Name: Quantifier la cytotoxicité de Staphyloccus aureus contre les leucocytes polymorphes humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Découvrez comment isoler les PMN du sang humain et quantifier la cytotoxicité de Staphylococcus aureus par cytométrie en flux. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-pathogène avec une pureté cellulaire supérieure à 98%.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grants NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 ainsi que des fonds de la Montana State University Agriculture Experiment Station, et une subvention d'équipement de Murdock Charitable Trust .

Le sang veiné héparinisé de donneurs en bonne santé a été recueilli conformément au protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel pour les sujets humains à l'Université d'État du Montana. Tous les donateurs ont donné leur consentement écrit pour participer à cette étude.
1. Purification des leucocytes polymorphes humains et isolement du sérum humain
REMARQUE : Tous les réactifs doivent être systématiquement vérifiés pour la présence d'endotoxine à l'aide d'un kit de détection d'endotoxines disponible dans le commerce et doivent contenir une endotoxine de 25,0 pg/mL pour prévenir l'amorçage indésirable des PMN.
<ol><li>Apportez 50 ml de 3 % de dextran-0,9 % NaCl (w/v), 35 ml de 0,9 % NaCl (w/v), 20 ml de 1,8 % NaCl (w/v), 12 ml de 1,077 g/mL de gradient de densité, et 20 ml d'eau de qualité injection ou d'irrigation à température ambiante.</li>
	<li>Pour isoler le sérum humain, incuber 4 ml de sang humain fraîchement prélevé sans anticoagulant à 37 oC dans un tube de verre de 15 ml pendant 30 min. Après l'incubation, l'échantillon de centrifugeuses de 2 000 à 3 000 g pendant 10 min à température ambiante. Transférer la couche supérieure de sérum dans un tube conique frais de centrifugeuse de 15 ml et placer sur la glace.</li>
	<li>Mélanger 25 mL de sang humain entier fraîchement dessiné (1000 unités/mL) avec 25 ml de température ambiante 3 % dextran-0,9 % NaCl (1:1 ratio) en deux répliques de tubes coniques centrifugeuses de 50 ml (50 mL de volume total par tube). Mélanger en berçant doucement chaque tube conique de 50 ml, puis laisser reposer à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Après l'incubation à température ambiante, deux couches distinctes apparaîtront. Transférer la couche supérieure de chaque mélange dextran-sang dans de nouveaux tubes coniques de 50 ml et centrifugeuse à 450 x g pendant 10 min à température ambiante avec des freins bas ou nuls.</li>
	<li>Aspirez soigneusement les deux supernatants et jetez sans déranger les granulés cellulaires. Resuspendre délicatement chaque granule de cellule dans 2 ml de température ambiante 0,9 % NaCl, mélanger les granulés en suspension dans un seul tube conique de 50 ml, puis ajouter le naCl de 0,9 % restant (volume final de 35 ml).</li>
	<li>Sous-poser soigneusement 10 ml de température ambiante de 1,077 g/mL de solution de gradient de densité sous la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette à main. Faire tourner à 450 x g pendant 30 min à température ambiante avec des freins bas ou nuls. Aspirez doucement le supernatant sans déranger la pastille cellulaire. Supernatant contiendra des cellules mononucléaires sanguines périphériques qui peuvent être recueillies comme précédemment décrit14.</li>
	<li>Lyser les globules rouges en rependant la pastille cellulaire dans 20 ml d'eau à température ambiante. Mélanger délicatement en berçant le tube pendant 30 s. La lyse des globules rouges s'accompagnera d'une nette diminution de la turbidité.</li>
	<li>Ajouter immédiatement 20 ml de 1,8 % de NaCl (à température ambiante [RT]) et un échantillon de centrifugeuse à 450 g pendant 10 min à température ambiante. REMARQUE : Il est important de réduire au minimum le temps que les PMN sont laissés dans l'eau seuls après la lyse des globules rouges afin de maximiser le rendement des PMN et de prévenir la lyse et/ou l'activation des PMN.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille cellulaire. Resuspendre doucement le granule cellulaire dans 2 ml de RT RPMI 1640 moyen et placer sur la glace.</li>
	<li>Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Resuspendre les PMN purifiés à une concentration de 1 x 107 cellules/mL avec le RPMI glacé et garder sur la glace.</li>
	<li>Combiner 100 L de PMN purifiés (1 x 106 cellules) avec 300 l de salline tamponnée par le phosphate (DPBS) de Dulbecco, qui contient 1 l de tache d'iodure de propidium dans deux tubes de cytométrie à débit répliqué. Pour un contrôle positif des dommages causés par la membrane plasmatique, ajouter 40 'L de 0,5% triton X-100 solution dans l'un des tubes de cytométrie de flux et mélanger soigneusement.</li>
	<li>Utiliser la cytométrie du débit pour mesurer la diffusion vers l'avant, la diffusion latérale et la coloration de l'iodure de propidium (maxima d'excitation/émission à 535/617 nm) des cellules purifiées (figure 1). REMARQUE : L'analyse de la diffusion vers l'avant et latérale permettra d'identifier les populations indésirables de lymphocytes et de monocytes. L'iodure de propidium ne tachera que les cellules munies d'une membrane plasmatique compromise et les PMN purifiés qui ont des populations prononcées de cellules positives à l'iodure de propidium. Pour ces études, les PMN purifiés n'ont été utilisés que s'ils comprenaient des cellules purifiées et des souillées positives pour le propidium.</li>
	<li>Préparer une plaque de 96 puits pour les tests de cytotoxicité PMN en enrobant les puits individuels qui seront utilisés dans cet analyse avec 100 L de sérum humain isolé de 20 % qui a été dilué avec DPBS. REMARQUE : Le plaquage des PMN directement sur le plastique ou le verre provoquera l'activation des cellules. Assurez-vous d'inclure au moins un puits de contrôle négatif qui ne recevra que les médias et au moins un puits de contrôle positif qui recevra 0,05% Triton X-100.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 oC pendant 30 min. Après l'incubation, laver les puits enduits deux fois avec du DPBS glacé pour enlever tout excès de sérum. Appuyez doucement sur la plaque à l'envers pour enlever tout DPBS résiduel et placez-la sur la glace.</li>
	<li>Ajouter délicatement 100 L de PMN humains purifiés à 1 x 107 cellules/mL à chaque puits enduit (1 x 106 PMN/puits). Permettre aux PMN de s'installer dans les puits en couvant la plaque sur la glace pendant au moins 5 min. Maintenir le niveau de la plaque pour permettre une distribution uniforme des cellules dans chaque puits et laisser sur la glace pour éviter l'activation non désirée des PMN.</li>
</ol>2. Essai de cytotoxicité des protéines extracellulaires de S. aureus contre les leucocytes polymorphonucléaires humains
<ol><li>Culture S. aureus pendant la nuit dans le bouillon de soja tryptique (TSB) à l'aide d'un incubateur secouant réglé à 37 oC. Pour ces études, 20 mL de BST en flacons Erlenmeyer séparés de 150 mL ont été inoculés avec des cultures congelées de souches de S. aureus USA300 ou USA300MDsaeR/S et ont poussé pendant environ 14 h avec des secousses à 250 tr/min.</li>
	<li>Sous-culture S. aureus en effectuant une dilution 1:100 de la culture bactérienne du jour au lendemain avec des médias frais. Incuber à 37 oC en secouant jusqu'à ce que la bactérie atteigne la phase de croissance stationnaire précoce. REMARQUE : Pour ces expériences, 20 ml de bouillon de soja tryptique dans 150 mL de flacons Erlenmeyer ont été inoculés avec 200 OL d'USA300 cultivés pendant la nuit ou USA300SaeR/S et incubés à 37 oC avec des secousses à 250 tr/min pendant 5 h.</li>
	<li>Lorsque les bactéries ont atteint la phase de croissance stationnaire précoce, transférer 1 ml de S. aureus sous-cultivé dans un tube de microcentrifuge et une centrifugeuse de 1,5 ml à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Après centrifugation, transférer le supernatant dans une seringue de 3 ml. Passer les supernatants à travers un filtre de 0,22 m et dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml sur la glace.</li>
	<li>Effectuer des dilutions en série de supernatants avec des médias glacés utilisés pour la culture S. aureus. REMARQUE : Pour les expériences présentées, les supernatants d'USA300 et d'USA300SaeR/S ont subi quatre dilutions consécutives de 1/2 de billots avec le BST glacé.</li>
	<li>Ajouter délicatement des échantillons de supernatant ou des supports seuls (pour des contrôles négatifs et positifs) aux puits individuels de la plaque de 96 puits contenant des PMN sur la glace à partir de l'étape 1.15. Pour ces expériences, 10 échantillons de supernatant USA300 ou USA300MDont été ajoutés à chaque puits. Plaque de roche délicate pour distribuer les supernatants dans les puits et incuber à 37 oC.</li>
	<li>Aux heures désirées, retirer la plaque de l'incubateur et la placer sur la glace. Ajouter 40 'L de 0.5% Triton X-100 au bien de contrôle positif.</li>
	<li>Faites doucement la pipette les échantillons de haut en bas dans chaque puits pour retirer complètement tous les PMN adhérés à la plaque, puis transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie d'écoulement sur la glace qui contiennent 300 L de DPBS glacé avec 1 l d'iodure de propidium.</li>
	<li>Mesurer la proportion de PMN positifs à l'iodure propidium à l'aide de la cytométrie du débit (figure 2A). Lorsqu'il est lié à l'ADN, le propidium iodide a une excitation/émission de 535/617 nm.</li>
</ol>3. S. aureus cytotoxicité test contre les leucocytes polymorphes humains suite à la phagocytose
REMARQUE : Les courbes de croissance définies par la densité optique à 600 nm (OD600) et la concentration de bactéries doivent être déterminées empiriquement pour que les souches de S. aureus soient testées avant de commencer cet essai. Le succès de ces expériences nécessite la récolte constante de concentrations égales de chaque souche de S. aureus testée à mi-exponentielle phase de croissance à l'aide de l'OD600 de bactéries sous-cultivées.
<ol><li>Commencez les cultures du jour au lendemain des souches de S. aureus et des bactéries de sous-culture telles que décrites dans les étapes 2.1.1 et 2.1.2.</li>
	<li>Récolte sous-culture S. aureus quand il a atteint une croissance mi-exponentielle en transférant 1 ml de bactéries cultivées à un tube microcentrifuge de 1,5 ml et en centrifugeant à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante. REMARQUE : Dans nos conditions de croissance, USA300 et USA300MDsaeR/S ont atteint la phase de croissance à mi-exponentielle après environ 135 min d'incubation6.</li>
	<li>Laver S. aureus après centrifugation en aspirant le supernatant, en reconpendant les bactéries granulées dans 1 ml de DPBS, en faisant du vortex l'échantillon pendant 30 s, et en centrifugeant à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Opsoniser S. aureus en reconpendant la pastille bactérienne dans 1 ml de sérum humain dilué à 20 % de sérum humain dilué avec dPBS et en couvant à 37 oC avec de l'agitation pendant 15 min.</li>
	<li>Centrifugeuse bactéries opsonisées à 5 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Laver S. aureus après centrifugation en aspirant le supernatant, en reconpendant les bactéries granulées dans 1 mL DPBS, puis vortex l'échantillon jusqu'à ce que la pastille bactérienne est complètement brisée plus 30 secondes supplémentaires. Bactéries centrifugeuses à 5 000 g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Resuspendre les souches opsonisées de S. aureus dans 1 mL de RPMI, vortex l'échantillon jusqu'à ce que la granule bactérienne soit complètement brisée, puis pour 30 s supplémentaires. Placez les bactéries sur la glace.</li>
	<li>Diluer les souches opsonisées de S. aureus à la concentration désirée avec le RPMI glacé. Vortex pour 30 s et placer sur la glace.</li>
	<li>Confirmer la concentration de S. aureus opsonisé en placage 1:10 dilutions sérielles de bactéries sur l'agar de soja tryptique. REMARQUE : Étant donné que les différences dans la concentration des bactéries utilisées dans cet essai peuvent avoir un impact majeur sur la perméabilité ultérieure de la membrane plasmatique PMN (figure 3A),il est très important que la concentration de chaque souche testée soit déterminée pour chaque expérience et soit équivalente entre les souches.</li>
	<li>Ajouter délicatement 100 l/puits de chaque souche de S. aureus ou RPMI (pour les contrôles positifs et négatifs) aux PMN dans la plaque de 96 puits sur la glace à partir de l'étape 1.14. Plaque de roche délicate pour distribuer S. aureus dans les puits.</li>
	<li>Synchroniser la phagocytose en centrifuant la plaque à 500 g pendant 8 min à 4 oC15. Incuber la plaque à 37 oC immédiatement après la centrifugation (T à 0).</li>
	<li>Aux heures désirées, retirer la plaque de l'incubateur et la placer sur la glace. Ajouter 40 'L de 0.5% Triton X-100 au bien de contrôle positif.</li>
	<li>Faites doucement pipette les échantillons de haut en bas dans chaque puits pour retirer complètement tous les PMN adhérés à la plaque, puis transférer les échantillons à des tubes de cytométrie d'écoulement sur la glace contenant 200 L de DPBS glacé avec 1 l d'iodure de propidium.</li>
	<li>Analyser les échantillons pour la coloration de l'iodide de propidium à l'aide de la cytométrie du débit tel que décrit à l'étape 2.9.</li>
</ol>

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<li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocidins%3A+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li>
<li>Bøyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li>
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<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SaeR%2FS+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole décrit la purification des PMN du sang humain et deux essais distincts qui emploient l'iodure de propidium pour quantifier la cytotoxicité de S. aureus contre ces cellules immunitaires innées importantes. Le succès de ces procédures dépendra de la qualité des PMN purifiés et de la préparation appropriée de S. aureus et de protéines extracellulaires produites par cet agent pathogène. Pour l'isolement des PMN, il est important de minimiser l'activation des PMN pendant et après la purification en utilisant des réactifs exempts de contamination par l'endotoxine, en traitant les préparations cellulaires en douceur et en maintenant les cellules à la température appropriée. Les signes qui indiquent l'activation des PMN incluent l'agglutination des cellules pendant la purification et quand plus de 5% de cellules isolées tachent positive pour l'iodure de propidium. En raison de la durée de vie relativement courte des PMN, ces cellules doivent être isolées du sang humain et testées dans la même journée. Les PMN commenceront à montrer des signes d'apoptose spontanée s'ils sont laissés sur la glace pendant plus de 3 h après la purification. Comme mentionné précédemment, il est très important que chaque préparation PMN soit soigneusement évaluée à l'aide de l'analyse de cytométrie du débit de la diffusion vers l'avant et latérale ainsi que de la coloration de l'iodure de propidium pour assurer la pureté et l'intégrité des cellules isolées.
L'expression des leukocidins bicomposants par S. aureus est responsable de la majorité de l'intégrité compromise de membrane de plasma de PMN qui est observée utilisant les essais décrits dans ce protocole. La variation de l'expression de ces toxines et d'autres peptides formant des pores, tels que les modulins solubles dans le phénol, entre les souches de S. aureus produira des différences de cytotoxicité par rapport aux PMN humains. Des écarts significatifs pendant la croissance in vitro entre les souches de S. aureus influenceront également l'expression des toxines formant des pores et la cytotoxicité subséquente. En outre, le rapport entre S. aureus et les PMN dans les essais de phagocytose a un impact majeur sur la perméabilité subséquente de la membrane plasmatique PMN (figure 3A) et ces expériences nécessitent la récolte constante de concentrations égales de chaque souche de S. aureus testée à mi-exponentielle en utilisant l'OD600 de bactéries sous-cultivées. Compte tenu de ces considérations, il est très important de définir les courbes de croissance pour toutes les souches qui seront examinées avant de commencer les essais de cytotoxicité. Nous ne recommandons pas ces méthodes pour analyser la cytotoxicité de S. aureus avec des souches qui présentent des différences significatives de croissance in vitro.
USA300 est un isolat virulent de SARM qui est connu pour être fortement cytotoxique contre les PMN humains15 et la perte de SaeR/S dans cette souche réduit considérablement la transcription de nombreuses leucocidins bi-composants qui ciblent les PMN humains6,12, ce qui rend ces souches modèles idéales pour comparer la cytotoxicité en utilisant les essais décrits. Cependant, il existe une grande variation génétique entre les différents isolats de S. aureus et les paramètres détaillés dans ces protocoles peuvent ne pas entraîner de changements substantiels de cytotoxicité par rapport aux PMN humains lors de l'essai d'autres souches de S. aureus. L'adaptation des conditions de croissance, des volumes de supernatants ajoutés, ou le rapport des bactéries aux PMN peut être nécessaire pour le succès avec ces méthodes utilisant d'autres souches de S. aureus.

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Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
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Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

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Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus est une bactérie Gram-positive qui provoque un large éventail de maladies chez l'homme. Cet agent pathogène de premier plan produit de nombreux facteurs de virulence qui contribuent à différents aspects de l'infection. Il s'agit notamment de molécules de surface qui permettent à S. aureus d'adhérer à différents types de tissu hôte1, protéines extracellulaires qui interfèrent avec la réponse immunitaire de l'hôte2, et un tableau de toxines sécrétées qui ciblent différents types de cellules hôtes3. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode qui quantifie la cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par S. aureus contre les leucocytes polymorphes humains (PMN souvers ou neutrophiles), cellules effectrices primaires de la réponse immunitaire innée de l'hôte.
Les PMN sont les leucocytes les plus abondants chez les mammifères. Ces cellules immunitaires circulantes sont rapidement recrutées sur le site de l'insulte de tissu hôte en réponse aux signaux de danger produits par les cellules résidentes ou par des composés uniques aux microbes envahissants. L'entrée extracellulaire de ces molécules et des contacts directs avec les cellules hôtes résidentes activées pendant l'extravasation augmentent l'état d'activation des PMN dans un processus connu sous le nom d'amorçage4,5. Les PMN d'apaisement qui ont atteint le tissu affligé exécutent alors les réponses immunitaires innées importantes conçues pour empêcher l'établissement de l'infection. Il s'agit notamment de la liaison et l'internalisation, ou phagocytose, des micro-organismes envahisseurs qui déclenche une cascade d'événements intracellulaires cumulant dans la destruction des microbes par une batterie de puissants composés antimicrobiens5.
Les PMN jouent un rôle essentiel pour protéger les humains contre les agents pathogènes envahissants et sont particulièrement importants pour prévenir l'infection à S. aureus 4. Cependant, cette bactérie produit un large éventail de gènes de virulence qui entravent différentes fonctions PMN. Ceux-ci incluent les protéines extracellulaires qui bloquent la reconnaissance des molécules de signalisation, empêchent l'adhérence à l'emformation de l'hôte du tissu, inhibent la production de composés antimicrobiens, et compromettent l'intégrité de la membrane plasmatique4. S. aureus orchestre l'expression temporelle de ces gènes de virulence à travers l'entrée collective de plusieurs systèmes sensoriels à deux composantes qui reconnaissent des indices environnementaux spécifiques. Le système à deux composants SaeR/S est un important régulateur de la transcription du gène de la virulence de S. aureus lors de l'infection6,7,8,9,10,11. En particulier, ce système à deux composants s'est avéré essentiel pour la production de leukocidins bicomposants qui ciblent spécifiquement les PMN humains12.
Ce protocole est divisé en trois sections différentes. La première section décrit la purification des PMN à partir du sang humain à l'aide de la centrifugation du gradient de densité à l'aide d'un protocole qui a été adapté à partir de méthodes établies par le bôyum13 et le Nauseef14. Les deuxième et troisième sections détaillent deux techniques différentes pour examiner la cytotoxicité de S. aureus ; l'un enivre les PMN avec des protéines extracellulaires produites par S. aureus tandis que l'autre examine la capacité des bactéries vivantes à endommager les PMN à la suite de la phagocytose. Ces procédures utilisent l'iodure de propidium pour mesurer la perte de l'intégrité de la membrane plasmatique PMN causée par les toxines formant des pores de S. aureus. Propidium iodide est un fluorophore liant l'ADN qui est normalement membrane cellulaire imperméable, mais peut traverser les membranes plasmatiques qui ont été perturbés par les toxines S. aureus. L'analyse de la cytométrie des flux permet la quantification rapide des PMN positifs en iodure de propidium pour mesurer la cytotoxicité relative des souches de S. aureus. Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) identifié comme électrophoresis de gel pulsé USA300 et mutant de la délétion isogénique de saeR/S dans cette souche (USA300MDsaeR/S)ont été utilisés comme modèles pour démontrer comment ces procédures peuvent quantifier la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium injectable à 0,9 %, USP, 500 mL Récipient en plastique VIAFLEX</td><td>Baxter</td><td>2B1323Q</td><td>Purification PMN</td></tr><tr><td>Tubes micro-centrifuges de 1,5 mL avec Snap Caps</td><td>VWR</td><td>89000-044</td><td>Utilisé dans les cellules de lavage</td></tr> Solution de <tr><td>chlorure de sodium à 1,8 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Purification PMN</td></tr><tr><td>12x75mm Tubes de culture</td><td>VWR</td><td>60818-430</td><td>Utilisé comme cytométrie en flux tubes</td></tr><tr><td>20 % (p/p) Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8802</td><td>Purification PMN</td></tr><tr><td>3125 Compteur de comptage manuel</td><td>Produits traçables</td><td>3125CC</td><td>Pour le comptage des cellules</td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td>Pour les milieux de distribution</td></tr><tr><td>Bacto Tryptic Bouillon de soja, Soja-Caséine Digest Medium</td><td>FischerScientific</td><td>211823</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>BD Seringues jetables avec embouts Luer-Lok, 3 mL</td><td>FischerScientific</td><td>BD 309657</td><td>Pour filtrer les surnageants</td></tr><tr><td>Hémocytomètre à lignes brillantes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Appareil de comptage cellulaire</td></tr><tr><td>DPBS, 1x (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) avec calcium et magnésium</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>Utilisé dans le lavage des cellules</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Purification PMN</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipettes sérologiques jetables en polystyrène</td><td>stérile FischerScientific</td><td>13-678-11E</td><td>Pour l’aspiration de liquide</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Plaques à 96 puits</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0687</td><td>Plaque pour la conservation d’échantillons expérimentaux</td></tr><tr><td>OMICRON Seringue Filtres</td><td>Omicron Scientific</td><td>SFPV13R</td><td>Pour filtrer les surnageants</td></tr><tr><td>Propidium iodure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td>Membrane imperméable à l’ADN colorant</td></tr><tr><td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-34503-24</td><td>Pour la culture cellulaire en croissance</td></tr><tr><td>RPMI 1640, 1X sans L-glutamine, rouge de phénol</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td>Utilisé dans la remise en suspension des cellules</td></tr><tr><td>Eau stérile pour l’irrigation, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7113</td><td>Purification</td></tr> <tr><td>PMNLa pompe à pipette</td><td>Bel-Art Products</td><td>F37898</td><td>Pour l’aspiration de liquide</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Contrôle positif de l’intégrité de la membrane</td></tr></tbody></table>

quantifier la cytotoxicité de staphyloccus aureus contre les leucocytes polymorphes humains

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus est capable de sécréter un large éventail de leucocidins qui ciblent et perturbent l'intégrité de la membrane des leucocytes polymorphes (PMN ou neutrophiles). Ce protocole décrit à la fois la purification des PMN humains et la quantification de la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN dans trois sections différentes. La section 1 détaille l'isolement des PMN et du sérum du sang humain à l'aide de centrifugation de densité. La section 2 teste la cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par S. aureus par rapport à ces PMN humains purifiés. La section 3 mesure la cytotoxicité par rapport aux PMN humains à la suite de la phagocytose de S. aureusvivant. Ces procédures mesurent la perturbation de l'intégrité de membrane de plasma de PMN par S. aureus leukocidins utilisant l'analyse de cytométrie d'écoulement des PMNs traités avec l'iodure de propidium, un fluorophore de liaison d'ADN qui est imperméable de membrane de cellules. Collectivement, ces méthodes ont l'avantage de tester rapidement la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains primaires et peuvent être facilement adaptées pour étudier d'autres aspects des interactions hôte-pathogène.

Nous avons démontré comment les procédures décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour quantifier relativement la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains utilisant LE SARM PFGE-type USA300 et un mutant de suppression isogénique de saeR/S dans cette souche (USA300MDsaeR/S) généré dans des études précédentes6. Les PMN isolés à l'aide des procédures décrites à la section 1 de ce protocole ont été tachés d'iodure de propidium et examinés à l'aide de la cytométrie du débit. Des parcelles de diffusion vers l'avant et latérales ont été utilisées pour illustrer la contamination des PMN purifiés par des monocytes ou des lymphocytes(figure 1A,B)et l'intégrité du PMN a été déterminée à l'aide de la coloration de l'iodure de propidium (figure 1C). La méthode décrite de purification humaine de PMN peut uniformément produire 0.5 x 107 à 1 x 108 PMNs qui sont 'gt;98% pur et sont 'gt;95% propidium iodide négatif.
La cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par USA300 et USA300SDsaeR/S a été testée contre des PMN purifiés (figure 2) suivant les procédures décrites à la section 2 de ce protocole. Ces expériences démontrent une augmentation dépendante de la concentration de la coloration de l'iodure de propidium des PMN purifiés après 30 minutes d'intoxication avec des protéines extracellulaires produites par USA300 (Figure 2B). Des études antérieures ont démontré que le système à deux composants SaeR/S est important pour l'expression de nombreuses leucocidines bicomposants qui ciblent les PMN humains6,10,11,16. Conformément à ces résultats antérieurs, très peu de PMN positifs à l'iodure de propidium ont été détectés à la suite d'une exposition à des protéines extracellulaires produites par USA300S/S (Figure 2B). D'autres expériences ont démontré une augmentation constante de la proportion de PMN lysés à la suite d'une intoxication par usa300 protéines extracellulaires qui ont plafonné après environ 30 min (figure 2C). Une lyse minimale des PMN humains a été notée à tous les momentssuivant l'exposition aux protéines extracellulaires produites par USA300S/S . Ces résultats illustrent l'utilité de cet analyse pour la quantification relative de la cytotoxicité par les protéines extracellulaires de S. aureus contre les PMN humains.
Nous avons testé USA300 et USA300MDsaeR/S en utilisant le test de cytotoxicité De S. aureus contre les PMN humains suivant la phagocytose qui est décrite dans la section 3 de ce protocole (figure 3). Une augmentation dépendante de la concentration de la proportion de PMN positifs à l'iodure de propidium a été observée 90 min après la phagocytose d'USA300 (figure 3A). Une diminution significative a été observée dans la proportion de PMN qui étaient positifs en iodure de propidium à la suite de la phagocytose de USA300MDsaeR/S (figure 3A), à l'appui d'autres résultats qui indiquent que le système à deux composants SaeR/S est important pour la cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains (Figure 2)7,11. Comme mentionné précédemment et démontré à la figure 3A, les différences dans la concentration de S. aureus ont un impact prononcé sur la lyse PMN à la suite de la phagocytose. L'énumération de l'inoculum USA300 et USA300MDsaeR/S utilisé dans chacune de ces expériences a démontré que le contraste de cytotoxicité entre ces souches n'était pas dû à des différences dans la concentration des bactéries utilisées (Figure 3B). Ces résultats montrent comment l'analyse de cytotoxicité de S. aureus contre les PMN humains suivant la phagocytose peut être employée pour évaluer la capacité des différentes souches de S. aureus à compromettre l'intégrité humaine de membrane de plasma de PMN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> Figure 1 : Analyse de cytométrie des flux des PMN purifiés. Des parcelles de points cytométrie représentatives de (A) ont purifié des PMN humains et (B) des PMN qui ont été volontairement contaminés par des cellules mononucléaires sanguines périphériques. (C) Histogramme de cytométrie de flux représentatif démontrant la coloration minimale d'iodure de propidium (lt;1%) des PMN purifiés (gris ombragé) par rapport aux PMN traités avec 0,05% De Triton X-100 (rouge ombragé). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> Figure 2 : Analyse de cytométrie de flux des PMN intoxiqués avec des protéines extracellulaires produites par S. aureus. (A) Histogramme de cytométrie de flux représentatif de PMNs tachés d'iodure de propidium après 30 min d'incubation avec contrôle des médias (bleu ombragé), supernatant USA300 filtré à une concentration finale de 1:110 (gris ombragé), ou 0,05% Triton X-100 (rouge ombragé). (B) La proportion de PMN positifs à l'iodide au propidium après 30 min d'incubation avec différentes concentrations de supernatants USA300 ou USA300-saeR/S. (C) La proportion de PMN positifs à l'iodide propidium au fil du temps après l'incubation avec USA300 ou USA300saeR/S supernatant à une concentration finale de 1:110. Les données sont présentées comme étant la moyenne de seM d'au moins 3 expériences distinctes avec un test t à deux queues, p. 0,05 et 0,005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> Figure 3 : Analyse de cytométrie de flux des PMN suivant la phagocytose de S. aureus. (A) La proportion de PROPidium iodide positif PMN 90 min après la phagocytose de différentes concentrations d'USA300 ou USA300SS/ S. (B) Concentration de souches opsonisées de S. aureus utilisées pour les expériences présentées dans le panneau A. Les données sont présentées comme moyennes - SEM de 4 expériences distinctes avec le test desaeR p 0,01 comme déterminé par le test à deux queues. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole décrit une méthode pour la purification des leucocytes polymorphes du sang humain entier et deux essais distincts qui quantifient la cytotoxicité de Staphylococcus aureus contre ces cellules immunitaires innées importantes.

Quantifier la cytotoxicité de Staphyloccus aureus contre les leucocytes polymorphes humains

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus est une bactérie gram-positive qui produit un large éventail de facteurs de virulence qui favorisent la pathogénie. Il s’agit notamment de leucotoxines bi-composants qui perturbent l’intégrité de la membrane des leucocytes polymorphonucléaires, également appelés PMN ou neutrophiles. Cette vidéo illustre l’isolement des PMN du sang entier humain et deux analyses distinctes pour quantifier la cytotoxicité de S.aureus contre ces cellules immunitaires innées importantes.Ces essais peuvent tous être accomplis avec l’équipement standard de laboratoire et sont facilement adaptables pour examiner d’autres aspects de l’interaction d’agent pathogène d’hôte. Ces expériences utiliseront du sang entier prélevé sur des donneurs humains et nécessiteront l’approbation du comité institutionnel ou du comité d’examen approprié, ainsi qu’une déclaration selon que tous les participants ont obtenu un consentement éclairé. La première étape de cette procédure est l’isolement des neutrophiles par l’utilisation de gradients de centrifugation et de densité.Tout d’abord, apportez 50 millilitres de chlorure de sodium de 3 % dextran 0,9 %, 35 millilitres de chlorure de sodium à 0,9 %, 20 millilitres de chlorure de sodium à 1,8 %, 12 millilitres de 1,077 gramme par solution de ficoll millilitre et 20 millilitres d’eau à température ambiante. Transférer 25 millilitres de sang humain entier héparinisé fraîchement dessiné dans deux tubes de centrifugeuse conique. Combinez 25 millilitres de sang entier héparinisé fraîchement dessiné avec 25 millilitres volume équivalent de température ambiante, 3% dextran, chlorure de sodium de 0,9% dans un rapport un à un.Mélanger en berçant doucement chaque tube conique de 50 millilitres, puis laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes. Après incubation à température ambiante, deux couches distinctes apparaîtront. Transférer la couche supérieure de chaque mélange sanguin dextran dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres.Centrifugeuse à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante avec des pauses faibles ou sans pauses. Aspirez soigneusement les deux supernatants et jetez sans déranger les granulés cellulaires. Resuspendez doucement chaque granulé cellulaire en deux millilitres de chlorure de sodium de 0,9 %.Mélanger les granulés résuspendus en un seul conique de 50 millilitres, puis ajouter le chlorure de sodium restant de 0,9 % à un volume final de 35 millilitres. Sous-couche soigneusement 10 millilitres de 1.077 grammes par solution de ficoll millilitre sous la suspension de cellules utilisant une pipette de main. Après avoir tourné à 450 g pendant 30 minutes à température ambiante, avec des pauses faibles ou non, aspirez doucement le surnatant sans déranger la pastille cellulaire, comme indiqué précédemment.Lyse les globules rouges en réutilisant la pastille cellulaire dans 20 millilitres d’eau à température ambiante. Mélanger délicatement en berçant pendant 30 secondes. Ajouter immédiatement 20 millilitres d’échantillon de chlorure de sodium et de centrifugeuse de 1,8 % à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante.Aspirez soigneusement le surnatant comme indiqué auparavant. Resuspendez doucement la pastille cellulaire en RPMI à température ambiante de deux millilitres et placez-la sur la glace. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre.Resuspendez les PMN purifiés à une concentration d’une fois 10 à la 7ème cellule par millilitre avec rpmi froid de glace et maintenez sur la glace. Combinez 100 microlitres de PMNs purifiés avec 300 microlitres de DPBS, contenant un microlitre de tache d’iodure de propidium dans deux tubes de cytométrie d’écoulement de répétition. Pour un contrôle positif, ajouter 40 microlitres de 0,5%Triton X-100 solution dans l’un des tubes de cytométrie d’écoulement et mélanger complètement.Utilisez la cytométrie d’écoulement pour mesurer la dispersion vers l’avant, la dispersion latérale et la coloration de l’iodure de propidium pour déterminer la pureté et l’intégrité des PMN isolés. Seules les préparations PMN supérieures à 98% pures et supérieures à 95% de propidium iodode négatif doivent être utilisées. Pour le protocole décrivant l’isolement du sérum humain normal, se référer au manuscrit complet.Préparer une plaque de 96 puits pour les analyses de cytotoxicité PMN en ajoutant 100 microlitres de sérum humain isolé de 20% dilués avec DPBS à des puits individuels qui seront utilisés dans ce test. Assurez-vous d’inclure au moins un puits de contrôle négatif qui ne recevra que des médias et au moins un puits de contrôle positif qui recevra 0,05%Triton X.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, laver les puits codés deux fois avec 100 microlitres de DPBS glacé et placer la plaque sur la glace.Retirez tout DPBS résiduel des puits de plaque et ajoutez doucement 100 microlitres de PMNs humains purifiés à une fois 10 aux 7èmes cellules par millilitre à chaque puits codé. Laissez les neutrophiles plaqués se déposer en les laissant sur la glace pendant au moins cinq minutes avant de les utiliser dans les analyses de cytotoxicité suivantes. Cette section décrit un essai qui quantifie la cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par l’aureus de staphylocoque contre les PMN humains.Culture S.aureus nuit dans les médias appropriés à l’aide d’un incubateur secouant fixé à 37 degrés Celsius la veille de l’expérience. Sous-culture S.aureus en effectuant une dilution d’une à 100 cultures de bactéries du jour au lendemain avec des médias frais. Incuber à 37 degrés Celsius en secouant jusqu’à ce que les bactéries atteignent la phase de croissance stationnaire précoce.Après cinq heures de croissance, transférer un millilitre de sous-culture S.aureus dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et une centrifugeuse à 5000 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après centrifugation, aspirer les supernatants. Passer les supernatants aspirés à travers un filtre à seringues de 0,22 micron dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et placer sur la glace.Effectuer des dilutions en série de supernatants avec des supports glacés utilisés pour la culture staph aureus. Ajouter délicatement des échantillons de supernatants ou des supports prêtés pour des contrôles négatifs et positifs aux puits individuels d’une plaque de 96 puits contenant des PMN sur glace, comme décrit précédemment. Plaque de roche doucement pour distribuer les supernatants dans les puits et incuber à 37 degrés Celsius.Aux heures désirées, retirer la plaque de l’incubateur et la placer sur la glace. Ajouter 300 microlitres de DPBS glacé contenant un microlitre d’iodure de propidium à chaque tube de cytométrie d’écoulement. Transférer les échantillons dans des tubes de cytométrie sur la glace.Pour bien contrôler positif, ajouter 20 microlitres de 10% Triton X à l’échantillon avant de passer à un tube de cytométrie d’écoulement. Analyser la coloration du propidium iodure des PMN intoxiqués à l’aide de la cytométrie d’écoulement. Cette section décrit un essai qui quantifie la cytotoxicité de S.aureus suivant la phagocytose par pmns humains.Les courbes de croissance définies par la densité optique à 600 nanomètres et la concentration de bactéries doivent être déterminées pour les souches pertinentes de Staph aureus avant d’être utilisées dans cet essai. Commencez les cultures du jour au lendemain des souches de S.aureus et des bactéries de sous-culture, comme décrit précédemment. Une fois sous-cultivé Staph aureus a atteint la croissance mi-exponentielle, transférer un millilitre de bactéries de culture à 1,5 millilitre tube de microcentrifugeuse et centrifugeuse à 5000 g pendant cinq minutes à température ambiante.Laver S.aureus en aspirant son supernatant sans déranger la pastille et résuspendre les bactéries granulées à un millilitre DPBS. Vortex les échantillons pendant 30 secondes. Centrifuger les échantillons à 5000 g pendant cinq minutes à température ambiante.Pour oxyder Staph aureus, résusez d’abord la pastille bactérienne en un millilitre de sérum 20% humain. Puis incuber des échantillons à 37 degrés Celsius avec agitation pendant 15 minutes. Laver l’aureus oxénolisé de Staphylocoque après centrifugation comme indiqué précédemment.Diluer les souches oxénosées de Staphylocoque à une fois 10 à la 8e unité de formation de colonies, les UF par millilitre, avec un RPMI glacé. Vortex l’échantillon pendant 30 secondes et placer sur la glace. Confirmez les concentrations de Staphylocoque aureus utilisées pour ces analyses en placage d’une à 10 dilutions périodiques de bactéries sur l’agar.Ajouter délicatement 100 microlitres par puits de chaque souche staph aureus, ou RPMI pour les contrôles positifs et négatifs, aux PMN dans une plaque de 96 puits sur glace à partir de l’étape 1.14. Plaque de roche doucement pour distribuer Staph aureus dans les puits. Synchroniser la phagocytose par plaque centrifugeuse à 500 g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius et incuber la plaque à 37 degrés Celsius immédiatement après la centrifugation comme temps zéro.Aux points de temps désirés, mettez la plaque sur la glace et ajoutez 200 microlitres de DPBS glacé contenant un iodure de propidium de microlitre à chaque tube de cytométrie d’écoulement puis transférez des échantillons à leur tube correspondant. Analyser les échantillons pour la coloration de l’iodure propidium à l’aide de la cytométrie du débit tel que décrit dans 2,8 et 2,9. La transcription des leucotoxines bi-composants qui ciblent les PMN humains par Staph aureus exige que le système de composant sa ou S2 démontre l’utilité des analyses décrites pour quantifier la cytotoxicité d’aureus de Staaph contre les PMNs humains.Ces expériences ont été réalisées avec un isolat staph aureus cliniquement pertinent identifié comme USA300 chez un mutant isologénique de suppression de SA ou S dans cette souche. Le panneau gauche représente les PMN purifiés et le panneau droit représente des échantillons intentionnellement contaminés à titre d’exemple. Les PMN isolés à l’aide des procédures décrites dans la première section de ce protocole ont été tachés d’iodure de propidium et examinés à l’aide de cytométrie de débit.Des parcelles de dispersion vers l’avant et latérales ont été utilisées pour détecter la contamination des PMNs purifiés par les monocytes ou les lymphocytes pendant les années 1A et 1B. L’intégrité du PMN a été déterminée à l’aide de la coloration de l’iodure du propidium. En utilisant la méthode décrite de purification du PMN humain, nous pouvons constamment isoler cinq fois 10 à la 7ème à une fois 10 au 8ème PMNs qui sont plus de 98% purs et sont plus de 95% propidium iodure négatif.La cytotoxicité des protéines extracellulaires produites par USA300 et le mutant AsaeR/S a été testée contre les PMN purifiés. Ces expériences démontrent une augmentation dépendante de la concentration dans la coloration d’iodure de propidium des PMNs purifiés après 30 minutes d’intoxication avec des protéines extracellulaires produites par USA300, mais pas avec le mutant AsaeR/S. D’autres expériences ont démontré une augmentation constante de la proportion de PMNs positifs d’iodure de propidium suivant l’intoxication par usa300 protéines extracellulaires qui ont plafonné après approximativement 30 minutes.La coloration minimale d’iodure de propidium des PMNs humains a été notée à tous les points de temps suivant l’exposition aux protéines extracellulaires produites par le mutant d’AsaeR/S. Enfin, la cytotoxicité des mutants USA300 et AsaeR/S contre les PMN à la suite d’une phagocytose synchronisée a été testée, une augmentation dépendante de la concentration de la proportion de PMNs positifs à l’iodure propidium a été observée 90 minutes après la phagocytose d’USA300. Significativement moins de PMNs étaient propidium iodide positif suivant la phagocytose du mutant d’AsaeR/S.L’énumération de l’inoculum mutant USA300 et AsaeR/S a été utilisée dans chacune de ces expériences a démontré que le contraste dans la cytotoxicité entre ces souches n’était pas dû à des différences dans la concentration des bactéries utilisées. Ce protocole décrit les purifications des PMNs du sang humain dans deux techniques distinctes pour quantifier la cytotoxicité de S.aureus contre ces cellules immunitaires innées. Le succès de ces procédures dépendra de la qualité des PMN purifiés et de la préparation appropriée des bactéries ou des supernatants staph aureus.Veuillez consulter le manuscrit complet pour obtenir des points importants à prendre en considération lors de l’exécution de ces procédures. USA300 est un isolat virulent de SARM et la perte d’AsaeR/S réduit considérablement la transcription des facteurs de virulence qui ciblent les PMN humains, faisant de ces souches des modèles idéaux pour comparer la cytotoxicité à l’aide des analyses décrites. Il peut être nécessaire d’adapter les conditions de croissance, les volumes de supernatants ajoutés ou le rapport des bactéries aux PMN lors de l’utilisation d’autres souches de Staphylocoque.

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Essai de protection enzymatique amélioré pour étudier l’internalisation de Staphylococcus aureus et l’efficacité intracellulaire des composés antimicrobiens

Le présent protocole prépare et évalue les propriétés physiques, la réponse immunitaire et l’effet protecteur in vivo d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion.

Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

Staphylococcus aureus (S. aureus) a la capacité de se disséminer dans tout le corps, provoquant des infections persistantes et récurrentes. Pour mieux comprendre ces processus, cette étude établit un modèle d’infection intracellulaire pour S. aureus. Ce modèle fournira une base cruciale pour étudier les mécanismes à l’origine des infections intracellulaires.

Développement et évaluation de modèles d’infection intracellulaire pour Staphylococcus aureus

Découvrez comment isoler les PMN du sang humain et quantifier la cytotoxicité de Staphylococcus aureus par cytométrie en flux. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-pathogène avec une pureté cellulaire supérieure à 98%.

Quantifier la cytotoxicité de Staphyloccus aureus contre les leucocytes polymorphes humains

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