations de haute pureté : environ 89,5 % d'astrocytes et 96,6 % de microglies.
- Les deux types cellulaires peuvent être efficacement infectés par des parasites protozoaires in vitro.
- La microscopie à fluorescence permet une visualisation claire et une quantification des taux d'infection à plusieurs points temporels.
- La méthode permet des analyses supplémentaires telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA), le Western blot et la qPCR pour des études fonctionnelles.
Conclusions
- Ce protocole offre une approche simple, rentable et efficace pour isoler et étudier les astrocytes et les microglies primaires de souris.
- Il permet une comparaison directe des réponses des cellules gliales aux infections du système nerveux central.
- La technique ouvre de nouvelles voies de recherche neuroimmunologique sur la fonction des cellules gliales durant l'infection et la maladie.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole permet aux équipes de recherche et développement en biopharmacie d'isoler simultanément des astrocytes primaires et des microglies à partir de cortices murins, facilitant ainsi l'analyse comparative des cellules gliales dans les modèles d'infection du système nerveux central. En optimisant l'utilisation des animaux et en proposant un protocole standardisé pour le phénotypage et l'infection, cette méthode améliore la validation des cibles thérapeutiques et la réduction des risques mécanistiques en neuroimmunologie et dans la recherche sur les maladies infectieuses. L'approche soutient les efforts de découverte précoce axés sur le contrôle des pathogènes par les cellules gliales et les interactions hôte-pathogène.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les réponses des cellules gliales aux protozoaires parasites comme T. cruzi et T. gondii afin de clarifier les mécanismes pathogènes des infections du système nerveux central.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle de cibles en permettant la comparaison directe des taux d'infection des astrocytes et des microglies ainsi que du contrôle du parasite.
- Fiabilité prédictive : Permet le criblage phénotypique des réponses immunitaires médiées par les cellules gliales afin de réduire les risques associés aux cibles dans les programmes de maladies neurodégénératives et infectieuses.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l'emploi pour les tests : Génère des populations purifiées de cellules gliales avec une pureté supérieure à 89 % pour les astrocytes et supérieure à 96 % pour les microglies, permettant des essais d'infection reproductibles.
- Résultats quantitatifs : Permet la quantification du taux d'infection par microscopie à fluorescence à plusieurs points temporels, pour une analyse dépendante de la dose et du temps.
- Extensibilité : Utilise du matériel et des réactifs standards de culture cellulaire, permettant une adaptation à des formats multi-puits pour le criblage de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Modèle pertinent pour les maladies : Fournit un modèle de cellules gliales murines pour étudier les infections protozoaires pertinentes pour le système nerveux central, avec une pertinence translationnelle pour les affections neuroinflammatoires humaines.
- Évaluation mécanistique des risques : Permet d'évaluer le rôle des cellules gliales dans l'élimination des agents pathogènes, soutenant ainsi la découverte de biomarqueurs et l'analyse des voies biologiques.
- Continuité préclinique : Permet un suivi longitudinal de l'infection de 2 à 96 heures, en alignement avec les fenêtres d'évaluation préclinique des candidats thérapeutiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte en fournissant des cellules gliales validées pour la modélisation des infections, le développement de tests et des études mécanistiques avant l'optimisation du composé candidat.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur les rôles spécifiques des cellules gliales dans l'invasion par des agents pathogènes et leur réplication au sein du système nerveux central.
- Tri : Fournit des cellules gliales standardisées et phénotypées, prêtes à être utilisées dans des essais d'infection avec des parasites marqués par fluorescence ou par anticorps.
- Analyse : Permet la mesure quantitative du taux d'infection par microscopie de fluorescence et l'analyse en aval de l'expression des cytokines, des protéines et de l'ARN.
- Recherche translationnelle : Relie les réponses des cellules gliales à l'infection à des mécanismes neuro-immunitaires plus larges, pertinents pour les modèles précliniques de maladies.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable d'isolement de cellules gliales applicable à divers programmes sur les maladies virales, parasitaires et neurodégénératives.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la fonction des cellules gliales pendant l'infection en permettant une comparaison directe des astrocytes et des microglies provenant du même animal.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à un protocole d'extraction unifié qui minimise la variabilité interindividuelle entre animaux.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données prédictives précoces sur le contrôle du pathogène par les cellules gliales dans les modèles d'infection du système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur la réactivité des cellules gliales face à une infection protozoaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en dissection tissulaire aseptique, digestion enzymatique et techniques de dissociation mécanique.
- Dépend de l'accès à des centrifugeuses, des incubateurs, des agitateurs rotatifs et à une microscopie à fluorescence pour la détection des infections.
- Nécessite une standardisation des changements de milieu, des étapes de lavage et du moment de la dissociation mécanique entre les lots afin d'obtenir des rendements gliaux reproductibles.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'application du protocole à d'autres sous-types gliaux ou à d'autres modèles pathologiques que l'infection protozoaire.
- Est limité par la durée de culture de 14 jours et par l'étape de dissociation mécanique, ce qui peut nuire à l'extensibilité du protocole pour des applications à haut débit.
