Une nouvelle boîte à outils pour évaluer les fonctions des gènes à l’aide de la stabilisation cas9 conditionnelle

Cette méthode fournit une édition rapide et à température contrôlée du gène CRISPR-Cas9 sous une petite molécule, Shield-1. Il offre également moins d’effets hors cible, une toxicité cellulaire plus faible et une édition de gènes contrôlée en interne plus élevée lorsqu’on la compare à l’activation constitutive de Cas9. Le principal avantage de cette particule est qu’elle peut être utilisée pour la caractérisation de gènes essentiels, ainsi que de gènes de survie tumorale.

La déstabilisation de DD-Cas9 est indépendante de son expression, ce qui permet au gène d’intérêt d’être co-exprimé sous le même promoteur. Cette méthode peut être facilement appliquée à des études in vivo et in vitro. Shield-1 peut également pénétrer à travers la barrière hémato-encéphalique, ce qui facilite également l’étude des gènes impliqués dans le développement du cerveau.

Ensemencez uniformément des cellules HEK293T saines à une densité d’un à deux millions de cellules par plaque de culture tissulaire de 10 centimètres en utilisant 10 millilitres de glucose DMEM avec 10% de FBS filtré. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 20 heures. Le lendemain, confirmez que les cellules ont atteint 70% de confluence par microscopie à fond clair et qu’elles sont uniformément dispersées sur la plaque.

Changez de support une heure avant la transfection avec un volume final de 10 millilitres. Préparez deux tubes avec 500 microlitres de milieu chaud. Ajouter 25 microlitres de réactif de transfection au premier tube et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

À l’autre tube, ajoutez un mélange de plasmides. Mélanger le tube un avec le tube deux pour former un mélange de transfection et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte aux cellules HEK293T et incuber la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire.

Après 18 heures, changez soigneusement le support à 10 millilitres de DMEM frais avec 10% FBS pour retirer le réactif de transfection. Incuber les cellules pendant les 48 heures suivantes. Après 48 heures, prélever le surnageant avec une seringue de 10 millilitres et le faire passer à travers un filtre de 0,45 micromètre.

Aliquotez le surnageant du virus et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer le titre du virus, ensemencez 5 millions de cellules HEK293T par puits dans deux plaques de six puits. Incuber les deux plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit pour atteindre 50 à 60% de confluence.

Le lendemain, utilisez l’une des plaques de six puits pour compter les cellules dans les six puits. Décongeler l’aliquote du virus qui sera utilisée pour effectuer la dilution en série et ajouter huit microgrammes par millilitre de réactif polybrène, préparer le DMEM avec 10% FBS pour la dilution en série du virus et ajouter le réactif polybrène. Préparer deux millilitres de dilutions en série décuplées du lentivirus de 0,1 à 0,0001 dans des milieux contenant du polybrene.

Retirer le milieu de la plaque de six puits et ajouter un millilitre de dilutions virales aux puits, en laissant un puits avec un milieu seul comme témoin négatif et un puits avec 100% de virus. Incuber les cellules pendant 24 heures. Le lendemain, retirez le support avec le virus des plaques à six puits et changez-le en deux millilitres de DMEM frais avec 10% FBS.

Incuber les cellules pendant 48 à 72 heures, en observant la GFP avec un microscope fluorescent tous les jours. Après 48 à 72 heures, détachez les cellules et ressuspendez-les dans un tampon maximal. Utilisez un cytomètre en flux pour déterminer le pourcentage d’expression de GFP et calculez le titre du virus à l’aide de la formule donnée dans le manuscrit textuel.

Plaquez la lignée cellulaire d’intérêt dans une plaque de 10 centimètres et incubez pendant la nuit pour atteindre une confluence de 50 à 60%Ensuite, infectez les cellules avec 500 à 2 000 microlitres de particules virales dans un volume total de 10 millilitres de milieu de culture. Incuber le milieu viral pendant 24 heures. Le lendemain, changez le milieu viral en milieu de culture et déterminez le pourcentage de cellules GFP positives en utilisant la cytométrie en flux.

Sélectionnez les cellules GFP positives à l’aide de BD FACSAria II pour le tri des cellules. Développez les cellules sélectionnées positivement et congelez le stock. Plaquez les cellules sélectionnées positivement et les cellules non transduisons dans des plaques de 12 puits séparément, 24 heures après l’infection.

Attendez que les cellules se fixent et changent le milieu en milieu de culture cellulaire contenant 200 nanomolaires Shield-1. Remplacez le support dans les plaques par des cellules transduies et non transduites, en laissant deux puits par plaque avec des supports réguliers comme contrôle négatif. Incuber et extraire les protéines de chaque puits à zéro, deux, six, 12, 24, 48 et 72 heures après avoir ajouté Shield-1 aux puits.

Ensuite, retirez le média avec Shield-1 du reste des puits et remplacez-le par un milieu cellulaire ordinaire. Recueillez les protéines de ces puits deux, six et 12 heures après avoir changé le média. L’induction de la protéine Cas9 a été confirmée par des niveaux d’expression similaires entre les cellules transduies et le véhicule, malgré la présence ou l’absence de Shield-1.

Il y a une induction suffisante de l’expression de Cas9 dans la lignée cellulaire A549 transduite deux heures après le traitement par Shield-1, qui devient négligeable dans les six à 12 heures suivant le retrait de Shield-1. Le nombre de cellules A549 transduisons par Shield-1 a diminué après 48 heures sans affecter l’échantillon de Rinella, ce qui a été validé par immunoblotting à l’aide d’un anticorps contre la protéine RPA3 appauvrie. L’inversion de l’édition de gènes ou les mutations de l’indel ont été confirmées à l’aide de tests de nucléases d’arpenteur.

La construction du vecteur lentivirus conçue était un système bicistronique portant un autre gène d’intérêt sous le même promoteur EF-1a. Une protéine fluorescente modifiée, P2A, a été ajoutée pour tracer les cellules infectées. L’expression de la protéine mVenus a été observée dans le véhicule et les cellules transduies A549, indépendamment de l’expression DD-Cas9 et du traitement Shield-1.

La transduction efficace de la lignée cellulaire avec le vecteur DD-Cas9 est l’une des étapes limitant le débit, pour avoir des cellules HEK293T saines et utiliser leur faible nombre de passage est crucial. L’optimisation du rapport entre le plasmide DD-Cas9, le plasmide d’emballage et le plasmide d’enveloppe est très importante pour une transfection optimale. Mais à côté, la quantité de Shield-1 nécessaire pour stabiliser les cellules cibles DD-Cas9 est également quelque chose dont vous devez faire attention.

Le DD-Cas9 avec le plasmide Cre est également disponible, et il peut être utilisé pour étudier les interactions génétiques dans des études in vivo basées sur le système Cre-lox.