Analyse de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par traversale microbienne à travers les cellules endothéliales microvasculaires

Cette méthode permet d’analyser la barrière céphalo-cérébrale humaine en mesurant la traversée bactérienne sur différents traitements. Il peut aider à découvrir la pathogénie de la méningite bactérienne et du délire postopératoire. Il s’agit d’une méthode simple et les effets du traitement sont directement représentés par le nombre de bactéries.

Il peut être modifié pour permettre une analyse à haut débit des composés sur les cellules endothéliales. Commencez par assembler la plaque de 12 puits dans une armoire de sécurité biologique. Déballez la plaque et chaque insert, puis utilisez des forceps stérilisés pour saisir les inserts à leur base et les mettre dans les puits.

Enduire la membrane poreuse de chaque insert de 90 microlitres de 10 microgrammes par microlitre de collagène IV et de mélange de fibronectine et incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, lavez les inserts deux fois en pipetant un millilitre de PBS dans chaque insert et en l’aspirant à l’utilisation d’une pompe à vide. Ensuite, équilibrer les membranes par pipetting préchauffé DMEM F12 milieu dans les chambres supérieures et inférieures et incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Pour ensemencer les cellules endothéliales microvasculaires humaines, aspirez le milieu de la fiole de culture cellulaire et lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Couvrir complètement les cellules de cinq millilitres de trypsine EDTA et incuber le flacon pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Transférer cinq millilitres des cellules dans un tube de 15 millilitres et ajouter cinq millilitres de FCS contenant du milieu pour arrêter la réaction enzymatique.

Centrifuger la suspension pendant trois minutes à 210 fois g, enlever le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en cinq millilitres de milieu. Ajouter 10 microlitres de la suspension cellulaire à 10 microlitres de 0,4% de tache bleue trypan, puis ajouter 10 microlitres du mélange à une chambre de comptage. Mettez la chambre de comptage dans le compteur cellulaire et commencer le programme approprié en s’assurant que le compteur est concentré.

Après compter, grainez 200 000 cellules dans chaque chambre haute sur la plaque de 12 puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 14 jours en changeant les médias dans la chambre haute et inférieure tous les deux à trois jours. Après 14 jours, assurez-vous que la confluence cellulaire est 100% en les écreant avec un microscope. Un jour avant la mesure de la perméabilité, placez une colonie de souches d’E.coli GM2163 en trois millilitres de moyenne LB.

Culture des cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans un shaker d’incubation. Pour traiter les cellules avec un composé d’intérêt, diluer à sa concentration finale dans le milieu DMEM F12 et ajouter ce mélange dans les chambres supérieures et inférieures dans la plaque de 12 puits, puis incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Après l’incubation, échanger le milieu complet avec un milieu sans antibiotiques.

Déterminer la concentration de la culture bactérienne nocturne en mesurant sa densité optique à 600 nanomètres, puis la diluer à un OD600 de 0,5 dans un tube Falcon de 50 millilitres. Dans un cabinet de sécurité biologique, ajouter 450 microlitres de la solution bactérienne dans chaque chambre supérieure de la plaque de 12 puits, puis incuber la plaque pendant six heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirer l’insert avec des forceps et échantillonner 50 microlitres du milieu de chaque chambre basse en prenant soin de ne pas renverser le milieu des chambres supérieures dans les chambres inférieures.

Il est important de séparer strictement les médias de la chambre haute et inférieure, car un débordement des bactéries de la chambre haute entraînerait de faux résultats positifs. Déposez chaque échantillon sur une plaque d’agar séparée et striez la solution à l’à l’l’œur d’un éperon cellulaire. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, puis compter les colonies.

Pour étudier l’effet de la glycation sur le traversal microbien par la barrière hébra-encéphalique, les cellules ont été traitées avec un 0,5 et une solution glyoxale millimolaire de 0,15 millimolar pendant une heure avec des cellules non traitées servant de contrôle. La glycation a ensuite été détectée par immunoblotting avec des anticorps anti-ÂGE. Les colonies bactériennes obtenues ont été comptées et représentées comme le nombre absolu de colonies ou le nombre relatif de colonies normalisées au contrôle.

Les échantillons traités au glyoxal présentaient un nombre accru de colonies indiquant que le traitement a un effet sur la densité des barrières cellulaires. Pour étudier la glycation induite par le glucose, les THBMECs ont été cultivés dans le glucose normal et le milieu élevé de glucose. Le nombre absolu de colonies et le nombre relatif de colonies normalisées à la lutte ont indiqué que le glucose n’avait aucun effet significatif sur l’intégrité de la barrière céphalo-encéphalique.

Les cellules endothéliales traitées peuvent être analysées davantage par des approches protéomiques, par exemple la spectrométrie de masse, pour analyser les changements du protéome. Cette technique aide à comprendre la barrière céphalo-cérébrale humaine et la traversée bactérienne. Il peut être utilisé pour découvrir des aspects du vieillissement et des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer.