Name: Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez l'isolement concomitant d'astrocytes et de microglies primaires de souris pour étudier les infections par parasites protozoaires comme Trypanosoma cruzi et Toxoplasma gondii. Cette méthode permet des analyses comparatives des réponses gliales.

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Nous tenons à remercier le professeur Renato A. Mortara de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP) pour mAb 2C2 anti-Ssp-4. Ce travail a été soutenu par des subventions de Fundaço de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvention 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient-fico e Tecnol-ogico (CNPq, 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) et Coordenaçao de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nàvel Superior (CAPES, Code financier 001). M.P.A. reçoit une bourse du CNPq, A.L.O.P. reçoit une bourse de CAPES, et I.S.F et L.Z.M.F.B. reçoivent une bourse de la FAPESP.

Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été effectuées conformément à la loi nationale brésilienne (11.794/2008) et approuvées par les Comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP).
1. Extraction, entretien et dissociation des cellules gliales
REMARQUE : Le nombre de souris utilisées pour l’extraction des cellules gliales dépend de la quantité de cellules nécessaires pour effectuer les expériences souhaitées. Dans ce protocole, un total de 2,7 x 107 astrocytes et 4 x 106 microglies ont été obtenus à partir de six souris néonatales C57BL/6. Toutes les procédures ont été exécutées sous état stérile dans un coffret de biosécurité de classe II.
<ol><li>Jour 1
	<ol>
<li>Préparer la solution de sel équilibrée (HBSS) et le HBSS (HBSS) et 10 % du sérum bovin fœtal (FBS) inactivé à la chaleur (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Préparer le Medium Aigle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco (10 % FBS - 0,08 mM Penicillin - 0,09 mM Streptomycin , 12,5 mM HEPES , 30 mM de bicarbonate desodium, pH 7,2) et filtrer avec un filtre de 0,22 m (voir de la table ). REMARQUE : Tous les supports culturels doivent être entreposés à 4 oC, mais il est nécessaire de les pré-attendre à 37 oC pendant 20 minutes avant de commencer l’expérience.</li>
		<li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, spatule et pincettes) dans un autoclave et utiliser 70% d’éthanol pendant l’intervention.</li>
		<li>Mettre les nouveau-nés (jusqu’à 3 jours) souris dans une chambre scellée contenant du coton imbibé d’isoflurane pendant 5 min pour une anesthésie profonde.</li>
		<li>Vaporiser le chiot souris avec 70% d’éthanol et décapiter l’animal avec des ciseaux.</li>
		<li>Faire la coupe sagittale (postérieure à antérieure) avec des ciseaux le long du crâne pour l’ouvrir et exposer le cerveau. Séparez le crâne du cerveau à l’aide de pincettes. Retirez le cerveau à l’aide d’une micro spatule pour maintenir l’intégrité du cerveau.</li>
		<li>Placer le cerveau dans un plat Sec Petri (6 cm de diamètre). Retirer l’ampoule olfactive et le cervelet à l’aide d’une micro spatule. Déplacez le cortex vers un autre plat Petri (6 cm de diamètre) contenant HBSS et 10 % de FBS (2 ml/Petri).</li>
		<li>Couper le tissu cérébral en petits morceaux avec des ciseaux stériles et à l’aide d’une micropipette p1000 transférer chaque tissu cérébral avec HBSS - 10% FBS à différents tubes coniques de 15 mL. Assurez-vous que le volume final est de 2 ml/tube. Si ce n’est pas le cas, avec HBSS - 10% FBS. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Si c’est le cas, les tubes coniques avec tissu DE SNC doivent être placés sur la glace jusqu’à 1 h.</li>
		<li>Laver le tissu cérébral coupé avec 3 ml de HBSS , 10% FBS (par tube) et après décantation. Retirez soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois. REMARQUE : Cette étape vise à enlever les débris et à récupérer le tissu extrait.</li>
		<li>Laver le tissu cérébral coupé avec 3 ml de HBSS pur (par tube) et après décantation, enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois. REMARQUE : Cette étape vise à supprimer le sérum restant des lavages précédents, car les cellules seront trypsinisées à l’étape suivante.</li>
		<li>Ajouter 3 ml de trypsine par tube et placer dans un bain d’eau à 37 oC pendant 30 minutes, en secouant doucement les tubes toutes les 5 minutes. Évitez les bulles en inversant ou en mélangeant brusquement les tubes. REMARQUE : Cette étape vise à digérer le tissu recueilli.</li>
		<li>Pour inactiver la trypsine, laver le tissu avec 3 ml par tube de HBSS - 10% FBS et, après décantation du tissu, enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois.</li>
		<li>Laver le tissu avec 3 ml par tube de HBSS pur et enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 2 fois.</li>
		<li>Ajouter 7 ml par tube de HBSS pur et homogénéiser le tissu à travers des passages successifs dans les pipettes : d’abord avec la pipette sérologique de 10 ml, suivie de la 5 ml et enfin avec la micropipette p1000.</li>
		<li>Après homogénéisation, les tubes de centrifugeuse à 450 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
		<li>Jetez le supernatant et réutilisez la granule avec 4 ml de HBSS , soit 10 % de FBS par tube.</li>
		<li>Transférer les cellules dans un flacon T-75 prétraité pour une adhérence optimale à la culture cellulaire (voir Tableau des matériaux). REMARQUE : Traiter le tissu de chaque animal par flacon.</li>
		<li>Placer le flacon dans l’incubateur à 37 oC et 5% de CO2 pendant 30 min pour l’observance.</li>
		<li>Ajouter 10 ml de DMEM/F12 complété par flacon et incuber à 37 oC et 5 % de CO2. REMARQUE : Le volume final est de 14 ml par flacon.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 3
	<ol>
<li>Retirer 7 ml de milieu de culture du flacon T-75 et ajouter 7 ml de DMEM/F12 frais complété. REMARQUE : Les flacons contiendront beaucoup de débris cellulaires et un aspect nuageux.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 5
	<ol>
<li>Retirer tout le milieu du flacon T-75 et ajouter 14 ml de DMEM/F12 frais complété. REMARQUE : Le milieu est remplacé des flacons pour enlever les débris et les cellules non adhérentes.</li>
		<li>Après chaque 48 h, retirer 6 ml du supernatant et ajouter 7 ml de DMEM/F12 frais complété moyen jusqu’au jour 14 de la culture.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 14
	<ol>
<li>Après avoir enlevé 6 ml du supernatant et ajouté 7 ml de milieu frais DMEM/F12, fermez les flacons T-75.</li>
		<li>Placez-les dans le shaker orbital au sol à 200 tr/min et 37 oC pendant la nuit pour dissocier mécaniquement les microglies des astrocytes.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 15
	<ol><li>Prenez les flacons du shaker et lavez-les vigoureusement avec leur propre milieu afin d’optimiser la dissociation cellulaire et de récolter le nombre maximum de microglies. Ensuite, recueillir le supernatant (contenant des microglies) et le transférer à un tube conique de 50 ml.</li>
		<li>Ensuite, ajouter 4 ml de trypsine dans chaque flacon et incuber pendant 5 min à 37 oC afin de détacher les astrocytes.</li>
		<li>Ajouter 5 ml par flacon de DMEM/F12 complété pour inactiver la trypsine. Laver les flacons avec leur propre milieu et transférer le contenu dans un tube conique de 50 ml.</li>
		<li>Centrifuge tous les tubes contenant des microglies dissociées et des astrocytes à 450 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
		<li>Jetez le supernatant. Réutilisez le granule de microglie en 1 ml et les astrocytes dans 10 ml de DMEM/F12 complété.</li>
		<li>Procédez au comptage cellulaire dans une chambre Neubauer ou un compteur cellulaire automatique. Plaquez les cellules avec DMEM/F12 complété à la densité désirée dans une plaque de culture plate appropriée de cellules de fond (prétraité pour l’attachement optimal de cellules ; voir tableau des matériaux). Incuber les cellules à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h pour leur permettre de se fixer. REMARQUE : Réservez 1,5 x 106 de chaque population cellulaire pour confirmer leur pureté par cytométrie d’écoulement.</li>
		<li>Effectuez une analyse cytométrique du débit pour vérifier la pureté des populations cellulaires. REMARQUE: Nous considérons microglia CD11b '/CD45+'/GFAP- et astrocytes CD11b-/CD45-/GFAP+'. La coloration Iba1 et TMEM119 pourrait être envisagée afin de caractériser pleinement les microglies22.</li>
		<li>Ajouter un FMO (Fluorescence Moins One)23 et un échantillon non souillé pour chaque population cellulaire (astrocytes et microglies) comme témoins de l’analyse de cytométrie d’écoulement.</li>
		<li>Pour chaque population cellulaire, réservez 5 x 105 cellules pour chaque échantillon taché et non souillé. Pour l’OMF, réservez deux autres tubes de microglies contenant 2,5 x 105 cellules chacun et réservez également un autre tube de 5 x 105 astrocytes. REMARQUE : Étant donné que le nombre de microglies peut être un facteur limitant, il est possible d’utiliser moins de cellules pour des contrôles non contaminés et fMO.</li>
		<li>Centrifuge tous les microtubes à 450 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant et réutilisez la granule avec 500 L/microtube de tampon FACS (saline tamponnée par phosphate (PBS) - 0,5% albumin de sérum bovin (BSA) - 2 mM EDTA, pH 7.2).</li>
		<li>Centrifuge tous les microtubes à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant et résuspendre la granule avec 100 L/microtube d’anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) dilué dans le tampon FACS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter 500 L/microtube de tampon FACS dans tous les microtubes et centrifugeuse à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Les astrocytes et les tubes de colorant de microglie et aussi le tube FMO astrocyte avec 50 l/microtube de marqueurs de surface se mélangent : anti-CD45 (PE, clone 30-F11) et anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (tous deux dilués à 1: 100 dans le tampon FACS).</li>
		<li>Pour les cellules non contaminées, réutilisez-la avec le même volume de tampon FACS. Pour les microglies FMO, incuber chaque tube de microglie avec anti-CD45 ou anti-CD11b. Incuber tous les échantillons à 4 oC pendant 20 minutes dans l’obscurité.</li>
		<li>Ajouter 500 L de tampon FACS par microtube. Centrifugeuse à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant et réutiliser la granule avec 100 lL/microtube de tampon de fixation (voir tableau des matériaux) pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité.</li>
		<li>Ajouter 500 l/microtube de tampon de perméabilisation 1x (voir tableau des matériaux) et incuber à 4 oC pendant 5 minutes dans l’obscurité.</li>
		<li>Centrifuge tous les microtubes à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Résuspendent des astrocytes et des tubes de colorant de microglies et aussi des tubes FMO de microglie avec 50 l/microtube d’anticorps intracellulaires anti-GFAP (APC, clone GA5) dans une dilution de 1:100 dans le tampon de perméabilisation de 1x. Pour les cellules non contaminées et l’astrocyte FMO, réutilisez les cellules avec le même volume de tampon FACS. Incuber tous les échantillons à 4 oC pendant 30 minutes dans l’obscurité.</li>
		<li>Laver tous les tubes en ajoutant 500 L/microtube de tampon de perméabilisation 1x. Centrifuge tous les microtubes à 450 x g, pour 5 min à 4 oC. Réutilisez chaque microtube dans 200 L de tampon FACS. Acquérir 1 x 105 événements/échantillon sur le cytomètre de flux.</li>
		<li>Pour l’analyse, les cellules doivent être fermées d’abord sur CD11b x CD45, puis GFAP histogramme. REMARQUE : Les contrôles non entretenus et les contrôles FMO sont utiles pour déterminer les portes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Infection et évaluation des taux d’infection
<ol><li>Infection des cellules gliales avec T. gondii
	<ol>
<li>Plaque 3 x 104 microglies ou astrocytes avec DMEM/F12 complété à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h dans une plaque plate prétraitée de 96 puits (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Infecter chaque population cellulaire avec des tachyzoites de T. gondii RH souche exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) à une multiplicité d’infection (MOI) de 1:1 (parasite:cellule) dilué dans 200 L / puits de supplémenté RPMI (3 % FBS - 0,16 mM Pénicilline - 0,18 mM Streptomycine - 12,5 mM HEPES - 30 mM de bicarbonate de sodium, pH 7.2) (voir Tableau des matériaux). Incuber à 37 oC et 5% de CO2 pour 48 h.</li>
		<li>Ensuite, jetez le supernatant et fixez les cellules en ajoutant 100 L/puits de 1% de paraformaldéhyde (PFA) dilué dans PBS à 4 oC pour 24 h.</li>
		<li>Remplacer PFA par 100 L/puits de PBS à pH 7.2.</li>
		<li>Retirez soigneusement les noyaux des cellules supernatantes et des cellules tachetées en tuyautant 50 L/puits de DAPI (5 mg/mL) dilués dans PBS pH 7,2 (1:1 000) pendant 1 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
		<li>Remplacez la solution de coloration DAPI par 100 L/puits de PBS (pH 7.2) et analysez-la par microscopie à fluorescence.</li>
	</ol></li>
	<li>Infection des cellules gliales avec T. cruzi
	<ol>
<li>Plaque 3 x 104 microglies ou astrocytes avec DMEM/F12 complété à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h dans une plaque plate prétraitée de 96 puits (voir Tableau des matériaux). REMARQUE : Pour chaque fois, utilisez une plaque différente.</li>
		<li>Infectez les cellules gliales avec des trypomastigotes de la souche T. cruzi Y à un MOI de 5:1 (parasites:cell) dilués dans 200 L/puits de RPMI complété et incuber à 37 oC et 5% DE CO2 pour 2 h. REMARQUE: Cette étape est importante pour l’invasion cellulaire par le parasite.</li>
		<li>Retirez tous les supernatants et lavez les puits en ajoutant 200 L/puits de RPMI complété pour enlever tous les parasites extracellulaires. Retirez le supernatant et ajoutez 200 L/puits de RPMI frais complété. REMARQUE: Cette étape vise à éliminer tous les parasites qui n’ont pas envahi les cellules adhérentes.</li>
		<li>Incuber les cellules infectées pour 2 h, 48 h et 96 h pour évaluer la réplication de T. cruzi dans les cellules gliales11.</li>
		<li>Après chaque fois, retirez le supernatant et fixez les cellules avec 100 L/puits de méthanol pendant 15 minutes à température ambiante, puis remplacez le méthanol par 100 L/puits de PBS (pH 7.2).</li>
		<li>Après fixation, préparer les cellules pour l’essai d’immunofluorescence comme suit.<ol>
<li>Pour éviter l’autofluorescence, traiter les cellules avec 100 L/puits de 50 mM NH4Cl dilué dans PBS (pH 8.0) pendant 15 min. Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).</li>
			<li>Ensuite, perméabiliser les cellules en ajoutant 100 L/puits de 0,5% Triton dilué dans PBS pendant 15 min. Laver les cellules en ajoutant 100 L /puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).</li>
			<li>Ensuite, incuber la culture cellulaire avec 100 L /bien de solution de blocage (5% de lait non gras - 2% BSA dilué dans PBS [pH 7.2]) pour 1 h à température ambiante. Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).</li>
			<li>Afin de tacher les amastigotes, incuber avec 30 L/puits d’anticorps monoclonal non commercial (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 protéine (1:200) dilué dans la solution de blocage pour 1 h à température ambiante.</li>
			<li>Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois). Incuber la plaque avec 30 L/puits d’anticorps anti-souris secondaires (1:500) dilués dans PBS pendant 1 h à température ambiante. REMARQUE : La protéine anti-Ssp-4 non commerciale de mAb 2C2 était un bon cadeau du professeur Renato A. Mortara du Département de microbiologie, d’immunologie et de parasitologie de l’Université fédérale de Sao Paulo.</li>
			<li>Retirez soigneusement les noyaux supernatants et tachetés en ajoutant 50 l/puits de DAPI (5 mg/mL) dilués dans PBS pH 7.2 (1:1,000) pendant 1 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
			<li>Remplacez la solution de coloration DAPI par une microscopie à 100 L/puits de PBS pH 7.2 et analysez-la par microscopie à fluorescence.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’importance d’étudier les fonctions isolées des cellules gliales dans des contextes biologiques distincts s’est développée au cours des deux dernières décennies. Comprendre le SNC au-delà des neurones est encore un domaine croissant dans la biologie cellulaire, en particulier dans les infections ou les conditions inflammatoires8,9,24. Les cellules glials sont cruciales non seulement pour le soutien physique des neurones (comme ...

Le CNS est principalement composé de neurones et de cellules gliales1,2,3. Les microglies et les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du SNC. Microglia, le macrophage résident, est l’immunocompétence et la cellule gliale phagocytique dans le CNS3,4, tandis que les astrocytes sont responsables du maintien de l’homéostasie et exercent des fonctions de soutien5.
En dépit des cellules gliales étant classiquement connues pour être responsables du soutien et de la protection des neurones6,7, les fonctions émergentes de ces cellules ont été décrites dans la littérature récente, y compris leurs réponses aux infections8,9,10,11. Ainsi, il ya une poussée pour développer des méthodes pour isoler ces cellules gliales pour comprendre leurs fonctions individuellement.
Il existe d’autres modèles pour étudier les cellules gliales plutôt que les cultures primaires, comme les lignées cellulaires immortalisées et les modèles in vivo. Cependant, les cellules immortalisées sont plus susceptibles de subir des changements génétiques à la dérive et morphologiques, tandis que les études in vivo imposent des conditions de manipulation limitées. Inversement, les cultures primaires sont faciles à manipuler, mieux ressembler aux cellules in vivo et nous permettent également de contrôler les facteurs expérimentaux12,13. Ici, nous décrivons des lignes directrices sur la façon d’extraire, maintenir et dissocier les astrocytes murins et les cellules primaires de microglie dans le même protocole. En outre, nous fournissons également des exemples sur la façon de travailler avec l’infection à protozoaires dans ces cultures.
Les cellules du SNC extraites de souris néonatales (jusqu’à 3 jours) ont été cultivées pendant 14 jours sur des supports différentiels qui permettent la croissance préférentielle des astrocytes et des cellules de microglies. Puisque les microglies reposent au-dessus des astrocytes attachés, les populations cellulaires ont été mécaniquement dissociées dans un incubateur orbital. Ensuite, nous avons recueilli tous les supernatants contenant des microglies et ajouté de la trypsine pour détacher les astrocytes. Les cellules gliales isolées ont été évaluées phénotypiquement par cytométrie d’écoulement et plaquées selon l’expérience désirée.
Nous avons également fourni des exemples sur la façon d’infecter ces microglies et astrocytes isolés avec des parasites protozoaires. T. gondii est un protozoaire hautement neurotrope responsable de la toxoplasmose14, tandis que T. cruzi est responsable de la maladie de Chagas qui peut conduit au développement de troubles neurologiques dans leSNC 15,16. En outre, il a également été signalé que l’infection par T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 étaient la cause vraisemblablement de la mort chez les patients immunocompromisés. Par conséquent, l’élucidation du rôle immunologique des cellules gliales du SNC dans le contrôle des infections de protozoaire est d’une grande importance.

<table><tbody><tr><td>70 %</td><td>d’éthanol Din&acirc ; mica Qu&iacute ; mica Contempor&acirc ; </td><td>nea Cat : 2231</td><td>Stériliser</td></tr><tr><td>75 cm2 Flacon</td><td>Corning</td><td>Cat : 430720U</td><td>Matière plastique</td></tr><tr><td>96 puits plaque de culture cellulaire</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat : 655090</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium (NH4Cl)</td><td>Din&acirc ; mica Qu&iacute ; mica Contempor&acirc ; nea</td><td>Cat : C10337.01.AH</td><td>Supprimer l’autofluorescence</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFAP</td><td>Abcam</td><td>Cat. : ab49874</td><td>Immunofluorescence antidoby</td></tr><tr><td>Bottle Top Filter 0.22 &mu ; mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat : 430513</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>Filtre Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat : A7906</td><td>FACS Préparation du tampon</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat. : 553310</td><td>Anticorps de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. : 12-0451-83</td><td>Centrifugeuse d’anticorps de cytométrie en flux</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Cat : 5810R</td><td>Centrifugeuse de centrifugation</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>Classe II Enceinte de biosécurité</td><td>Pachane</td><td>Cat : 200</td><td>Armoire de biosécurité pour procédures stériles</td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>ThermoScientific</td><td>Modèle : 3110</td><td>Maintenance des cellules primaires</td></tr><tr><td>Tubes coniques 15 mL</td><td>Corning</td><td>Cat : 430766</td><td>Matière plastique</td></tr><tr><td>Tubes coniques 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat : 352070</td><td>Matière plastique</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess</td><td>Invitrogen</td><td>Cat : C10281</td><td>Compteur de cellules</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. : D1306</td><td>Antidoby d’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Appareil photo de microscope numérique</td><td>Nikon</td><td>Cat : DS-RI1</td><td>Capture d’images au microscope</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat : 12800-058</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat : E9884</td><td>FACS Préparation du tampon</td></tr><tr><td>F12 Mélange de nutriments</td><td>Gibco</td><td>Cat : 21700-026</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Cytomètre en</td><td>flux</td></tr><tr><td>indisponible Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>LGC Biotechnology</td><td>Cat : 10-bio500-1</td><td>Complément de milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Flow Jo (logiciel)</td><td>Flow Jo</td><td>Version : Flow Jo_9.9.4</td><td>Analyse des données</td></tr><tr><td>Fluorescence lumière intense</td><td>Comment</td><td> : C-HGFI</td><td>Source de fluorescence</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. : 50-9892-82</td><td>Anticorps de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>IgG de chèvre - anti-souris (FITC)</td><td>Kirkeegood& Perry Lab (KPL)</td><td>Cat. : 172-1806</td><td>Antidoby d’immunofluorescence</td></tr><tr><td>HBSS - Solution saline équilibrée de Hank</td><td>Gibco</td><td>Cat : 14175079</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat : H4034</td><td>Supplément de milieu de culture</td></tr><tr><td>cellulaire IC Fixation Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>Cat : 00-8222-49</td><td>Fixation cellulaire pour citométrie en flux</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Modèle : ECLIPSE TS100</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Crist&aacute ; lia</td><td>Cat : 21.2665</td><td>Anesthésique inhalé</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Synth</td><td>Cat : 01A1085.01.BJ</td><td>Fixation pour immunofluorescence</td></tr><tr><td>Micro spatule</td><td>ABC inoxydable</td><td>Indisponible</td><td>Matériau chirurgical</td></tr><tr><td>Microtube 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>Cat : MCT-150-C</td><td>Matière plastique</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>Non commercial</td> Non <td>commercial</td><td>Immunofluorescence antidoby</td></tr><tr><td>Pipette multicanaux (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat : 751630124</td><td>Réactifs pour pipette</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>Version 4.0</td><td>Acquisition et analyse d’images</td></tr><tr><td>Lait écrémé</td><td>Nestl&eacute ;</td><td>Cat : 9442405</td><td>Solution bloquante pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Incubateur à agitateur orbital</td><td>ThermoScientific</td><td>Modèle : 481 Cat : 11</td><td>Dissocier la microglie des astrocytes</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat : P6148</td><td>Fixation pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Non commercial</td> Non <td>commercial</td><td>Tampon neutre</td></tr><tr><td>Pénicilline G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat : P-7794</td><td>Supplément de milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tampon de perméabilisation (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat : 00-8333-56</td><td>Perméabilisation cellulaire pour citométrie en flux</td></tr><tr><td>Boîte de Petri 60 mm x 15 mm (jetable, stérile)</td><td>Prolab</td><td>Cat : 0303-8</td><td>PH-mètre en matière plastique</td></tr><tr><td></td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>Calibrer la solution de pH</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>Cat : 31800-014</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>ABC inox</td><td>Cat : LO9-W4</td><td>Matériel chirurgical</td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10 mL</td><td>Corning</td><td>Cat : 4101</td><td>Matière plastique</td></tr><tr><td>Pipette sérologique 5 mL</td><td>Corning</td><td>Cat : 4051</td><td>Matière plastique</td></tr><tr><td>Pipette monocanal (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat : F123602</td><td>Réactifs de pipette</td></tr><tr><td>Simple Pipette à canal (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat : F123601</td><td>Réactifs de pipette</td></tr><tr><td></td><td>Bicarbonate de sodium Sigma Aldrich</td><td>Cat : S6297</td><td>Supplément de milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sel de sulfate de streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat : S9137</td><td>Supplément de milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat : T9284</td><td>Perméabilisation pour immunofluorescence</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>Cat : 27250-018</td><td>Enzyme digestive</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>ABC inox</td><td>Cat : L28-P4-172</td><td>Matériel chirurgical</td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Novatecnica</td><td>Modèle : 09020095</td><td>Digeste tissu à 37 &deg ; C avec trypsine</td></tr></tbody></table>

isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de protozoa

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Les astrocytes et les microglies sont les cellules gliales les plus abondantes. Ils sont responsables du soutien physiologique et de l’entretien de l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC). Les preuves croissantes de leur participation à la lutte contre les maladies infectieuses justifient l’intérêt croissant pour l’amélioration des méthodologies pour isoler les astrocytes primaires et les microglies afin d’évaluer leurs réponses aux infections qui affectent le SNC. Considérant l’impact de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) et Toxoplasma gondii (T. gondii) infection dans le SNC, ici nous fournissons une méthode pour extraire, maintenir, dissocier et infecter les astrocytes murins et les cellules de microglie avec des parasites protozoaires. Les cellules extraites des cortices nouveau-nés sont maintenues in vitro pendant 14 jours avec le remplacement différentiel périodique de médias. Les astrocytes et les microglies sont obtenus à partir du même protocole d’extraction par dissociation mécanique. Après le phénotypage par cytométrie d’écoulement, les cellules sont infectées par des parasites de protozoaire. Le taux d’infection est déterminé par la microscopie de fluorescence à différents moments, permettant ainsi l’évaluation de la capacité différentielle des cellules gliales pour commander l’invasion et la réplication protozoaires. Ces techniques représentent des méthodes simples, bon marché et efficaces pour étudier les réponses des astrocytes et des microglies aux infections, ouvrant le champ à d’autres analyses neuroimmunologiques.

Le 14e jour, la culture des cellules gliales(figure 1A) a subi une dissociation mécanique. Les populations cellulaires isolées ont été analysées par cytométrie d’écoulement selon les marqueurs CD11b, CD45 et GFAP. Nous avons pu observer une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies(figure 1B). Après l’isolement, les cellules ont été plaquées dans une plaque plate de 9...

L’objectif global de ce protocole est d’instruire comment extraire, maintenir et dissocier les cellules astrocytes murines et microglies du système nerveux central, suivies d’une infection par des parasites protozoaires.

Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Ce protocole décrit une méthode qui est axée sur l’extraction en parallèle des deux populations de cellules gliales les plus abondantes, les astrocytes et les microglies, à partir de souris postnatales. Notre méthode diffère des autres protocoles précédemment décrits pour l’isolement des astrocytes et des microglies parce que nous nous concentrons sur l’obtention et l’isolement des deux types de cellules dans la même extraction à la même condition, optimisant ainsi l’utilisation d’animaux expérimentaux et améliorant l’étude des rôles relatifs pour ces cellules dans des contextes immunologiques. Ce protocole peut être utile pour mieux étudier les rôles des microglies et des astrocytes dans de nombreux contextes et maladies du système nerveux central tels que la maladie d’Alzheimer, Parkinson et les infections par exemple les parasites ou les virus protozoaires.L’obtention et l’isolement des deux types de cellules à partir de la même extraction sont souhaitables pour évaluer le rôle comparatif de chaque cellule sous-ensemble contextes immunologiques tels que l’infection ou l’inflammation. Les gens devraient être prudents en particulier lors de l’ablation du cerveau et des lavages de tissus nerveux, mais je crois qu’avec ce protocole et la vidéo tournée, les gens ne lutteront pas. Ce protocole peut être long en fonction du nombre d’animaux pour extraire les cortices alors soyez prêt à passer environ quatre heures ou plus.Le premier jour, préparez du HBSS pur et du HBSS plus 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Préparez le DMEM F12 complété et filtrez-le avec un filtre de 0,22 micron. Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave et utiliser 70% d’éthanol pendant l’intervention.Mettez les souris nouveau-nées dans une chambre scellée contenant du coton imbibé d’isoflurane pendant cinq minutes pour une anesthésie profonde. Vaporiser le chiot de souris avec 70% d’éthanol et décapiter l’animal avec des ciseaux. Faire une coupe sagittale avec des ciseaux le long du crâne pour l’ouvrir et exposer le cerveau.Retirez le cerveau à l’aide d’une micro spatule pour maintenir l’intégrité du cerveau. Placer le cerveau dans une boîte de Pétri sèche de six centimètres de diamètre. À l’aide d’une micro spatule, retirer l’ampoule olfactive et le cervelet.Déplacez le cortex vers une autre boîte de Pétri contenant deux millilitres de HBSS plus 10%FBS. Couper le tissu cérébral en petits morceaux avec des ciseaux stériles et à l’aide d’une micropipette P1000, transférer chaque tissu cérébral avec HBSS plus 10%FBS à différents tubes coniques de 15 millilitres. Si nécessaire, utilisez HBSS plus 10%FBS pour remplir le volume final à deux millilitres.Lavez le tissu cérébral coupé avec trois millilitres de HBSS plus 10%FBS pour chaque tube. Après la décantation, retirer soigneusement le surnatant. Répétez le lavage avec HBSS plus 10%FBS trois fois supplémentaires.Puis laver avec trois millilitres de HBSS pur trois fois. Après la décantation, retirer soigneusement le surnatant. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine et placez le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant doucement les tubes toutes les cinq minutes.Cela digère les tissus recueillis. Évitez les bulles. Pour inactiver la trypsine, lavez le tissu avec trois millilitres de HBSS plus 10%FBS et après décantation du tissu, retirez soigneusement le supernatant.Répétez ce lavage trois fois. Ensuite, lavez le tissu avec trois millilitres de HBSS pur et répétez deux fois supplémentaires. Après décantation du tissu, retirer soigneusement le surnatant.Ajouter sept millilitres de HBSS pur et homogénéiser le tissu à travers des passages successifs en pipettes, d’abord avec une pipette sérologique de 10 millilitres, suivie d’une pipette de cinq millilitres, et enfin avec une micropipette P1000. Après homogénéisation, centrifuger les tubes à 450 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille avec quatre millilitres de HBSS plus 10%FBS pour chaque tube.Transférer les cellules dans un flacon T75 prétraité commercialement pour une adhérence optimale à la culture cellulaire. Placez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes pour l’observance. Ajoutez ensuite 10 millilitres de DMEM F12 complété au flacon et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux nuits.Le troisième jour, retirez sept millilitres de milieu de culture du flacon T75 et ajoutez sept millilitres de DMEM F12 fraîchement complété. Remettre le flacon à l’incubateur. Le cinquième jour, pour enlever les débris et les cellules non adhérentes, échangez tout le milieu de la fiole T75 avec 14 millilitres de DMEM F12 fraîchement complété.Puis toutes les 48 heures, retirer six millilitres du supernatant et ajouter sept millilitres de DMEM F12 frais complété moyen jusqu’au jour 14 de la culture. Le jour 14, après avoir enlevé six millilitres de supernatant et ajouté sept millilitres de milieu DMEM F12 frais complété, fermez les flacons T75 hermétiquement avec un emballage en plastique. Placez-les dans le shaker orbital de plancher à 200 RPM et 37 degrés Celsius pendant la nuit pour dissocier mécaniquement les microglies des astrocytes.Le jour 15, prenez les flacons du shaker et lavez-les vigoureusement avec leur propre milieu afin d’optimiser la dissociation cellulaire et de récolter le nombre maximum de microglies. Puis recueillir le supernatant et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajouter quatre millilitres de trypsine à chaque flacon et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius afin de détacher les astrocytes.Ajouter ensuite cinq millilitres de DMEM F12 complété pour inactiver la trypsine. Laver les flacons avec leur propre milieu et transférer le contenu dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse tous les tubes contenant des microglies ou des astrocytes dissociés à 450 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Jeter le surnatant. Resuspendez la pastille de microglie dans un millilitre de DMEM F12 complété et les astrocytes dans 10 millilitres de DMEM F12 complété. Procéder au comptage cellulaire dans une chambre Neubauer ou un compteur de cellules automatique.Plaquez les cellules avec le DMEM F12 complété à la densité désirée dans une plaque plate prétraitée de culture de cellules de fond plat. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour leur permettre de s’attacher. Le 14ème jour, la culture glial de cellules a subi la dissociation mécanique.Il a été observé avec une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies. Les astrocytes et les microglies des souris C57BL6 ont été infectés par T.cruzi Y.After deux heures, 48 heures, et 96 heures, les chambres ont été fixées avec le méthanol et tachées avec le marqueur de nucléase cellulaire DAPI et anti-GFAP. L’utilisation de parasites génétiquement modifiés exprimant des reporters fluorescents ou des parasites étiquetés avec des anticorps fluorescents spécifiques a amélioré la microscopie d’immunofluorescence puisqu’ils sont mieux distingués du noyau cellulaire.Deux exemples sont présentés ici. La souche T.gondii RH exprimant constitutivement la souche YFP et T.cruzi Y tachée d’anticorps monoctone non commercial 2C2 anti-SSP4. Il est important de laver soigneusement les cellules pour ne pas perdre d’agrégats cellulaires.Après l’infection de cellules gliales, d’autres paramètres peuvent être évalués tels que ELISA pour la production de cytokine présente dans le supernatant, ballonnement occidental pour l’expression de protéine, et PCR quantitatif en temps réel pour l’évaluation de transcription d’ARN. De nombreuses questions liées à la fonction des cellules gliales, par exemple leur métabolisme, leur réponse immunitaire et la biologie cellulaire elle-même peuvent être abordées et bénéficier de cette technique. Tous les parasites protozoaires sont capables d’infecter les cellules humaines ainsi que les cellules de souris de culture, il est donc important d’être prudent lors de la manipulation de ce parasite.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules...

Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Cette étude décrit les procédures de mise en place d'un axone des neurones et roman (astro) glie plate-forme de co-culture. Dans ce système de co-culture, la manipulation de l'interaction directe entre un axone unique (et unique cellule gliale) devient possible, ce qui permet une analyse mécaniste du neurone mutuelle à la signalisation gliales.

Analyse en Imagerie du Neuron à l&#39;interaction Glia dans la plate-forme microfluidique Culture (MCP) à base neuronale et Axon Glia co-culture système

Les astrocytes ont été reconnus pour être des cellules polyvalentes qui participent au processus biologiques fondamentaux qui sont essentiels pour le développement normal du cerveau et la fonction, et réparation du système nerveux central. Nous présentons ici une procédure rapide afin d'obtenir des cultures pures astrocytes de souris pour étudier la biologie de cette classe importante de cellules du système nerveux central.

Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Une méthode pour l'isolement des adhérents leucocytes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau...

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement in vitro de plusieurs populations de cellules gliales à partir d’un SNC de souris. Cette méthode permet la ségrégation de la microglie régionale, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des astrocytes pour étudier les phénotypes de chacun dans une variété de systèmes de culture.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (AdMSC) ont de puissantes propriétés immunomodulatrices utiles pour traiter les maladies associées à l’inflammation. Nous montrons comment isoler et cultiver des AdMSC murins et des cellules gliales mixtes primaires, stimuler les AdMSCs pour réguler à la hausse les gènes anti-inflammatoires et les facteurs de croissance, évaluer la migration des AdMSCs et co-cultiver des AdMSCs avec des cellules gliales mixtes primaires infectées...

Cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux co-cultivées avec des cellules gliales mixtes primaires pour réduire l’inflammation induite par les prions

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes purifiés et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi les applications ultérieures telles que l’analyse de l’ARN et la culture cellulaire. Il comprend des méthodes et des procédures détaillées de dissociation cellulaire conçues pour améliorer à la fois la qualité et le rendement des cellules isolées.

Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Découvrez l'isolement concomitant d'astrocytes et de microglies primaires de souris pour étudier les infections par parasites protozoaires comme Trypanosoma cruzi et Toxoplasma gondii. Cette méthode permet des analyses comparatives des réponses gliales.

Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa

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