Name: Dépistage et identification des suppresseurs de silençage de lARN des agents deffets sécrétés des pathogènes végétaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Découvrez une méthode de criblage modifiée pour identifier rapidement les suppresseurs de silençage de l'ARN chez les agents pathogènes des plantes. Cette technique améliore l'efficacité et la précision des analyses de dépistage.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du « Programme Shuguang » de la Shanghai Education Development Foundation et de la Shanghai Municipal Education Commission, le National Key Research and Development Program of China National Key R-D Program of China ( 2018YFD0201500), la National Natural Science Foundation of China (no. 31571696 et 31660510), le Programme des Mille Talents pour les Jeunes Professionnels de Chine et la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (18DZ22660500).

REMARQUE : Toutes les étapes de la procédure doivent être effectuées à température ambiante (RT).
CAUTION: Déposer tous les supports contenant des microbes pathogènes, ainsi que les plantes et les tissus végétaux utilisés dans l'analyse, dans les conteneurs de déchets appropriés et autoclave avant de jeter.
1. Préparation de constructions plasmides contenant des effecteurs putatifs
<ol><li>Sélectionnez les effecteurs sécrétés putatifs qui sont fortement exprimés pendant l'infection, tel que déterminé par le séquençage d'ARN (ARN-Seq), et plus loin par la technique quantitative de PCR en temps réel (qRT-PCR).</li>
	<li>Déterminer le site de clivage peptide de signal de chaque effecteur à l'aide d'un outil logiciel tel que SignalP18.</li>
	<li>Concevoir des amorces et effectuer PCR pour amplifier le gène codant l'effecteur d'intérêt à l'aide de polymérase d'ADN haute fidélité. Effectuer l'électrophorèse gel agarose pour vérifier le produit PCR, puis cloner l'amplicon dans Gateway entrée vector pQBV3 en utilisant le kit de clonage sans ligature (Tableau des matériaux), et par la suite dans le vecteur d'expression de destination pEG100 en utilisant la réaction de recombinaison LR19.</li>
	<li>Transformez le mélange de réaction LR en 100 oL de cellules E. coli compétentes (p. ex. TOP10, DH5MD), répandez les cellules bactériennes transformées sur le milieu d'agar Luria-Bertani (LB) complété par une kanamycine de 50 g/mL, et incubez à 37 oC pendant 16 à 20 h. REMARQUE : Les transformateurs positifs peuvent être identifiés par la colonie PCR20 et analysés plus en détail par minipréparation et séquençage plasmides.</li>
	<li>Introduire 50 à 100 ng de plasmides recombinants transportant des protéines effectrices dans 100 l de cellules A. tumefaciens chimiquement compétentes (p. ex. GV3101 ou C58C1), mélanger délicatement, puis congeler dans de l'azote liquide pendant 1 min. Dégeler les cellules dans un bain d'eau de 37 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 500 lde de bouillon LB et incuber à 30 oC pendant 4 à 6 h avec des secousses douces, puis transférer et étendre toutes les cellules d'agrobactéries sur le milieu de l'agar LB complétée s'ajouter à 50 g/mL de kanamycine et 50 g/mL de rifampicin à 30 oC pendant 2 jours. REMARQUE : Les clones positifs peuvent être vérifiés par la colonie PCR.</li>
	<li>Utilisez une seule colonie transformée pour des expériences d'agro-infiltration, sauf indication contraire. REMARQUE : Dans la présente recherche, aucun des gènes effecteurs testés ne contenait d'introns prédits; chacun des gènes a été directement amplifié à partir de l'ADN génomique d'un isolat phytophthora sojae. Un vecteur d'expression de plante Gateway sans aucune étiquette est recommandé, mais pas nécessaire.</li>
</ol>2. Préparation des plantes N. benthamiana 16c
<ol><li>Préparer des mélanges de sol en pot composés de (en volume) 50% de mousse de tourbe, 30% de perlite, et 20% de vermiculite, et autoclave à 120 oC pendant 20 min.</li>
	<li>Tremper les mélanges de sol autoclave avec la solution d'engrais végétaux (1 g/L) et les sous-emballer dans des pots plus petits (80 mm x 80 mm x 75 mm) stockés dans un plateau plus grand (540 mm x 285 mm x 60 mm).</li>
	<li>Semez une ou deux graines de N. benthamiana 16c sur la surface du sol de chaque pot. Couvrir le plateau d'un dôme en plastique et laisser germer les graines.</li>
	<li>Placer le plateau sous des chambres de croissance légères et à température contrôlée avec une température de 23 à 25 oC, une humidité relative de 50 à 60 % et une photopériode longue journée (14 h de lumière/10 h d'obscurité, avec un éclairage à 130 à 150 degrésE -2s-1).</li>
	<li>Enlevez le dôme en plastique après la germination des graines (3 à 4 jours) et laissez les semis pousser dans les mêmes conditions que pour l'étape de germination.</li>
	<li>Ajouter une quantité appropriée d'eau, en gardant le sol humide, mais sans trempage, tous les deux à trois jours; ajouter de l'engrais tous les 10 jours pour favoriser la croissance. Maintenir les plantes N. benthamiana 16c dans des conditions normales jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi; à ce stade, la plante devrait avoir au moins cinq feuilles vraies entièrement développées et aucun bourgeon axillaire ou floral visible, et les feuilles devraient avoir un aspect vert sain).</li>
	<li>Utilisez des feuilles de N. benthamiana 16c pour les analyses de silençage de l'ARN locales et de jeunes plantes N. benthamiana 16c (10 à 14 jours) pour les analyses de silençage de l'ARN systémique. REMARQUE : Les conditions de croissance des installations et les installations varient d'un laboratoire à l'autre; choisir des feuilles saines, bien développées et entièrement élargies pour l'infiltration.</li>
</ol>3. Préparation de la culture Agrobacterium pour l'infiltration
<ol><li>Choisissez une colonie positive de la plaque LB et inoculez les cellules dans un tube de verre contenant 5 ml de lb-moyen complété par une kanamycine de 50 g/mL et une rifampicine de 50 g/mL. Cultivez les cellules à 30 oC en secouant à 200 tr/min pendant 24 à 48 h.</li>
	<li>Transférer 100 l de culture dans 5 ml de lb-moyen complété par les mêmes antibiotiques, 10 mM 2-(N-morpholino) d'acide éthanesulfonique (MES; pH 5,6) et 20 'M acetosyringone (AS). Cultivez des bactéries à 30 oC en secouant à 200 tr/min pendant 16 à 20 h.</li>
	<li>Centrifugeuses cellules à 4 000 x g pendant 10 min. Verser le supernatant et resuspendre la pastille dans 2 ml de 10 mM MgCl2 tampon.</li>
	<li>Répétez l'étape 3.3 pour assurer l'élimination complète des antibiotiques.</li>
	<li>Déterminer la densité de la culture Agrobacterium en mesurant la densité optique à 600 nm (OD600). Ajuster à un OD600 de 1,5 à 2,0 avec 10 mM de tampon MgCl2.</li>
	<li>Ajouter 10 mM MES (pH 5.6) et 150 'M AS aux cultures de suspension finale et incuber les cellules à RT pendant au moins 3 h sans trembler. REMARQUE: Ne laissez pas les cultures de suspension finale du jour au lendemain.</li>
</ol>4. Co-infiltration N. benthamiana feuilles
<ol><li>Mélanger des volumes égaux d'une culture Agrobacterium contenant 35S-GFP avec une culture Agrobacterium contenant 35S- concombre mosaïque virus suppresseur 2b (CMV2b), effecteur putatif, ou vecteur vide (EV).</li>
	<li>Infiltrer soigneusement et lentement les suspensions d'agrobacterium mixtes sur les côtés abaxiaux des feuilles de N. benthamiana 16c à l'aide d'une seringue sans aiguille de 1 ml.</li>
	<li>Retirez la suspension bactérienne restante des feuilles avec des essuie-glaces mous et encerclez les marges des patchs infiltrés avec un stylo de fabricant.</li>
	<li>Laissez les plantes infiltrées dans la chambre de croissance dans les mêmes conditions de croissance. REMARQUE : Pour des raisons de sécurité et de santé, des lunettes de protection et un masque doivent être portés pendant l'infiltration. Pour prévenir la contamination croisée, les gants doivent être changés ou stérilisés avec de l'éthanol entre les infiltrations. Normalement, au moins 1 ml de suspensions d'agrobacterium par feuille est nécessaire pour l'infiltration. Pour le silence systémique, au moins deux feuilles seront nécessaires pour l'infiltration.</li>
</ol>5. Analyse d'imagerie GFP
<ol><li>Détecter visuellement la fluorescence du GFP dans les feuilles nouvellement cultivées de plantes entières 2 semaines après l'infiltration (pour le silençage systémique de l'ARN) ou des plaques infiltrées de feuilles 3-4 dpi à l'aide d'une lampe ultraviolette à ondes longues (UV) sans prélèvement de feuilles.</li>
	<li>Photographie de plantes et/ou de feuilles détachées avec un appareil photo numérique équipé de filtres UV et jaunes. REMARQUE : Pour les essais de suppression locale de silence, enquêter sur les taches infiltrées des feuilles de N. benthamiana 16c, tandis que pour l'activité systémique de suppression de silence, enquêter sur les feuilles nouvellement cultivées. L'activité de suppression de silençage d'ARN peut varier selon les effecteurs individuels. Par conséquent, observez les taches ou les feuilles sur quelques jours à partir de 3 dpi. Utilisez cMV2b et EV comme contrôles positifs et négatifs, respectivement.</li>
</ol>6. Analyse de tache nordique des niveaux d'ARNm de GFP dans les feuilles infiltrées
<ol><li>Isolement de l'ARN total du tissu foliaire à l'aide du réactif d'isolement de l'ARN (Tableau des matériaux)<ol>
<li>Recueillir les tissus foliaires des patchs Infiltrés de N. benthamiana 16c à 4 x 7 dpi, pulvériser dans l'azote liquide en poudre fine, et transférer la poudre dans un tube stérile de 2 ml.</li>
		<li>Ajouter le réactif d'isolement de l'ARN (1 mL/100 mg de tissu) immédiatement au tube échantillonné dans une hotte, secouer vigoureusement pour homogénéner, et couver à RT pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter le chloroforme (200 l/1 mL de réagent d'isolement de l'ARN) à chaque tube d'un capot, secouer vigoureusement pendant 15 s et couver à RT pendant 5 min. Centrifuger l'homogénéisation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC.</li>
		<li>Transférer le supernatant dans un nouveau tube sans RNase et jeter la pastille. Ajouter 0,7 volume d'isopropanol au supernatant, inverser doucement plusieurs fois, et incuber le mélange à RT pendant 10 min.</li>
		<li>Précipiter le granule d'ARN par centrifugation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC.</li>
		<li>Jeter le supernatant, laver le granule avec 70% d'éthanol et sécher à l'air le granule dans une hotte. Dissoudre l'ARN dans l'eau traitée au pyrocarbonate de diethyl (DEPC) en coucubissant dans un bain d'eau de 65 oC pendant 10 à 20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse de tache nordique du niveau d'ARNm de GFP dans les feuilles infiltrées<ol>
<li>Préparer un gel agarose dénaturant le formaldéhyde de 1,2 % dans un tampon de fonctionnement MOPS 1x.</li>
		<li>Mélanger l'ARN 1:1 avec le colorant de chargement d'ARN et la dénature par incubation à 65 oC pendant 10 min, refroidir immédiatement les échantillons dénaturés sur la glace pendant 1 min.</li>
		<li>Chargez les échantillons sur le gel et l'électrophorese à 100 V pendant 50 min jusqu'à ce que l'ARN soit bien séparé.</li>
		<li>Rincez le gel dans un tampon 20x de citrate saline-sodium (SSC) pour enlever le formaldéhyde et transférez le gel à la membrane de nylon par transfert capillaire dans le tampon 20x SSC pendant la nuit. Tremper la membrane dans 2x SSC et fixer l'ARN à la membrane en exposant la membrane humide à la liaison transversale UV.</li>
		<li>Ajouter la quantité appropriée de tampon d'hybridation (10 ml par 100 cm2 membrane; Tableau des matériaux) dans un tube d'hybridation et agiter à 60 oC dans un four d'hybridation.</li>
		<li>Mettre la membrane dans le tube d'hybridation et couver pendant 60 min à 60 oC. Diluer une sonde d'ADN étiquetée 5'DIG (concentration finale, 50 ng/mL) dans la solution d'hybridation contenant un tampon d'hybridation préchauffé.</li>
		<li>Jetez le tampon de préhybridation et remplacez immédiatement par une solution d'hybridation préchauffée contenant la sonde étiquetée DIG. Incuber la tache avec la sonde à 60 oC pendant la nuit, avec une douce agitation.</li>
		<li>Après l'hybridation, laver la membrane deux fois en tampons de la rigueur croissante à 60 oC pendant 20 min chacun. Essuyer doucement la membrane pour enlever le tampon de lavage supplémentaire et ajouter des réactifs comme suggéré dans le kit d'hybridation et de détection chemiluminescente (Tableau des matériaux).</li>
		<li>Détecter les signaux hybrides par réaction chemiluminescente combinée avec le système d'imagerie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de défense clé utilisé par les plantes pour lutter contre les agents pathogènes viraux, bactériens, oomycètes et fongiques. À leur tour, ces microbes ont évolué des protéines suppressrices de silençage pour contrecarrer le silençage antiviral, et ces RSS interfèrent avec différentes étapes de la voie de silençage de l'ARN22,23. Plusieurs tests de dépistage ont été élaborés pour identifier les RSS10.</...

Au cours des deux dernières décennies, l'accélération du séquençage du génome des micro-organismes qui causent les maladies des plantes a conduit à un écart de connaissances de plus en plus important entre l'information sur la séquence et les fonctions biologiques des protéines codées1. Parmi les molécules révélées par les projets de séquençage sont des molécules effectrices qui suppriment l'immunité innée et facilitent la colonisation de l'hôte; ces facteurs sont sécrétés par des agents pathogènes végétaux destructeurs, y compris les bactéries, les nématodes et les microbes filamenteux. Pour répondre à ces menaces, les plantes hôtes ont développé de nouveaux récepteurs qui reconnaissent ces effecteurs, permettant la restauration de la réponse immunitaire. Par conséquent, les effecteurs sont soumis à diverses pressions sélectives, ce qui conduit à la diversification des répertoires effecteurs parmi les lignées pathogènes2. Ces dernières années, il a été démontré que les effecteurs putatifs des pathogènes végétaux perturbent l'immunité innée des plantes en empêchant les processus cellulaires de l'hôte de bénéficier aux microbes de diverses façons, y compris la dysrégulation des voies de signalisation, la transcription, le transport intracellulaire, la stabilité du cytosquelette, le trafic de vésicules et le silençage de l'ARN3,4,5. Cependant, la grande majorité des effecteurs pathogènes, en particulier ceux des agents pathogènes filamenteux, sont restés énigmatiques.
Le silençage de l'ARN est une machinerie d'inactivation génique médiée par l'homologie qui est conservée chez les eucaryotes. Le processus est déclenché par de longs ARN à double brin (dsRNA) et cible l'ARN homologue à brin unique (ARS) d'une manière spécifique à la séquence, et il manipule un large éventail de processus biologiques, y compris la défense antivirale6. Pour surmonter les réponses immunitaires innées de l'hôte, certains virus ont évolué pour compenser le silençage de l'ARN, y compris la capacité de se répliquer à l'intérieur des compartiments intracellulaires ou de s'échapper du signal réorganisé au silençage. Néanmoins, la stratégie la plus générale par laquelle les virus protègent leurs génomes contre la perte dépendante du silençage de l'ARN de la fonction génique est d'encoder des protéines spécifiques qui suppriment le silençage de l'ARN7,8. Plusieurs approches mécanistes différentes ont été établies pour dépister et caractériser les suppresseurs viraux du silençage de l'ARN (RsS), y compris la co-infiltration des cultures tumefaciens Agrobacterium, les plantes transgéniques exprimant les suppresseurs putatifs, la greffe et la culture cellulaire9,10,11,12,13.
Chacun de ces essais présente des avantages et des inconvénients et identifie les RsV de façon distincte. L'une des approches les plus courantes est basée sur la co-infiltration de cultures individuelles A. tmuefaciens hébergeant la protéine virale potentielle et un gène reporter (protéine fluorescente typiquement verte [GFP]) sur les plantes Nicotiana benthamiana 16c exprimant constitutivement GFP sous le contrôle du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S promoteur. En l'absence d'un suppresseur de silençage viral actif, le GFP est identifié comme exogène par les cellules hôtes et est réduit au silence dans les 3 jours suivant l'infiltration (dpi). En revanche, si la protéine virale possède une activité de suppression, le niveau d'expression du GFP reste stable au-delà de 3 à 9 dpi9. Ce test de co-infiltration est simple et rapide; cependant, il n'est ni très stable ni sensible. Néanmoins, l'assay a identifié de nombreux RsV avec diverses séquences et structures de protéines dans de nombreux virus de l'ARN7,8.
Récemment, plusieurs protéines effectrices qui peuvent inhiber l'activité de silençage de l'ARN cellulaire ont été caractérisées par des pathogènes bactériens, oomycètes et plantes fongiques14,15,16. Ces résultats impliquent que la suppression de silençage d'ARN est une stratégie commune pour faciliter l'infection qui est employée par des agents pathogènes dans la plupart des royaumes. En théorie, beaucoup, sinon tous, des effecteurs pourraient encoder suppresseurs de silençage d'ARN (RSSs); à ce jour, cependant, seuls quelques-uns ont été identifiés, principalement en raison de la pénurie de la stratégie de dépistage fiable et générale. En outre, les suppresseurs du silençage d'ARN n'ont pas été étudiés dans la grande majorité des pathogènes végétaux17.
Dans ce rapport, nous présentons un protocole optimisé et général pour identifier les effecteurs d'agents pathogènes végétaux qui peuvent supprimer le silençage local et systémique d'ARN utilisant l'analyse d'agro-infiltration. L'objectif principal de cette étude était de mettre l'accent sur les aspects clés du protocole et de décrire les étapes en détail, fournissant ainsi un test de dépistage qui convient à presque tous les effecteurs d'agents pathogènes végétaux.

<table><tbody><tr><td>Acide 2-morpholinoéthanesulfonique (MES)</td><td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) Acide propanesulfonique (MOPS)</td><td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>Tampon MOPS</td></tr><tr><td>Acétosyringone (AS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Induction de la</td></tr><tr><td>gélose</td> <td>AgrobacteriumSigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>Électrophorèse</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern blot</td></tr><tr><td>Amersham Imager GE</td><td>Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Image</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extraction</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB</td></tr><tr><td>moyen Appareil photo</td><td>Nikon</td><td>D5100</td><td>Photographie</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Système d’imagerie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Module de détection chimiluminescente composant des kits dafa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>Détection de luminescence</td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>Ligation</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11603558001</td><td>Tampon d’hybridation</td></tr><tr><td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td><td>TransGen Biotech</td><td>EM101-02</td><td>Extraction de plasmide</td></tr><tr><td>EasyPure Quick Gel Extraction</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>Extraction de gel</td></tr><tr><td>EDTA sel disodique dihydraté</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS Tampon</td></tr><tr><td>Électrophorèse Alimentation</td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>Électrophorèse d’acide nucléique.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>Digestion vectorielle</td></tr><tr><td>Système d’image sur gel</td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>Image</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>Antibiotiques Sulfate</td></tr><tr>de<td>kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>LR Clonase II enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>LR</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane buvard 0,45 um</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>Nord</td></tr><tr><td>NORTH2south biotine aléatoire premier dna labeling kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>Étiquetage de la biotine</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Thermocycleurs Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Tourbe</td><td>PINDSTRUP</td><td>Or foncé + argile</td><td>Plantes</td></tr><tr><td>Peters Engrais hydrosoluble</td><td>ICE</td><td>Peter Engrais professionnel 20-20-20</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity ADN polymérase</td><td>Vazyme</td><td>Biotech P505-d1</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>rifampicine</td><td>MP Biomedicals</td><td>219549005</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel d’ARN (2X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>Colorant de chargement de gel d’ARN</td></tr><tr><td>Acétate de sodium hydraté</td><td>Amresco / VWR</td><td>0530-1KG</td><td>Tampon</td></tr> <tr>MOPS<td>Chlorure de sodium</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB moyen</td></tr><tr><td>Citrate tri-sodique</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>Tampon SSC</td></tr><tr><td>Réactif Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>réactif d’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP B-100AP</td><td>Observation</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker Four</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Nord</td></tr></tbody></table>

dépistage et identification des suppresseurs de silençage de l'arn des agents d'effets sécrétés des pathogènes végétaux

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de régulation génétique spécifique à la séquence conservé par évolution chez les eucaryotes. Plusieurs pathogènes végétaux ont développé des protéines avec la capacité d'inhiber la voie de silençage de l'ARN de la plante hôte. À la différence des protéines d'effecteur de virus, seulement plusieurs protéines d'effectrice sécrétées ont montré la capacité de supprimer le silençage d'ARN dans les agents pathogènes bactériens, de oomycète, et de fongique, et les fonctions moléculaires de la plupart des effecteurs restent largement inconnues. Ici, nous décrivons en détail une version légèrement modifiée de l'assay de co-infiltration qui pourrait servir de méthode générale pour observer le silençage d'ARN et pour caractériser des protéines effectorssées par des pathogènes végétaux. Les étapes clés de l'approche sont le choix des feuilles saines et entièrement développées, l'ajustement de la culture bactérienne à la densité optique appropriée (OD) à 600 nm, et l'observation de la fluorescence des protéines fluorescentes vertes (GFP) au moment optimal sur l'infiltré pour éviter d'omettre les effecteurs ayant une faible activité de suppression. Ce protocole amélioré contribuera à un dépistage rapide, précis et étendu des suppresseurs de silençage de l'ARN et servira d'excellent point de départ pour étudier les fonctions moléculaires de ces protéines.

Ci-dessus, nous décrivons la procédure étape par étape pour un test de dépistage amélioré pour évaluer l'activité RSS des effecteurs P. sojae RxLR. Au total, l'expérience dure de 5 à 6 semaines. Par la suite, les RSS identifiés par l'analyse peuvent être caractérisés en termes de fonction et de mécanisme moléculaire. Comme exemple de notre approche, nous avons utilisé le P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppresseur du silençage 1 (PSR1), qui est sécrété et livré dans l...

Ici, nous présentons une méthode de criblage modifiée qui peut être employée intensivement pour examiner rapidement des suppresseurs de silençage d'ARN dans les agents pathogènes de plante.

Dépistage et identification des suppresseurs de silençage de l'ARN des agents d'effets sécrétés des pathogènes végétaux

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon de filtrer les suppresseurs de silencing ARN sécrètent par des agents pathogènes végétaux. Le principal avantage de cette technique est de fournir un test de dépistage rapide, précis et étendu pour l’identification des suppresseurs de silencing ARN. Préparer des mélanges de terre en pot composés de 50 % de mousse de tourbe, de 30 % de perlite et de 20 % de vermiculite et d’autoclave à 120 degrés Celsius pendant 20 minutes.Faire tremper les mélanges de sol autoclavés avec la solution d’engrais végétal à un gramme par litre et les sous-emballage dans de plus petits pots stockés dans un plus grand plateau. Semer une ou deux graines de Nicotiana bethamiana 16c sur la surface du sol de chaque pot. Couvrir le plateau d’un dôme en plastique et laisser germer les graines.Placez le plateau sous des chambres de croissance légères et à température contrôlée avec une température de 23 à 25 degrés Celsius, une humidité relative de 50 à 60 % et une longue journée de photopériod. Après trois à quatre jours, les graines germent. Enlever le dôme en plastique et permettre aux semis de croître dans les mêmes conditions utilisées pour l’étape de germination.Tous les deux à trois jours, ajouter une quantité appropriée d’eau pour garder le sol humide, mais pas tremper. Tous les 10 jours, ajouter de l’engrais pour favoriser la croissance. Maintenir les plantes Nicotiana bethamiana 16c dans des conditions normales jusqu’à ce que les plantes aient au moins cinq vraies feuilles entièrement développées sans bourgeons axillaires ou floraux visibles et que les feuilles aient un aspect vert sain.Utilisez des plantes Nicotiana bethamiana 16c de 10 à 14 jours pour des analyses systémiques de silencing d’ARN et des feuilles de trois à quatre semaines de Nicotiana bethamiana 16c pour des analyses locales de silencing d’ARN. Utilisez une pointe pour choisir une colonie positive de la plaque LB et inoculer les cellules dans un tube de verre contenant cinq millilitres de LB moyen complété par 50 microgrammes par millilitre kanamycine et 50 microgrammes par millilitre Rifampicin. Faire croître les cellules à 30 degrés Celsius en secouant à 200 RPM pendant 24 à 48 heures.Transférer 100 microlitres de la culture en cinq millilitres de LB moyen complété par les mêmes antibiotiques, 10 millimilliles MES au pH 5,6, et 20 micromolaire AS. Faire croître la bactérie à 30 degrés Celsius en secouant à 200 RPM pendant 16 à 20 heures. Centrifuger les cellules à 4000 fois g pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de chlorure de magnésium de 10 millimaux.Répétez le lavage pour assurer l’élimination complète des antibiotiques. Déterminer la densité de la culture Agrobacterium en mesurant la densité optique à 600 nanomètres. Ajustez la culture cellulaire avec un tampon de chlorure de magnésium de 10 millimlaires à un OD 600 de 1,5 à 2,0.Ajouter 10 millimilliles MES au pH 5.6 et 150 micromolaires AS à la culture finale de suspension et incuber les cellules à température ambiante pendant au moins trois heures sans trembler. Mélanger des volumes égaux d’une culture Agrobacterium contenant 35S protéines fluorescentes vertes avec une culture Agrobacterium contenant 35S concombre mosaïque suppresseur de virus 2b, effecteur putatif ou vecteur vide. À l’aide d’une seringue sans aiguille d’un millilitre, infiltrez soigneusement et lentement les suspensions agrobactériennes mélangées sur les côtés abaxiaux des feuilles de Nicotiana bethamiana 16c.Retirez le reste de la suspension bactérienne des feuilles avec des lingettes de tissus mous et encerclez les marges des plaques infiltrées à l’aide d’un stylo marqueur. Trois à quatre jours après l’infiltration, utilisez une lampe ultraviolette à ondes longues pour détecter visuellement la fluorescence GFP dans les plaques infiltrées des feuilles. Deux semaines après l’infiltration, utilisez la lampe pour détecter les feuilles nouvellement cultivées de toute la plante pour le silencing systémique d’ARN.Pour isoler l’ARN total du tissu foliaire à quatre à sept jours après l’infiltration, recueillir les tissus foliaire des plaques nicotiana bethamiana 16c infiltrées dans un mortier. Placer l’azote liquide dans le mortier et moudre le tissu en poudre fine à l’aide d’une tige de broyage et transférer la poudre dans un tube stérile de deux millilitres. Ajouter immédiatement le réageni d’isolement de l’ARN au volume d’un millilitre par 100 milligrammes de tissu au tube de l’échantillon dans une hotte, vortex vigoureusement pour homogénéiser, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Ajouter du chloroforme au volume de 200 microlitres par millilitre de réaccente d’isolement arn à chaque tube du capot, agiter vigoureusement pendant 15 secondes et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugeuse l’homogénéisation à 12 000 fois g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un nouveau tube sans RNase et jeter la pastille.Ajouter 0,7 volume d’isopropanol au supernatant, inverser délicatement plusieurs fois et incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes. Précipitez la pastille d’ARN par centrifugation à 12 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnatant.Laver la pastille avec 70% d’éthanol et sécher à l’air le granulé dans une hotte. Dissoudre l’ARN dans de l’eau traitée au pyrocarbonate de désyle en couveant dans un bain d’eau de 65 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes. Pour effectuer l’analyse de tache nordique des niveaux d’ARN messager de GFP, préparez un gel d’agarose de denarose de denaturing de formaldéhyde de 1X MOPS exécutant le tampon.Mélanger l’ARN en un à un avec le colorant de chargement de l’ARN et dénoaturer l’ARN par incubation à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Réfrigérer immédiatement les échantillons dénaturés sur la glace pendant une minute. À l’aide d’une pipette, charger les échantillons dans les puits du gel et de l’électrophorese à 100 volts pendant 50 minutes jusqu’à ce que l’ARN soit bien séparé.Rincer le gel en tampon de citrate de sodium salin 20X pour enlever le formaldéhyde. Effectuez le transfert capillaire pendant la nuit en installant 20X tampon de citrate de sodium salin, une couche de papier essuie-tout, deux couches de papier Whatman humide, une couche de gel, une couche de membrane de nylon, deux couches de papier Whatman humide, deux couches de papier Whatman sec, une plaque de verre et un poids. Le matin, l’ARN dans le gel est transféré à la membrane de nylon.Tremper la membrane dans le citrate de sodium salin 2X et fixer l’ARN à la membrane en exposant la membrane humide à la liaison croisée UV. Procéder selon le manuscrit. Les feuilles entièrement développées des plantes nicotiana bethamiana 16c de trois à quatre semaines ont été co-infiltrées dans des parcelles avec des mélanges Agrobacterium transportant 35S GFP.À quatre jours après l’infiltration, la fluorescence GFP de la zone infiltrée a été photographiée sous la lumière naturelle et la lumière UV à ondes longues. La tache nordique a indiqué que l’ARN messager de GFP s’est accumulé plus haut dans les feuilles exprimant 35S GFP plus 35S CMV2b ou 35S GFP plus 35S PSR1 que dans les feuilles exprimant 35S GFP plus EV. L’analyse d’agroinfiltration a été effectuée pour évaluer la propagation du signal de silence dans les feuilles des semis nicotiana bethamiana 16c de deux semaines. À 14 jours après infiltration, plus de 98% de l’EV n’a montré aucune signalisation évidente de GFP dans les feuilles systémiques.Considérant que cmv2b et PSR1 ont efficacement inhibé la propagation systémique du signal de silence. La fluorescence du GFP a été observée dans environ 80 % des plantes co-infiltrées et dans les 20 % restants des plantes infiltrées avec seulement quelques veines rouges apparues dans les feuilles nouvellement émergées. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour identifier de nouveaux suppresseurs de silencing d’ARN sécrés par beaucoup d’agents pathogènes végétaux.La combinaison des plantes et de l’OD approprié est la chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure. Après cette procédure, la caractérisation fonctionnelle du suppresseur de silence ARN peut être faite pour explorer le mécanisme de la façon dont ces suppresseurs appuient sur le silence de l’ARN hôte et quelle est la sortie. S’il vous plaît porter les lunettes de sécurité lorsque vous infiltrez les plantes et aussi porter les gants de latex pendant toutes les étapes de l’expérience.

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Description d'une induite par le virus gene silencing (VIGS) méthode pour le knock-down de l'expression génique dans...

Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

Source : Shi, J., et al. Dépistage et identification des suppresseurs de silencieux d’ARN à partir des effecteurs sécrétés de pathogènes des plantes. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre un essai de co-infiltration permettant d’identifier les protéines effectrices pathogènes qui suppriment le silence de l’ARN dans Nicotiana benthamiana 16c. Un reporter fluorescent et un gène effecteur candidat sont délivrés dans les feuilles des plantes via Agrobacterium. Normalement, le silence de l’ARN...

Essai de co-infiltration pour le dépistage des effecteurs pathogènes qui suppriment le silence de l’ARN végétal

Induite par le virus gene silencing est un outil utile pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte des plantes. Nous démontrons l'utilisation d'agents pathogènes bactériens exprimant GFPuv dans l'identification des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. Cette approche est simple, rapide et facilite le dépistage à grande échelle et un protocole similaire peut être appliquée à l'étude de divers autres interactions plantes-microorganismes.

VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte

Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer un siRNA ciblés écran "ubiquitome" pour identifier de nouveaux régulateurs de l'ubiquitine et ubiquitine de la réponse cellulaire médiée HIF1A à l'hypoxie. Ceci peut être adapté à n'importe quelle voie biologique où une lecture robuste de l'activité du rapporteur est disponible.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

La quantification de la croissance des agents pathogènes est un outil puissant pour caractériser diverses réponses immunitaires d’Arabidopsis thaliana (ci-après : Arabidopsis). La méthode décrite ici présente un test d’infiltration à la seringue optimisé pour quantifier le Pseudomonas syringae pv. maculicola Croissance d’ES4326 dans les feuilles adultes d’Arabidopsis.

Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l&#39;aide du<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystème

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Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

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Découvrez une méthode de criblage modifiée pour identifier rapidement les suppresseurs de silençage de l'ARN chez les agents pathogènes des plantes. Cette technique améliore l'efficacité et la précision des analyses de dépistage.

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